趙 茹,曾炳麟,潘顯道
中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所,北京 100050
含笑內(nèi)酯(micheliolide,MCL)是愈創(chuàng)木倍半萜內(nèi)酯類化合物。在木蘭科植物黃蘭的根皮[1]、臺灣含笑的根皮[2]中均有分布,也可以90%的收率從小白菊內(nèi)酯(parthenolide,PTL)半合成獲得[3,4]。
倍半萜內(nèi)酯(SL)是一個化學(xué)結(jié)構(gòu)家族,有5 000多個成員,其中許多被用于中藥治療炎癥,有研究表明SL的抗炎作用機(jī)制為抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB[5-7]。MCL為愈創(chuàng)木烷型倍半萜內(nèi)酯,已發(fā)現(xiàn)MCL可通過抑制NF-κB活性、激活丙酮酸激酶M2以及誘導(dǎo)線粒體相關(guān)蛋白(Drp)1表達(dá)體現(xiàn)抗炎以及抗腫瘤活性[8-12]。但MCL的水溶性差,被攝取后藥物血漿濃度太低,影響其體內(nèi)藥理作用。對MCL結(jié)構(gòu)中α-亞甲基-γ-丁內(nèi)酯和二甲胺進(jìn)行Michael加成,可得到水溶性高的二甲胺衍生物DMAMCL[12]。雖然DMAMCL的體外抗腫瘤活性下降,但是在中性HEPES溶液(pH7.4)和血漿中可持續(xù)轉(zhuǎn)化為MCL。DMAMCL成鹽后化合物ACT001相比MCL具有較高的口服生物利用度和血漿穩(wěn)定性。據(jù)報道,ACT001具有抗腦膠質(zhì)瘤、白血病效果,并具有顯著的抗炎免疫作用[13],目前已在澳洲完成腦膠質(zhì)瘤I期臨床研究,正在中國進(jìn)行腦膠質(zhì)瘤I期臨床研究(圖1)。
圖1 含笑內(nèi)酯(1)、小白菊內(nèi)酯(2)、DMAMCL(3)和ACT001(4)的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structures of micheliolide(1),parthenolide(2),DMAMCL(3),ACT001(4)
鑒于MCL和ACT001具有潛在的抗腫瘤作用及抗炎免疫作用,國內(nèi)外尚未見含笑內(nèi)酯結(jié)構(gòu)修飾及衍生物的生物活性研究進(jìn)展報道,本文綜述了近二十年含笑內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)修飾改造、衍生物的生物活性、構(gòu)效關(guān)系和作用機(jī)制等,旨在為含笑內(nèi)酯的進(jìn)一步研究提供有益的參考。
含笑內(nèi)酯具有潛在的抗炎生物活性[14],可用于治療腸炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種炎癥。Viennois等[8]研究發(fā)現(xiàn)DMAMCL可改善由右旋糖酐硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎,并對其作用機(jī)制進(jìn)行了研究。研究發(fā)現(xiàn)脂多糖(LPS)可誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL)-6和IL-1β的合成和分泌,降低LPS誘導(dǎo)的磷酸化[15],促使NF-κB復(fù)合物P65遷移到細(xì)胞核(易位率為93%)[16-18],抑制NF-κB依賴性熒光素酶表達(dá)。因此,可認(rèn)為MCL可通過抑制脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的NF-κB途徑及其隨后的抗炎途徑改善結(jié)腸炎。
Qin等[9]研究發(fā)現(xiàn)MCL可提高致死性敗血性休克小鼠的存活率,并研究了MCL在微生物感染和敗血癥中的作用機(jī)制。MCL抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7、原發(fā)性腹腔巨噬細(xì)胞和骨髓樹突狀細(xì)胞中炎癥細(xì)胞因子IL-6、TNF-α、MCP-1、IFN-β甚至抗炎細(xì)胞因子IL-10的產(chǎn)生[19,20],通過NF-κB和PI3K/AKT途徑抑制脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[21-25],保護(hù)小鼠免受脂多糖的攻擊。因此,可認(rèn)為MCL維持免疫平衡可能是治療敗血癥和敗血性休克的一種潛在的抗炎和免疫抑制藥物。
Zhao等[10]在進(jìn)行糖尿病腎病(DN)發(fā)病機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn),MCL可通過抑制晚期氧化蛋白產(chǎn)物(AOPPs)誘導(dǎo)的單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP-1)的表達(dá),進(jìn)而抑制NF-κB復(fù)合物P65的磷酸化和IκB的降解,來實現(xiàn)抗炎過程。
含笑內(nèi)酯具有多種抗腫瘤活性[12,26,27],對乳腺癌、結(jié)腸癌等均可發(fā)揮抗癌作用,同時不損害正常細(xì)胞,但含笑內(nèi)酯的抗腫瘤作用機(jī)制仍不明確。
有報道稱含笑內(nèi)酯可通過激活丙酮酸激酶M2來抑制腫瘤細(xì)胞。丙酮酸激酶M2(pkm2)是丙酮酸激酶的低活性亞型,在腫瘤發(fā)生中起著關(guān)鍵作用[28-30]。Li等[11]發(fā)現(xiàn)含笑內(nèi)酯可通過殘基半胱氨酸424(C424)處的共價結(jié)合選擇性地激活pkm2(C424不包含在pkm1中)。這種相互作用促進(jìn)了更多pkm2四聚體的形成,抑制了賴氨酸433(K433)的乙酰化,并影響了pkm2向細(xì)胞核的易位,因此抑制了白血病細(xì)胞的增殖。
Jia等[31]發(fā)現(xiàn)MCL可通過誘導(dǎo)線粒體相關(guān)蛋白(Drp)1表達(dá)進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞增殖。Drp1是線粒體分裂的主要作用分子,誘導(dǎo)Drp1表達(dá)可促進(jìn)線粒體分裂,提高乳腺癌細(xì)胞ROS 水平,耗散線粒體膜電位,促進(jìn)細(xì)胞色素C釋放,裂解凋亡蛋白DNA修復(fù)酶(PARP),進(jìn)而誘發(fā)乳腺癌細(xì)胞凋亡。因此,可劑量依賴性抑制MCF-7及MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞增殖[32-34]。
2014年Ma等[35]合成了一系列C-4位羥基醚化或酯化的含笑內(nèi)酯衍生物(圖2)。C-4位羥基醚化或酯化衍生物對人早幼粒白血病細(xì)胞株HL-60的半數(shù)抑制濃度(IC50)在2.8~18.0 μM之間和對阿霉素耐藥細(xì)胞系HL-60/A的IC50在4.2~29.7 μM之間。表明對C-4位羥基進(jìn)行醚化或?;杀3挚笰ML細(xì)胞活性;引入共軛?;?即化合物8~10)提供額外的Michael受體后,化合物仍具有抗AML細(xì)胞活性,但隨著共軛?;蛔璧脑黾?,對HL-60及HL-60/A的活性降低。因此, C-4位羥基可用于設(shè)計和合成合適的分子探針,進(jìn)一步探索MCL可選擇性抑制AML細(xì)胞的作用機(jī)制。
圖2 化合物5~12的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.2 The chemical structures of compounds 5-12
表1 衍生物5~13對HL-60和HL-60/A的抑制作用
續(xù)表1(Continued Tab.1)
化合物CompoundsR半數(shù)抑制濃度IC50 (μM)人早幼粒急性白血病細(xì)胞系 Human promyelocytic acute leukemia cell lineHL-60對阿霉素耐藥細(xì)胞系A(chǔ)driamycin-resistant cell lineHL-60/A53.5 ± 0.66.2 ± 0.469.9 ± 0.910.2 ± 0.1716.7 ± 0.818.9 ± 4.687.4 ± 1.68.5 ± 1.8912.6 ± 0.211.7 ± 2.21015.1 ± 1.914.7 ± 1.9112.8 ± 0.94.2 ± 0.2127.2 ± 2.715.7 ± 3.0
2012年Zhang等[12]發(fā)現(xiàn)C-10位修飾后的化合物13~15對HL-60的IC50在9.4~21.9 μM之間,對HL-60/A的IC50在9.9~17.9 μM之間,對HL-60及HL-60/A的細(xì)胞的抑制效率低于MCL。同時對人AML干細(xì)胞和祖細(xì)胞生長抑制作用也較弱,遠(yuǎn)低于MCL。如10-α-甲氧基含笑內(nèi)酯13,濃度為10μM時,有76.3%的活A(yù)ML細(xì)胞,2016年Chen等[36]發(fā)現(xiàn)C1-C10環(huán)氧衍生物16,濃度為10 μM時,有48%的活A(yù)ML細(xì)胞。表明對C-10位引入甲氧基、羥基、C1-C10環(huán)氧基團(tuán)及C10-C14位雙鍵后抗腫瘤活性均有下降,C1-C10位的雙鍵或有重要作用。
圖3 化合物13~16的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.3 The chemical structures of compounds 13-16
圖4 化合物13~15對對HL-60和HL-60/A的抑制活性Fig.4 Inhibitory activity of compound 13-15 against HL60 and HL60/A cell lines
化合物Compound癌細(xì)胞生存能力Cancer cell viability5 μM10 μMDOX115.049.1PTL13.24.7MCL4.22.31395.876.31453.722.61584.984.816-48.0
2.3.1 C-13位芳基化衍生物
Ding等[37]利用Heck反應(yīng)合成了一系列α-亞甲基-γ-丁內(nèi)酯部分芳基化的含笑內(nèi)酯衍生物。相比含笑內(nèi)酯,衍生物抗HL-60活性均有大幅下降,但其中17~22對HL-60/A(IC50在6.2~19 μM之間)有較強(qiáng)的抑制作用。因此,可知C13位上具有適當(dāng)取代基的衍生物可以選擇性地抑制HL-60/A;TES掩蔽C4-OH的效果隨C11-C13烯烴的幾何結(jié)構(gòu)的變化而變化,用TES掩蔽C4-OH可降低其對E異構(gòu)體的HL-60/A活性。然而,對于Z異構(gòu)體,用TES基團(tuán)掩蔽C4-OH后提高了對HL-60/A的活性。
圖5 衍生物17~28的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.5 The chemical structures of compounds 17-28
表3 化合物17~28對不同AML細(xì)胞株的抑制作用
2.3.2 C-13位加成衍生物
2012年Zhang等[12]等報道含笑內(nèi)酯的α-亞甲基-γ-丁內(nèi)酯Michael加成產(chǎn)物DMAMCL(3)對HL-60(IC50= 17.2±1.1 μM)和HL-60/A(IC50= 21.5±2.0 μM)的抑制作用相比MCL有所降低。但是初步藥代動力學(xué)(PK)研究表明,其在中性HEPES溶液(pH7.4)和血漿中,可持續(xù)轉(zhuǎn)化為活性藥物MCL,具有較高的口服生物利用度[13]。
Zhang等得到的C-13位亞甲基還原衍生物29以及本課題組合成的C-13位5-取代尿嘧啶Michael加成產(chǎn)物30~32,對HL-60和HL-60/A的IC50值均大于50,表明C11-13位雙鍵對于抗腫瘤活性非常關(guān)鍵。
2019年Fasan等[38]報道了基于P450酶的C-H鍵官能團(tuán)化,使含笑內(nèi)酯C-2位及C-14位羥基化,合成了兩個結(jié)構(gòu)新穎的先導(dǎo)化合物33和34。以二者為原料,進(jìn)行了?;蛎鸦幚恚玫搅艘幌盗行碌暮?nèi)酯衍生物。體外抗腫瘤活性顯示,在20 μM的MCL作用下白血病細(xì)胞(M9-ENM1)存活率為30%,在20 μM的酯化產(chǎn)物35~38作用下細(xì)胞存活率僅在2%~7%,但醚化產(chǎn)物39和40處理后的M9-ENM1存活率為87%與85%。該研究組同時對AML細(xì)胞系的AML01、AML02、AML03、AML04進(jìn)行了抗腫瘤活性研究,其中35~38對AML01細(xì)胞LD50為2.5~9.0 μM,相比于MCL活性有顯著提高。表明C-2位及C-14位引入酯基后部分化合物活性顯著提高,但引入醚鍵后部分化合物活性下降。
圖6 衍生物29~32的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.6 The chemical structures of compounds 29-32
圖7 衍生物33~40的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.7 The chemical structures of compounds 33-40
圖8 化合物35~38對不同AML細(xì)胞株的抑制作用Fig.8 Biological activity of compound 35-38 on different AML cell lines
該研究組進(jìn)一步進(jìn)行衍生物拓展,在C-2位和C-14位引入疊氮基團(tuán)和氨基,得到先導(dǎo)物41~44。在其基礎(chǔ)上引入酰胺類衍生物45和46及1,2,3-三氮唑類衍生物47和48。20 μM的化合物41~44處理后M9-ENM1細(xì)胞存活率為96%~99%,較MCL有顯著下降。20 μM的化合物42~45處理后M9-ENM1細(xì)胞存活率為4%~21%,顯示化合物42~45對M9-ENM1細(xì)胞的LD50值為2.7~7 μM,遠(yuǎn)低于MCL(LD50= 14.6 μM)。這些研究表明氨基及疊氮基團(tuán)對抗腫瘤活性沒有提高作用,但酰胺及三氮唑衍生物活性較好。
圖9 衍生物41~48的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.9 The chemical structures of compounds 41-48
本課題組研究發(fā)現(xiàn)[39],含笑內(nèi)酯經(jīng)二氧化硒氧化可將C-9位羥基化,得到新穎的先導(dǎo)化合物49,并以其作為先導(dǎo)物合成了酯類衍生物50~55。相比于MCL,C-9位酯衍生物對人慢性髓系白血病細(xì)胞株K562及HL-60細(xì)胞生長抑制作用明顯提升。
注:HCT116:人結(jié)腸癌細(xì)胞株;NCI-H1650:人肺癌細(xì)胞株;MGC803:人胃癌細(xì)胞株;HL-60:人早幼粒白血病細(xì)胞株;K562:人慢性髓系白血病細(xì)胞株;K562/A02:人慢性髓系白血病耐阿霉素細(xì)胞株;U-87 MG:人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株。
Note:HCT116:Human colon cancer cell line;NCI-H1650:Human lung cancer cell line;MGC803:Human gastric cancer cell line;HL-60:Human promyelocytic leukemia cell line;K562:Human chronic myeloid leukemia cell line;K562/A02:Adriamycin-resistant human chronic myeloid leukemia cell line;U-87 MG:Human glioblastoma cell line.
對C-9位羥基化合物49進(jìn)一步氧化得到C-9位羰基化合物56?;衔?6對U-87 MG、HCT116、NCI-H1650、MGC803、HL-60、K562、K562/A02等細(xì)胞系的生長抑制作用均顯著優(yōu)于MCL。其體內(nèi)抗小鼠肝癌H22活性研究顯示其抑制率和5-Fu接近。體內(nèi)對異位移植腦膠質(zhì)瘤作用的實驗結(jié)果顯示,口服化合物56(40.0 mg/kg)具有顯著的抗腫瘤活性,抑制率和目前治療腦膠質(zhì)瘤最佳藥物替莫唑胺(TMZ)相近,優(yōu)于ACT001,并對荷瘤小鼠的血液系統(tǒng)無影響。對小鼠原位膠質(zhì)瘤G422抑制作用的實驗結(jié)果顯示,在30.0 mg/kg給藥劑量下腫瘤抑制率達(dá)到89%,和TMZ相當(dāng)。表明在C-9位引入羰基可顯著提高化合物活性。
表5 化合物57~60體內(nèi)抗腫瘤活性
注:LymphoSarcoma of Pliss:抗魯比霉素、普樂慶和白藜蘆堿的淋巴肉瘤; Carcinosarcoma of worker:癌肉瘤; Carcinoma of Geren:癌肉瘤; Sarcoma-45:對肌溶素耐藥的癌肉瘤; Alveolar cancer of liver PC-1:肝癌細(xì)胞。
哈薩克斯坦的抗腫瘤上市藥物阿格拉賓與含笑內(nèi)酯同為具有5,7,5-環(huán)結(jié)構(gòu)的愈創(chuàng)木烷型倍半萜內(nèi)酯,結(jié)構(gòu)上有很大的相似性。
1999年Adekenov[40]發(fā)表專利中介紹了團(tuán)隊分離得到的天然產(chǎn)物阿格拉賓(Arglabin,57)及其合成的部分衍生物,并進(jìn)行了體外及體內(nèi)抗腫瘤研究。體外抗腫瘤活性顯示12 μg/mL Arglabin對骨髓瘤細(xì)胞(X-653) 和人類二氫白血病(K-562)抑制率為75%,25 μg/mL Arglabin對小鼠肥大細(xì)胞瘤(P-815)抑制率為75%。體內(nèi)抗腫瘤活性顯示,此類化合物對多種腫瘤均有較好的抑制作用(表5)。引入鹵素以及在C3-C4位環(huán)氧化均可增加抗腫瘤活性,其中 Arglabin二甲氨基鹽酸鹽(58)對多種腫瘤均有較好治療效果。此類化合物毒性小,副作用比一般使用其他化療藥物的副作用要小。
圖11 衍生物57~60的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.11 The chemical structures of compounds 57-60
圖12 含笑內(nèi)酯抗腫瘤構(gòu)效關(guān)系圖Fig.12 Structure-activity relationship of MCL against tumors注:A區(qū)域:雙鍵打開影響抗癌活性,C-2位酯化、C-14位酯化以及C1-C10環(huán)氧化保持較高活性;B區(qū)域:C-4位醚化或羥基消除保有較好活性,芳基取代后活性下降;C區(qū)域:C-9位引入羥基或酯基后活性提高,引入羰基后活性提高;D區(qū)域:雙鍵對抗腫瘤活性極其重要,取代后活性下降,雙鍵還原后活性消失,加成后活性消失(與二甲胺加成除外)。Note:A region:Opening double bonds can affect anticancer activity.C-2 esterification,C-14 esterification and C1-C10 epoxidation can maintain high activity;B region:C-4 etherification or hydroxyl elimination maintained good activity,when substituted by aryl group,the activity decreases.;C region:The activity of C-9 site is increased by introducing hydroxyl,ester group or carbonyl group;D region:Double bond is very important for anti-tumor activity.The activity decreases after substitution,the activity disappears after reduction,and the activity disappears after addition(except with dimethylamine addition).
含笑內(nèi)酯是一種三環(huán)結(jié)構(gòu)的倍半萜內(nèi)酯,研究顯示其具有多種重要的藥理活性,但由于體內(nèi)較低的血漿穩(wěn)定性使其臨床應(yīng)用受到了很大的限制。此外,含笑內(nèi)酯的作用靶點至今尚未研究清楚,這也對其合理結(jié)構(gòu)修飾和成藥性研究產(chǎn)生了困擾。目前,將非環(huán)狀低級仲烷胺通過Michael加成反應(yīng)連接到含笑內(nèi)酯的 C13位得到其加合物水溶性鹽,是一種有效提高生物利用度、增加血藥濃度的方法。此外,在C-4位引入酯基可保持MCL活性,可將其作為設(shè)計合成分子探針位置,探究MCL作用機(jī)制;C-2,14,9位引入羥基后成酯,抗腫瘤活性均有提高。所以可在保持α-亞甲基-γ-丁內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上,引入雜原子或可提高M(jìn)CL的抗腫瘤活性。對含笑內(nèi)酯及其衍生物作用機(jī)制和靶點的深入研究,將更加有利于含笑內(nèi)酯的合理修飾和改造。