黨參藥材活性成分黨參炔苷的化學(xué)穩(wěn)定性研究

廖江敏，李林玉，瞿云安，楊雪峰，楊軍宣*

1重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 400016；2成都晶富醫(yī)藥科技有限公司，成都 610041

黨參屬于我國傳統(tǒng)補(bǔ)益中藥，其味甘、性平、歸脾、肺經(jīng)，具有補(bǔ)中益氣、健脾益肺的功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，黨參能夠調(diào)節(jié)血糖、提高造血機(jī)能、抗疲勞、抗應(yīng)激、抗缺氧、抗衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、保護(hù)胃腸道黏膜、調(diào)節(jié)胃收縮功能、抗?jié)兊萚1]。黨參的主要成分有糖類、苷類、萜類、生物堿類及聚炔類等，其主要活性成分黨參炔苷屬于聚乙炔類化合物，由于含有共軛三鍵，因而具有不飽和性和活潑性,易發(fā)生加成、氧化等反應(yīng)，但黨參炔苷又帶有醇官能團(tuán)，使其三鍵變得相對穩(wěn)定[2,3]。2015年版中國藥典中收載黨參來源為桔?？浦参稂h參Codonopsispilosula(Franch.) Nannf.、素花黨參C.pilosulaNannf.var.modesta(Nannf.) L.T.Shen 或川黨參C.tangshenOliv.的干燥根，藥材質(zhì)量控制僅收載了薄層色譜的定性鑒別方法，尚未收載黨參炔苷等活性成分的定量檢測方法[4]。而目前亦缺乏黨參炔苷穩(wěn)定性的深入研究。本研究采用HPLC方法，測定黨參炔苷對照品及黨參提取液經(jīng)不同條件(溫度、受熱時間、光照強(qiáng)度、pH)處理后的黨參炔苷含量變化，考察各種因素對黨參炔苷化學(xué)穩(wěn)定性的影響，為藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究、藥材炮制加工及中成藥生產(chǎn)等提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

Agilent-1200型高效液相色譜儀(安捷倫公司)；LS-220A電子天平(瑞士Precisa公司)，ES225SM-DR雙量稱天平(瑞士Precisa公司)；Q/BKYY31-2000電熱恒溫水浴鍋(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)；ULUP-IV-20T優(yōu)普系列超純水機(jī)(四川優(yōu)普超純科技有限公司)；KQ5200DA型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

黨參炔苷(購于四川省維克奇生物科技有限公司，批號為wkq18072501，純度為HPLC≥98%)；黨參藥材自采于重慶市巫山縣，經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院何先元教授鑒定為《中國藥典》2015年版一部川黨參CodonopsistangshenOliv.的干燥根；乙腈和甲醇為色譜純，水為雙蒸水。

1.2 黨參炔苷HPLC測定方法建立

采用HPLC方法測定黨參炔苷含量[5]，并參考文獻(xiàn)進(jìn)行了方法學(xué)考察[4,6]。

1.2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性

色譜柱為SinoChrom ODS-BP C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈-水(25∶75)；流速為1.0 mL/min；檢測波長為267 nm；進(jìn)樣體積為10 μL；柱溫為30 ℃；按黨參炔苷峰計(jì)算理論塔板數(shù)應(yīng)不低于2 000。

1.2.2 方法學(xué)考察

1.2.2.1 對照品溶液的制備

精確稱取黨參炔苷對照品5.08 mg，置于100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，即得對照品溶液。

1.2.2.2 供試品溶液的制備

取黨參藥材適量，稱定重量，加入8倍量水，煎煮2次，每次1小時，合并煎液，濃縮至1∶1(g/mL)，放冷，加入乙醇至含醇量為50%，靜置過夜，過濾，濾液回收乙醇，濃縮至1∶1(g/mL)，即得樣品溶液。精確量取樣品溶液2 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

圖1 對照品溶液(A)、供試品溶液(B)及陰性對照(C)的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of standard solution(A),sample solution(B) and blank control(C)

1.2.2.3 專屬性考察

取黨參炔苷對照品溶液、黨參藥材提取液制備的供試品溶液及空白溶劑按“1.2.1”色譜條件進(jìn)樣檢測，結(jié)果見圖1，表明陰性無干擾。

1.2.2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取對照品溶液2、4、8、10、15、20 μL進(jìn)樣，每個體積分別重復(fù)進(jìn)樣3次，以進(jìn)樣量(μg)為X軸，峰面積值A(chǔ)為Y軸來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到回歸方程為Y=539 847X+ 8 090.8，r=0.9993，表明黨參炔苷進(jìn)樣量在0.101 6～1.016 0 μg范圍時，進(jìn)樣量與峰面積值有良好的線性關(guān)系。

1.2.2.5 精密度試驗(yàn)

取同一份黨參炔苷對照品溶液，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算RSD值為0.43%，表明儀器精密度良好。

1.2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按“1.2.2.2”方法制備供試品溶液，室溫下放置，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、6、8、24 h進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計(jì)算RSD值為0.62%。

1.2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

按“1.2.2.2”方法平行制備6份供試品溶液，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定含量，計(jì)算RSD值為0.89%。

1.2.2.8 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

采用加樣回收法，精確量取““1.2.2.2””項(xiàng)下提取濃縮后的樣品溶液1 mL，共9份，分成3組，每組3份，分別加入0.8、1.0、1.2倍的黨參炔苷對照品，制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，計(jì)算黨參炔苷含量，按下式計(jì)算加樣回收率，結(jié)果平均加樣回收率為100.04%，RSD=1.26%。

1.3 黨參炔苷的穩(wěn)定性考察

1.3.1 溫度的影響

精密稱取適量黨參炔苷對照品，置25 mL容量瓶中，加塞密閉，共5份；另取黨參藥材提取樣品溶液2 mL，置25 mL容量瓶中，加塞密閉，共5份。取供試品分別置50、60、70、80、90 ℃的恒溫水浴鍋中，加熱5 h，放冷后，分別加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得黨參炔苷單體的供試液及黨參藥材提取制備的供試液。按“1.2.1”色譜條件測定，按下式計(jì)算黨參炔苷的相對含量(RC)，考察黨參炔苷隨溫度的變化情況。

RC=(Ci/C0)×100%

式中Ci：每一檢測點(diǎn)樣品測定的含量，μg/mL；C0：每一樣品的初始含量，μg/mL。

1.3.2 受熱時間的影響

同“1.3.1”方法，分別取黨參炔苷對照品及黨參藥材提取液樣品適量，按“1.3.1”篩選所得的敏感溫度條件下分別加熱1、2、3、4、5 h，制備供試液后，按“1.2.1”色譜條件測定，計(jì)算相對含量(RC)，考察黨參炔苷隨加熱時間的變化情況。

1.3.3 光照的影響

同“1.3.1”方法，分別取黨參炔苷對照品及黨參藥材提取液樣品適量，分別在避光條件下及強(qiáng)光照(80 Klx)條件下放置12、24、36、48、72 h，分別制備供試液。按“1.2.1”色譜條件測定，計(jì)算相對含量(RC)，考察黨參炔苷隨光照的變化情況。

1.3.4 pH值的影響

同“1.3.1”方法，分別取黨參炔苷對照品及黨參藥材提取液樣品適量，分別用pH值為2、7、10、12的PBS液溶解并稀釋至刻度，于60 ℃水浴6 h，放冷，補(bǔ)足減失的溶劑，得到供試液。按“1.2.1”色譜條件測定，計(jì)算相對含量(RC)，考察黨參炔苷隨pH值的變化情況。

2 結(jié)果

2.1 溫度的影響

按“1.3.1”進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并檢測，結(jié)果見圖2。

圖2 黨參炔苷含量隨溫度變化圖Fig.2 Diagram of lobetyolin content changing with temperature注：S:Standard solution；E:Extracting solution，下同。

結(jié)果表明，黨參炔苷在60 ℃的溫度下加熱5 h含量無明顯變化；超過60 ℃加熱時含量發(fā)生明顯變化，70 ℃加熱5 h后，含量下降約26%，80 ℃加熱5 h，含量下降約49%，90 ℃加熱5 h，含量下降約75%，溫度對黨參炔苷含量有顯著影響(P<0.05)。黨參藥材提取液90 ℃加熱5 h，黨參炔苷含量下降約59%，變化不如對照品單體明顯。

2.2 受熱時間的影響

按“1.3.2”進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并檢測，結(jié)果見圖3。

圖3 黨參炔苷含量隨受熱時間變化圖Fig.3 Diagram of lobetyolin content changing with heating time

結(jié)果表明，隨加熱時間的增加，黨參炔苷單體及黨參藥材提取液中的含量呈持續(xù)降低趨勢，相同條件下黨參藥材提取液中黨參炔苷含量的變化不如對照品單體明顯。

2.3 光照的影響

按“1.3.3”進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并檢測，結(jié)果見圖4。

圖4 黨參炔苷含量隨光照時間變化圖Fig.4 Diagram of lobetyolin content changing with irradiation time

結(jié)果表明，光照對黨參炔苷含量有顯著影響(P<0.05)。避光條件下，黨參炔苷單體及黨參藥材提取液含量3天內(nèi)無明顯改變；80 KLx照射3天，黨參炔苷對照品含量降低約60%，黨參藥材提取液中黨參炔苷含量降低約50%。

2.4 pH值的影響

按“1.3.4”進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并檢測，結(jié)果見圖5。

圖5 黨參炔苷含量隨pH值變化圖Fig.5 Diagram of lobetyolin content changing with pH

結(jié)果表明，黨參炔苷在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的不同酸堿度溶液中穩(wěn)定性良好，但pH>12時，含量有逐漸降低趨勢。

3 討論與結(jié)論

黨參作為傳統(tǒng)補(bǔ)益中藥，應(yīng)用廣泛。本研究表明，黨參藥材的主要活性成分黨參炔苷無論是單體溶液還是在提取液中，對溫度及光照均較敏感，60 ℃以下黨參炔苷穩(wěn)定性良好，超過60 ℃條件下含量隨溫度的升高及受熱時間的延長而顯著降低(P<0.05)，提示在黨參藥材加工處理、飲片炮制及中成藥生產(chǎn)等過程中溫度應(yīng)控制在60 ℃以下，且不宜長時間受熱處理；同時，光照對黨參炔苷含量有顯著影響(P<0.05)，避光條件下利于黨參活性成分的保存；此外，黨參炔苷在不同酸堿度溶液中的穩(wěn)定性良好，但pH值偏高(≥12)時，含量逐漸降低。

通過對比研究發(fā)現(xiàn)，上述相同條件下黨參藥材提取液中黨參炔苷含量的變化不如對照品單體明顯，表明黨參藥材中的某些成分可以提高黨參炔苷的穩(wěn)定性，其保護(hù)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)在相同處理?xiàng)l件下，黨參炔苷溶液狀態(tài)及固態(tài)的含量變化不一致，具體變化規(guī)律及其機(jī)制有待進(jìn)一步研究；不同光照強(qiáng)度的不同照射時間及不同pH條件下更長處理時間對黨參炔苷穩(wěn)定性的影響有待進(jìn)一步研究；同時，上述條件下黨參炔苷的反應(yīng)動力學(xué)亟待進(jìn)一步深入研究，以便考察其半衰期并預(yù)測有效期，為藥材質(zhì)量控制提供參考和依據(jù)。