小鼠營養(yǎng)性肥胖對其生殖器官中mPRα、mPRβ、mPRγ基因表達的影響

鄧凱偉，張亦云

（信陽農(nóng)林學院，河南信陽 464000）

肥胖是體脂過量蓄積所致的臨床綜合征，在細胞水平的解釋是脂肪細胞數(shù)目的增加和體積的增大（陳粉粉等，2012）。肥胖嚴重威脅著動物的健康，其發(fā)病率在我國畜牧業(yè)有逐年漲高的趨勢（Yuling 等，2014）。 王辰等（2015）研究表明，肥胖可通過影響卵巢孕激素受體mPRα發(fā)育變化，引起小鼠假發(fā)情、產(chǎn)仔數(shù)減少和流產(chǎn)等繁殖障礙。但目前國內(nèi)外對肥胖可能導致動物的生殖器官子宮、卵巢、輸卵管以及孕酮膜受體mPRα、mPRβ、mPRγ表達這方面的研究相對較少，試驗通過構(gòu)建小鼠的營養(yǎng)性肥胖模型，測定小鼠生殖器官卵巢、子宮、輸卵管重量的變化，采用RT-PCR技術(shù)對小鼠子宮、卵巢和輸卵管中孕酮膜受體mPRα、mPRβ、mPRγ的基因表達量進行分析，從而探究營養(yǎng)性肥胖對小鼠生殖器官及孕酮膜受體基因表達的影響，為研究肥胖通過調(diào)控小鼠生殖器官體重對生殖性能的影響機制進行初步的探索。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料 高脂飼料和普通飼料均購自江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責任公司。高脂飼料和普通飼料的飼料配方見表1。

表1 小鼠飼料配方g/100g

1.2 試驗主要試劑 RNA提取液 （批號為G3013）， 購自 Servicebio； 異丙醇 （批號為80109218）、無水乙醇（貨號為 10009218），均購自國藥集團化學試劑有限公司；礦物油、TritonX-100（T8200），均購自美國 SIGMA公司；胎牛血清（批號為18070301），購自浙江天杭生物技術(shù)股份有限公司。

1.3 試驗主要儀器 電子天平 （型號為AN 1321），購自上海民橋精密科學儀器有限公司；潔凈工作臺（型號為SW-CJ-1D），購自廣州瑞智凈化設(shè)備有限公司；CO2細胞培養(yǎng)箱 （型號為HH·CPT01A），購自上海一恒科技有限公司；臺式高速冷凍型微量離心機 （型號為D3024R），購自DragonLab；離心管、TIP 頭，均購自 Axygen Biosciences。

1.4 試驗動物分組與飼養(yǎng) 選擇4～5周齡、體重13～15 g昆明白雄性小鼠20只，雌性小鼠40只（購自信陽職業(yè)技術(shù)學院），飼養(yǎng)在室溫22～25℃，濕度50%～70%的房間，自由飲水。將雌鼠先用普通飼料飼養(yǎng)1周適應后，隨機選出20只，繼續(xù)喂養(yǎng)普通飼料，設(shè)為對照組。剩余20只開始飼喂高脂飼料，設(shè)為高脂組。每周定期對小鼠進行一次空腹體重測量。

1.5 子宮、卵巢、輸卵管的收集 飼養(yǎng)8周，小鼠營養(yǎng)性肥胖模型建立后，將雌鼠和雄鼠一對一合籠自由配種，受精三天后，以頸椎脫臼法處死雌鼠，分別取出子宮、輸卵管和卵巢，裝入離心管中，放在-80℃的干冰中保存。

1.6 定量PCR分析卵巢、子宮、輸卵管中mPRα、mPRβ和mPRγ的基因表達量

1.6.1 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank上登錄的小鼠mPRα、mPRβ、mPRγ基因序列， 應用 Oligo7.0和Primer6軟件設(shè)計引物，引物由武漢塞維爾生物科技有限公司合成。引物相關(guān)信息見表2。

表2 PCR引物序列設(shè)計

1.6.2 總RNA抽提 采用TRIZOL Reagent試劑盒提取總RNA。

1.6.3 反轉(zhuǎn)錄 取2μg總RNA放置于PCR管中，加入1μL Oligo（dT），加去離子水直至12μL。 放于PCR儀上65℃保溫5 min，快速置于冰上冷卻。然后依次加入4μL 5×Reaction Buffer，2μL 10 mM dNTP Mix，1 μL RiboLock RNAase抑制劑和1μL RevertAi M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶，用移液槍充分混勻。放于PCR儀上42℃保溫60 min，最后在70℃水浴中保溫5 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。

1.6.4 定量PCR 取0.2 mL PCR管，配制如表3，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物每個配制3管。PCR擴增過程如表4。

表3 反應體系所需反應物及體積 μL

表4 PCR擴增過程

1.6.5 結(jié)果處理 ΔΔCT法：

A=CT（目的基因，待測樣本)-CT（內(nèi)標基因，待測樣本）；

B=CT（目的基因，對照樣本)-CT（內(nèi)標基因，對照樣本）；

K=A-B；

表達倍數(shù)=2-K。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 采用SPSS 21.0軟件對試驗所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，結(jié)果用 “平均值±標準差”表示。采用t檢驗進行差異顯著分析，以P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著，即有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠肥胖模型建立結(jié)果 由表5可知，小鼠喂養(yǎng)6周后，高脂組小鼠平均體重與對照組相比顯著提高 （P＜0.05），8周后，極顯著提高 （P＜0.01），說明小鼠營養(yǎng)性肥胖模型建模成功。

表5 小鼠體重記錄表g

2.2 小鼠子宮、卵巢體重測定 如表6所示，通過連續(xù)8周飼喂高脂飼料后，高脂組小鼠子宮和卵巢體重與對照組相比顯著提高（P＜0.05）。

表6 小鼠子宮、卵巢體重g

2.3 mPRα、mPRβ、mPRγ在子宮、輸卵管和卵巢的表達

2.3.1 mPRα在卵巢、子宮、輸卵管的基因表達量由圖1可知，高脂組小鼠卵巢中mPRα的表達量與對照組相比差異不顯著（P＞0.05）；高脂組小鼠子宮和輸卵管中mPRα表達量與對照組相比顯著降低（P ＜ 0.05）。

2.3.2 mPRβ在卵巢、子宮、輸卵管的基因表達量由圖2可知，在卵巢、子宮和輸卵管中，對照組與肥胖高脂組小鼠相比，mPRβ的基因表達量均差異不顯著（P ＞ 0.05）。

2.3.3 mPRγ在卵巢、子宮、輸卵管的基因表達量由圖3可知，在卵巢和輸卵管中，對照組與高脂組相比mPRγ的基因表達量有顯著差異（P＜0.05）；在子宮中，對照組和高脂組中mPRγ的基因表達量差異不顯著（P＞0.05）。

3 討論

崔立坤（2011）研究表明，肥胖對生殖系統(tǒng)有嚴重威脅。在畜牧生產(chǎn)中，肥胖通過影響生殖器官變化而對生殖性能產(chǎn)生一定影響。近年來，通過建立小鼠肥胖模型來探究肥胖對小鼠生殖機能的影響也逐漸成為研究的熱點。本試驗通過連續(xù)8周飼喂高脂飼料后，與普通對照小鼠相比體重差異極顯著 （P＜0.01），小鼠營養(yǎng)性肥胖模型建模成功，進行營養(yǎng)性肥胖對小鼠生殖器官及孕酮膜受體基因表達的影響研究。

孕酮膜受體的表達、分布及功能在魚類及兩棲類中研究較為深入（楊梅等，2010）。在哺乳動物生殖系統(tǒng)表達、分布及功能研究較少。孕酮膜受體mPRα、mPRβ和mPRγ，具有參與孕激素快速調(diào)節(jié)的作用（林翠英等，2018）。mPRα是最早被發(fā)現(xiàn)且研究最為深入的孕酮膜受體。mPRα主要表達在生殖器官，包括卵巢和睪丸。mPRα在調(diào)節(jié)卵母細胞減數(shù)分裂成熟過程起重要作用，其能快速誘導卵母細胞減數(shù)分裂，抑制顆粒細胞調(diào)亡。Hagiwara等 （2016)研究發(fā)現(xiàn)，卵巢和排卵前濾泡mPRα和mPRγ的轉(zhuǎn)錄始終保持相對穩(wěn)定水平。正常受孕以后 ，體內(nèi)孕激素分泌持續(xù)增加，通過與子宮內(nèi)膜發(fā)生特異性結(jié)合，發(fā)揮特異性的生理效應，導致子宮內(nèi)膜發(fā)生生殖障礙 （姚若進，2011）。本試驗中，通過對小鼠生殖系統(tǒng)mPRα、mPRβ 和 mPRγ 表達的研究，mPRα、mPRβ 和mPRγ在高脂組和普通組小鼠子宮、卵巢和輸卵管中均有表達。高脂小鼠的子宮和輸卵管中mPRα基因表達量顯著低于對照組小鼠 （P＜0.05）；高脂組小鼠巢中mPRα表達和對照組差異不顯著（P＞0.05）。高脂組子宮、卵巢和輸卵管中mPRβ表達量與普通對照組相比差異不顯著（P＞0.05）。高脂組卵巢和輸卵管中mPRγ表達量顯著低于對照組（P＜0.05），高脂組小鼠子宮中mPRγ表達量和對照組相比差異不顯著（P＞0.05）。

mPRα、mPRβ和mPRγ這三個基因表達量在子宮、卵巢和輸卵管中均是對照組高于肥胖高脂組。結(jié)合在試驗中，小鼠營養(yǎng)性肥胖模型構(gòu)建后，小鼠生殖器官如子宮、卵巢、輸卵管體重和對照普通組相比增加，并且達到差異顯著水平 （P＜0.05）。生殖器官體重變化和孕酮膜受體基因表達結(jié)果顯示，在小鼠生殖系統(tǒng)中，營養(yǎng)性肥胖通過對小鼠生殖器官重量的改變，從而導致小鼠生殖性能下降以及降低孕酮膜受體在子宮、卵巢和輸卵管中的基因表達量。

4 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，營養(yǎng)性肥胖通過對小鼠生殖器官的影響可降低孕酮膜受體基因的表達，但肥胖對小鼠卵母細胞以及胚胎細胞的影響機制還有待進一步研究。