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    過氧化氫氧化二硫鍵對(duì)大豆11S蛋白表面活性的影響

    2020-05-16 02:51:30李蔭展李軍生王靖婷李風(fēng)光閻柳娟黃國(guó)霞
    中國(guó)飼料 2020年5期
    關(guān)鍵詞:二硫鍵表面活性亞基

    李蔭展, 李軍生, 王靖婷, 李風(fēng)光, 閻柳娟, 黃國(guó)霞

    (1.廣西科技大學(xué)廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西柳州 545006;2.廣西高通食品科技有限責(zé)任公司,廣西柳州 545100)

    大豆蛋白作為一種大宗的植物蛋白,具有潛在的乳化性和起泡性等表面活性性能。經(jīng)過分離提純之后的大豆分離蛋白經(jīng)常被用在食品工業(yè)中。大豆分離蛋白是球蛋白,疏水性基團(tuán)包埋在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部,從而限制了大豆分離蛋白質(zhì)的表面活性性能。因此采用綠色的化學(xué)方式對(duì)大豆分離蛋白進(jìn)行改性處理,提高其表面活性性能,從而擴(kuò)大其使用范圍是目前的研究焦點(diǎn)。

    大豆11S蛋白組分是大豆分離蛋白質(zhì)中比例最高的成分,比例高達(dá)41%,其構(gòu)成組分基本是單一的11S球蛋白(Zhao等,2011)。研究表明,大豆球蛋白主要是由12個(gè)亞基按照A-SS-B基本模式構(gòu)成的兩個(gè)環(huán)狀六角形 (-SS-指二硫鍵)(Zhang等,2015)。12個(gè)亞基分別為6條N末端酸性 ɑ(約 30 kD)亞基(A1、A2、A3、A4、A5、A6)和6條堿性C末端 β (約 20 kD) 亞基(B1、B2、B3、B4、B5、B6),這些亞基之間通過氫鍵 、二硫鍵等分子間作用力構(gòu)成了不同種類的亞基對(duì)。大豆11S蛋白組分中半胱氨酸含量為1%左右 (立等,2010),分子內(nèi)含較多的二硫鍵,二硫鍵的存在限制了其表面活性性能展示。李軍生等(2012)提出通過控制性打開二硫鍵方式對(duì)大豆分離蛋白進(jìn)行改性,可改善其乳化性、起泡性等表面活性性能。董振等(2016)通過過氧乙酸對(duì)大豆11S蛋白進(jìn)行氧化改性,研究結(jié)果表明氧化處理后大豆11S蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性明顯提升。Wu等(2009)通過過氧化氫適度氧化大豆分離蛋白,研究結(jié)果表明氧化處理能夠提高大豆分離蛋白的乳化性以及凝膠性等性能。

    故本研究采用不同濃度的過氧化氫氧化處理大豆11S蛋白,揭示氧化體系對(duì)大豆11S蛋白性能和結(jié)構(gòu)的影響,研究氧化斷開二硫鍵對(duì)大豆11S蛋白結(jié)構(gòu)和性能影響的機(jī)理。為氧化制備高表面活性的大豆11S蛋白提供理論依據(jù),為制備蛋白質(zhì)基表面活性劑提供思路。

    1 材料與方法

    1.1 材料 大豆11S蛋白組分(自制);過氧化氫(H2O2),AR,西隴化工股份有限公司;大豆油,嘉里糧油有限公司;十二烷基硫酸鈉(SDS),CP,汕頭市光華化學(xué)廠;還原型谷胱甘肽,BR,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;β-巰基乙醇,99%,北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司;5,5"-二硫代-2-硝基苯甲酸(DTNB),98%,阿拉丁生化科技股份有限公司。

    1.2 大豆11S蛋白的制備 采用Samoto等(2007)的方法稍作修改,脫脂大豆豆粕與水質(zhì)量體積比1:10混合。用2 mol/L NaOH溶液調(diào)pH至8.0,室溫?cái)嚢?2 h,4 ℃、5000 g離心 10 min;上清液用 2 mol/L HCl溶液調(diào) pH 至 5.8,4℃、5000 g離心10 min,沉淀加水溶解冷凍干燥即為大豆11S蛋白。

    1.3 氧化大豆11S蛋白的制備 采用梯度稀釋的方式配制 4 組濃度分別為 0、10、100、1000 mmol/L 過氧化氫溶液 180 mL,編號(hào) 1、2、3、4。取冷凍干燥后的大豆11S蛋白7.2 g溶解于上述溶液中,使蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度約為40 g/L,用2 mol/L HCl溶液調(diào)pH至2.0。將溶解后的樣品置于4℃冰箱中,反應(yīng)3 h,用2 mol/L NaOH溶液調(diào)pH至8.0,冷凍干燥備用待測(cè)。

    1.4 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳 參考Hu等(2013)的方法稍作修改,其中分離膠濃度13%,濃縮膠濃度5%。將每個(gè)樣品分為兩組,一組加入添加5%β-巰基乙醇的緩沖液,一組加入未添加β-巰基乙醇的緩沖液,每個(gè)樣品池上樣量15μL,進(jìn)行電泳分析。電泳條件:先采用90 V電泳30 min,后采用120 V電泳處理2.5 h。電泳結(jié)束后采用考馬斯亮藍(lán)R-250染色,然后脫色拍照。

    1.5 二硫鍵含量測(cè)定 采用Ellman(1959)介紹的方法并稍作修改測(cè)定 (分光光度計(jì)法)。0.1%DTNB試劑:稱取 100 mg DTNB,溶于 100 mL、pH 8.0的磷酸緩沖液中。0.1%NTSB試劑:稱取100 mg DTNB,溶于10 mL 1 mol/L的 Na2SO3,再用 pH 8.0磷酸緩沖液定容至100 mL。2 mg/mL谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)溶液:用pH 8.0的磷酸緩沖液溶解100 mg還原型谷胱甘肽,并定容至50 mL。

    標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:取上述配制的谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)溶液0~6 mL,用pH 8.0的磷酸緩沖液稀釋定容至50 mL,各取0.4 mL與0.4 mL DTNB試劑混合后利用蒸餾水定容至10 mL,采用Cary-60紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定待測(cè)溶液412 nm處的吸光度。濃度對(duì)吸光度值作標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果如下:

    y=0.0234x+0.0001(R2=0.9989);

    式中:x為所測(cè)樣品的吸光度;y為對(duì)應(yīng)還原型谷胱甘肽濃度;

    1.6 乳化性和乳化穩(wěn)定性測(cè)定 采用Luo等(2013)的方法,配制質(zhì)量濃度10 g/L的蛋白溶液,取20 mL蛋白液與大豆油體積比4:1混合,10000 r/min條件下高速剪切乳化1 min,取0 min和30 min乳化后的樣品溶液20μL與 5 mL 0.1%的SDS混合,采用Cary-60紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定待測(cè)溶液500 nm處的吸光度值。通過以下公式計(jì)算乳化性及乳化穩(wěn)定性。

    式中:T=2.303;N:稀釋倍數(shù),250;c:混合前蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度,g/mL;φ:乳化液中的油相體積分?jǐn)?shù),0.25;A0:0 min 時(shí)的吸光度值;A30:30 min 時(shí)的吸光度值。

    1.7 起泡性和起泡穩(wěn)定性測(cè)定 配制質(zhì)量濃度10 g/L的蛋白溶液,取30 mL樣品溶液于250 mL燒杯中,利用高速剪切機(jī)在10000 r/min條件下均質(zhì)處理1 min。均質(zhì)結(jié)束后迅速將溶液及泡沫倒入100 mL量筒中,并記下此刻泡沫體積V0。室溫靜置30 min,并記錄30 min時(shí)的體積V30。分別利用以下公式計(jì)算起泡性和起泡穩(wěn)定性(Nishinari,2014)。

    1.8 表面張力及臨界膠束濃度(CMC)測(cè)定 參照Bormashenko等(2013)的方法。配制10 g/L的氧化大豆蛋白溶液,分別取 1、3、5、7、9、11 mL 樣品溶液利用蒸餾水定容至50 mL(為保證每組樣品出現(xiàn)拐點(diǎn),每組樣品測(cè)定時(shí)配制的濃度組數(shù)略有不同)。將蛋白質(zhì)溶液按照低濃度到高濃度順序,依次采用全自動(dòng)界面張力儀測(cè)定表面張力,每組樣品平行測(cè)定三次。采用表面張力對(duì)樣品濃度作對(duì)數(shù)圖,通過圖形拐點(diǎn)坐標(biāo)得出樣品的最低表面張力值和臨界膠束濃度CMC值(Sedev,2011)。

    1.9 紅外光譜測(cè)定 參照Yan等(2014)的方法,取冷凍干燥后的氧化大豆11S蛋白10μg與0.1 mg硝酸鉀混合壓片,采用傅里葉紅外光譜儀測(cè)定各樣品的紅外光譜。

    1.10 原子力顯微鏡掃描圖測(cè)定 參考Song等(2015)的方法,配制濃度為10μg/mL的氧化大豆蛋白溶液,取2μL樣品溶液置于新鮮剝離的云母片上,室溫干燥測(cè)定。測(cè)定條件:采用輕巧模式,頻率320 kHz;掃描速度1.0 Hz;硅尖長(zhǎng)度125μm,曲率半徑42 N/m;共振頻率290 KHz。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 二硫鍵的含量變化 過氧化氫等氧化劑可以將蛋白質(zhì)中二硫鍵氧化成磺酸基團(tuán)從而不可逆轉(zhuǎn)的斷開蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵。氧化劑的氧化強(qiáng)度過大時(shí)則會(huì)將蛋白質(zhì)分子間和分子內(nèi)的游離巰基以及二硫鍵全部生成磺酸基團(tuán) (Ye等,2013),并且會(huì)造成部分氫鍵等分子鍵的破壞,蛋白質(zhì)的整體結(jié)構(gòu)完全破壞,導(dǎo)致無法測(cè)定二硫鍵變化的情況。從表1可以看出,隨著過氧化氫濃度的增加,二硫鍵的含量呈現(xiàn)降低趨勢(shì),當(dāng)過氧化氫濃度高于10 mmol/L時(shí),過氧化氫直接將游離巰基以及斷開的二硫鍵完全氧化成磺酸基團(tuán),從而阻止了二硫鍵與游離巰基之間的轉(zhuǎn)化,氧化劑濃度越高二硫鍵斷開的越多。表1中磺酸基團(tuán)的變化規(guī)律也說明了當(dāng)過氧化氫濃度高于10 mmol/L時(shí),二硫鍵以及游離巰基會(huì)在氧化劑作用下氧化生成磺酸基團(tuán)。

    隨著過氧化氫濃度的增加大豆11S蛋白中的二硫鍵打開率迅速增加,且當(dāng)過氧化氫濃度過高時(shí),二硫鍵打開率接近100%。表1說明過氧化氫的氧化處理可以使得大豆11S蛋白分子中游離巰基以及二硫鍵發(fā)生不可逆氧化。同時(shí)過量的氧化會(huì)造成蛋白質(zhì)分子中二硫鍵、氫鍵等分子鍵最大程度的破壞,導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)無規(guī)律改變,從而出現(xiàn)無法采用該法測(cè)定二硫鍵的現(xiàn)象。

    表1 氧化大豆11S蛋白游離巰基和二硫鍵的含量

    2.2 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳 由SDS-PAGE凝膠電泳圖可以看出,未添加β-巰基乙醇時(shí)條帶大部分出現(xiàn)在分子量66.2 kDa的位置,分子量偏大,而添加β-巰基乙醇時(shí)條帶出現(xiàn)下調(diào),說明大豆11S的酸性亞基AS與堿性亞基BS通過二硫鍵相連構(gòu)成分量較大的亞基聚集體,當(dāng)經(jīng)過β-巰基乙醇還原后,二硫鍵斷開,酸性亞基和堿性亞基分開,電泳圖出現(xiàn)低分子量條帶。通過圖1a對(duì)比各條帶可以發(fā)現(xiàn)隨著氧化程度的增強(qiáng),31.0~43.0 kDa以及20.1 kDa附近條帶顏色加深,小分子量亞基增加。說明隨著氧化程度的增加,二硫鍵打開的程度增大,大豆11S蛋白中的酸性亞基AS以及堿性亞基BS降解程度增大,形成更多的小分量亞基組分。

    圖1b是添加β-巰基乙醇的電泳圖譜,β-巰基乙醇可以還原蛋白質(zhì)分子間的二硫鍵,使得大豆11S蛋白質(zhì)分子中酸性亞基AS與堿性亞基BS分散,從而通過電泳完整展示蛋白質(zhì)的亞基構(gòu)成。通過對(duì)比圖1b的各條帶與Samoto等(2007)結(jié)果中的大豆11S組分電泳圖發(fā)現(xiàn),本試驗(yàn)所提純制取的大豆11S蛋白基本滿足試驗(yàn)需求。圖1b中2~4條帶在20.1~31.0 kDa出現(xiàn)許多淺色條帶,說明適度的氧化不僅斷開蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵,也造成部分游離巰基與二硫鍵之間相互轉(zhuǎn)化形成新的亞基組合方式,當(dāng)添加β-巰基乙醇時(shí)各樣品中二硫鍵幾乎全部被還原,從而產(chǎn)生許多新的分子量較小的條帶。而氧化過度的圖1a、1b中的4條帶基本沒有差別,說明過度氧化使得二硫鍵不可逆轉(zhuǎn)的斷開。

    2.3 乳化性及乳化穩(wěn)定性 由圖2可知,過氧化氫的氧化可以改變大豆11S蛋白的乳化性能,且合適的氧化強(qiáng)度可以明顯提升大豆11S蛋白的乳化性能。天然的大豆11S蛋白本身具有一定的乳化性能,這也是對(duì)其進(jìn)行改性處理的基礎(chǔ),所以未經(jīng)處理的1號(hào)樣品具有一定乳化性和乳化穩(wěn)定性。隨著氧化強(qiáng)度的增強(qiáng),巰基被氧化成磺酸基團(tuán),二硫鍵被不可逆轉(zhuǎn)的斷開,蛋白分子中各亞基之間的作用力減弱,蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)破壞,較多的疏水性基團(tuán)暴露至分子表面,當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)進(jìn)行均質(zhì)乳化時(shí),暴露表面的疏水性殘基分散在油水表面,增加蛋白質(zhì)在此界面上的吸附量,蛋白質(zhì)分子中疏水殘基與油相結(jié)合定向排列在油/水界面形成較為致密的吸附膜,同時(shí)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)變得松散,分子柔性增加,從而使蛋白質(zhì)的乳化性以及乳化穩(wěn)定性提高 (Ishii等,2016)。但當(dāng)氧化強(qiáng)度過大時(shí)不僅會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子間的二硫鍵等不可逆轉(zhuǎn)斷開,同時(shí)也會(huì)使得蛋白質(zhì)分子間的其他化學(xué)鍵斷開,導(dǎo)致蛋白質(zhì)分解成較小的亞基基團(tuán),這些基團(tuán)在均質(zhì)乳化過程中,會(huì)因?yàn)槭杷嗷プ饔眯纬删奂w,導(dǎo)致疏水基團(tuán)的重新包埋,減少蛋白質(zhì)分子在油/水界面上的分布,分解成較小的殘基之后的蛋白質(zhì)分子柔性降低,從而導(dǎo)致大豆11S蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性降低。

    2.4 起泡性及起泡穩(wěn)定性 由圖3可知,未經(jīng)氧化的大豆11S蛋白具有一定的起泡性和泡沫穩(wěn)定性,但起泡性較弱。經(jīng)過過氧化氫氧化之后大豆11S蛋白的起泡性能有了不同程度的提升,當(dāng)過氧化氫濃度達(dá)到100 mmol/L時(shí)起泡性達(dá)到最高值,起泡性能提高了約150%,而隨著過氧化氫濃度繼續(xù)增加起泡性下降。起泡穩(wěn)定性的變化規(guī)律與起泡性略微不同,未經(jīng)氧化的大豆11S蛋白具有一定泡沫穩(wěn)定性,且高于低濃度氧化樣品的泡沫穩(wěn)定性,低于較高氧化強(qiáng)度的樣品的泡沫穩(wěn)定性。除此之外,過氧化氫濃度達(dá)到1000 mmol/L時(shí)泡沫穩(wěn)定性明顯增高。

    隨著氧化程度的增強(qiáng),蛋白質(zhì)中二硫鍵與游離巰基發(fā)生轉(zhuǎn)移,二硫鍵發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)斷開,在此過程中蛋白質(zhì)發(fā)生去折疊、重組裝等變化,導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子中疏水基團(tuán)之間的相互作用增強(qiáng),從而提高起泡性(Vatanparast等,2017)。當(dāng)氧化程度增加,二硫鍵被大部分?jǐn)嚅_后蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露,蛋白質(zhì)在溶液狀態(tài)時(shí)親水基團(tuán)與疏水基團(tuán)比例接近平衡,蛋白質(zhì)分子在溶液表面的定向排列更加有序,大豆11S蛋白的起泡性能明顯提高。氧化強(qiáng)度過強(qiáng)時(shí)蛋白質(zhì)分子降解為各種小分子量亞基組分,從而增大了蛋白質(zhì)在溶液中分子數(shù)目,較小的亞基也較易在水中定向排列,從而泡沫穩(wěn)定性增加,但由于亞基在水溶液狀態(tài)會(huì)受到疏水相互作用從而使得部分疏水基團(tuán)包埋,所以過度氧化,起泡性下降。從圖2整體來看氧化能明顯提高大豆11S蛋白的起泡性但對(duì)大豆11S蛋白的泡沫穩(wěn)定性影響不大。

    2.5 表面張力(γCMC)及 CMC值 表面活性劑水溶液的表面張力會(huì)隨著濃度的升高而下降,且會(huì)在較低濃度范圍內(nèi)急劇下降,隨著濃度的不斷增加,表面活性劑在水溶液中會(huì)逐漸形成穩(wěn)定的膠束或膠團(tuán),一定膠束形成后的溶液其表面張力基本保持穩(wěn)定,不會(huì)隨濃度的增加而改變。表面活性劑溶液膠束大量形成對(duì)應(yīng)的濃度即為溶液的臨界膠束濃度(CMC)(Wang等,2013)。因此可以采用表面張力對(duì)濃度作對(duì)數(shù)圖,圖形上出現(xiàn)的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的濃度即為表面活性劑的CMC值(Kuperkar,2016)。

    從圖4可以看出,各組樣品的表面張力-濃度對(duì)數(shù)圖均出現(xiàn)類似拐點(diǎn),但拐點(diǎn)出現(xiàn)的趨勢(shì)以及所對(duì)應(yīng)的坐標(biāo)不同。隨著氧化程度的增加拐點(diǎn)趨勢(shì)逐漸明顯,但氧化程度過高時(shí)拐點(diǎn)趨勢(shì)略微平緩,所以氧化處理后的大豆11S蛋白都具有一定的表面活性劑特征,而未經(jīng)氧化的大豆11S蛋白特征不明顯。根據(jù)圖4可得各組樣品的γCMC和CMC值(表2)。由表2可知,經(jīng)過氧化處理之后大豆11S蛋白的γCMC均降低,且拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的樣品濃度(CMC)也隨氧化程度的增加而減小,說明氧化改性可以降低大豆11S蛋白的界面張力,提升其在溶液空氣界面形成膠束的能力,從而提高其表面活性性能。這一結(jié)果主要因?yàn)檠趸男蕴幚頃r(shí)氧化斷開了蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵等分子鍵,蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)被打開,結(jié)構(gòu)變的松散,柔性增強(qiáng),分子中親水基團(tuán)和疏水基團(tuán)從新分布排列,從而使蛋白質(zhì)展示更明顯的表面活性劑特征。當(dāng)然合適的氧化更有利于提升大豆11S蛋白的表面活性性能,過度氧化會(huì)使蛋白質(zhì)分子亞基在水溶液中會(huì)受到疏水相互作用而再次折疊,從而使得表面活性性能降低。

    表2 各組樣品的γCMC和CMC值

    2.6 紅外光譜測(cè)定 由圖5可知,高波段樣品在3266 cm-1的吸收峰經(jīng)過氧化向低波段移動(dòng),該波段主要涉及蛋白質(zhì)分子內(nèi)的氫鍵,通過峰位的藍(lán)移和峰強(qiáng)的變化可以看出經(jīng)過氧化之后蛋白質(zhì)分子中的氫鍵增加,其有利于蛋白質(zhì)重新折疊,從而增強(qiáng)內(nèi)部疏水基團(tuán)與外界物質(zhì)的相互作用,提高蛋白質(zhì)的表面活性(Guo等,2015)。樣品在1664 cm-1的吸收峰經(jīng)過氧化之后藍(lán)移至1646 cm-1,該波段藍(lán)移對(duì)應(yīng)的是蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的β-轉(zhuǎn)角、α-螺旋向無規(guī)卷曲的轉(zhuǎn)變(Tang等,2009)。說明經(jīng)過氧化之后由于二硫鍵等分子間的斷裂,以及新的氫鍵形成導(dǎo)致蛋白質(zhì)的高級(jí)有序結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,蛋白質(zhì)的無序結(jié)構(gòu)增加,分子的柔性增加,從而提高了蛋白質(zhì)的表面活性性能。樣品1540 cm-1處的吸收峰歸屬于酰胺Ⅱ帶氧化之后藍(lán)移至1537 cm-1,結(jié)合圖中的峰型可以看出,蛋白質(zhì)內(nèi)的氫鍵增多,重新折疊內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露在蛋白質(zhì)表面,氫鍵重新穩(wěn)定蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)。1238 cm-1處的吸收峰歸屬于β-折疊經(jīng)過氧化之后藍(lán)移至1230 cm-1處,結(jié)合圖中各組樣品的峰強(qiáng)可以看出經(jīng)過氧化之后β-折疊增加。β-折疊這種片層結(jié)構(gòu)需要?dú)滏I等作用力將兩條以上的肽鏈連接起來,在形成這種結(jié)構(gòu)的過程中氫鍵的含量會(huì)增加,并且蛋白質(zhì)分子中的垂直結(jié)構(gòu)會(huì)增加,從而減少維持蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)所需要的能量,其次片層狀的平行或反平行結(jié)構(gòu)可以減少側(cè)鏈基團(tuán)的阻礙作用,使得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)伸展?fàn)顟B(tài),從而增加蛋白質(zhì)的表面活性性能。1068 cm-1和620 cm-1處的吸收峰位是磺酸基團(tuán)的歸屬峰,通過圖中各組樣品的峰型可以看出經(jīng)過氧化處理之后磺酸基團(tuán)增加。

    綜上所述,大豆11S蛋白經(jīng)過氧化之后無規(guī)卷曲和β-折疊片層增多,蛋白質(zhì)在氫鍵作用下重新折疊形成結(jié)構(gòu)伸展柔性更強(qiáng)的蛋白質(zhì)分子,從而增加了表面活性性能。除此之外磺酸基團(tuán)的增加也證實(shí)了經(jīng)過氧化之后大豆11S蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵發(fā)生了不可逆斷開,這一結(jié)果表明蛋白質(zhì)分子內(nèi)部疏水性基團(tuán)不可逆轉(zhuǎn)地暴露至分子表面,大豆11S蛋白的表面活性性能提升。

    2.7 原子力顯微鏡掃描結(jié)果 采用原子力顯微鏡(AFM)對(duì)各樣品的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究,可以直觀地看出經(jīng)過氧化處理之后各組樣品的形貌變化。從而推斷氧化作用對(duì)大豆11S蛋白形貌的影響,進(jìn)而推斷對(duì)其結(jié)構(gòu)和表面活性的影響。

    大豆11S蛋白經(jīng)過不同濃度的過氧化氫處理后的原子力顯微鏡掃描結(jié)果顯示,掃描范圍分別為10.00μm×10.00μm,未經(jīng)處理的大豆11S蛋白質(zhì)顆粒大小不均一,顆粒較大,約為1000~2000 nm;過氧化氫濃度為10 mmol/L時(shí),蛋白質(zhì)分子間作用力破壞,分子解聚,大顆粒蛋白減少,均勻度增加,約為500~800 nm;過氧化氫濃度為100 mmol/L時(shí)與未處理樣品對(duì)比發(fā)現(xiàn),顆粒均一性增強(qiáng),適度氧化使蛋白質(zhì)分子高級(jí)結(jié)構(gòu)改變,而亞基結(jié)構(gòu)未發(fā)生較大改變,從而使得蛋白質(zhì)顆粒變小,均一度增加,顆粒約為50~100 nm;過氧化氫濃度為1000 mmol/L時(shí)出現(xiàn)較大顆粒蛋白,且顆粒不均勻度增加,說明過度的氧化完全破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子降解為小分量的亞基組分,顆粒約為800~1500 nm,在脫水自然干燥時(shí),不均一的小顆粒重新發(fā)生聚集形成較大的聚集顆粒(Mcclements,2007)。由此可知經(jīng)適當(dāng)氧化斷開部分二硫鍵可使蛋白質(zhì)分子適度解聚,形成均一度較好的小顆粒蛋白,進(jìn)而提高蛋白質(zhì)在溶液狀態(tài)的表面活性性能。

    3 結(jié)論

    本試驗(yàn)結(jié)果表明,低濃度的過氧化氫會(huì)誘導(dǎo)游離巰基與二硫鍵的轉(zhuǎn)化從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子的重新折疊形成集聚體,再次包埋暴露的疏水性殘基;隨著氧化程度的增加,二硫鍵被不可逆轉(zhuǎn)地?cái)嚅_生成磺酸基團(tuán),從而使得蛋白質(zhì)分子不可逆轉(zhuǎn)的解聚,疏水性殘基暴露,蛋白質(zhì)表面活性性能增加;而過量氧化會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子分解成小分量亞基,這些亞基由于疏水相互作用發(fā)生聚集形成不溶性大顆粒蛋白,從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子的表面活性性能降低。

    通過測(cè)定各組樣品的表面活性性能如乳化性能、起泡性能的結(jié)果可以得出,經(jīng)過濃度100 mmol/L的過氧化氫處理的大豆11S蛋白表面活性最好,HLB值、γCMC和CMC值也表明該濃度過氧化氫氧化處理之后的大豆11S蛋白具有更好的表面活性劑的類似性能。原子力掃描電鏡圖表明經(jīng)過氧化大豆11S蛋白質(zhì)發(fā)生了解聚,分子顆粒變小,顆粒均勻度增加,同時(shí)可溶性蛋白顆粒的含量增加。通過以上分析可以得出,濃度100 mmol/L的過氧化氫能夠較好的改善大豆11S蛋白的表面活性性能。

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