廣東客家娘酒發(fā)酵過程中產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酵母菌的篩選及酶學(xué)性質(zhì)研究

葉 茂，鄧毛程，何雪瑩，歐巧玲，尹愛國

（1.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品與生物技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510300；2.廣東省特色調(diào)味品工程技術(shù)開發(fā)中心，廣東 廣州 510300；3.廣東石油化工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，廣東 茂名 525000）

β-葡萄糖苷酶（EC3.2.1.21）又稱β-D-葡萄糖苷水解酶，首次于1837年由LIEBIG和WOHLER在苦杏仁中發(fā)現(xiàn)[1]，其主要水解化合物末端的非還原性β-D-葡萄糖苷鍵，從而釋放出β-D-葡萄糖和配基[2]。β-葡萄糖苷酶有非常廣泛的工業(yè)應(yīng)用，可用于降解纖維素生產(chǎn)生物乙醇、改善食品風(fēng)味、轉(zhuǎn)化大豆異黃酮糖苷化合物、制備低聚龍膽糖、防治病蟲害等，具有巨大的生物技術(shù)應(yīng)用前景[3]。尤其是作為香氣改良或提升的關(guān)鍵酶，近幾年有關(guān)其在食品增香中的研究倍受關(guān)注[4]。

β-葡萄糖苷酶在酒類（葡萄酒、果酒、白酒等）生產(chǎn)過程中可增加酒的香氣[5-6]。目前，所用β-葡萄糖苷酶酶制劑大多來自于曲霉的固態(tài)發(fā)酵[7]，該酶的加入雖然能改善酒的香氣，但同時(shí)也給釀酒造成蛋白不穩(wěn)定隱患[8]。因此，篩選具有β-葡萄糖苷酶活性的釀造酵母，已成為釀酒行業(yè)的瓶頸之一。

廣東客家娘酒作為我國古老的酒種之一，已有5 000多年的歷史，是客家古文化和酒文化相結(jié)合的精華，是東南及華南沿海一帶（俗稱嶺南一帶），如江蘇、浙江、上海、福建、廣東等省市客家人獨(dú)有的民間傳統(tǒng)發(fā)酵型黃酒[9]。本研究以其為原料，從中篩選產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的釀造酵母，采用分子生物學(xué)技術(shù)對其進(jìn)行鑒定，并研究其所產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)，為篩選具有地區(qū)特色產(chǎn)β-葡萄糖苷酶野生酵母提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)，為本地區(qū)客家娘酒釀造酵母資源庫的建設(shè)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

廣東客家娘酒酒糟：廣東省梅州市某客家娘酒廠，于-80 ℃保存。

1.1.2 試劑

對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-β-Dglucopyranoside，p-NPGlc）、對硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷（p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，p-NPGal）、對硝基苯基-β-D-纖維二糖苷（4-nitrophenyl-β-D-cellobioside，p-NPCel）、對硝基苯基-β-D-木糖苷（4-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside，p-NPXyl）（均為色譜純），七葉皂苷（分析純）：北京索萊寶科技有限公司；酵母基因組提取試劑盒：日本TaKaRa公司；酵母浸粉、胰蛋白胨（均為分析純）：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；對硝基苯酚、葡萄糖、NaCl、MgSO4·7H2O、KH2PO4（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，酵母浸膏10 g/L，121 ℃高壓滅菌20 min。

篩選培養(yǎng)基[10]：檸檬酸鐵0.5 g/L，酵母膏2 g/L，蛋白胨0.5g/L，瓊脂20g/L，七葉苷1g/L，121℃高壓蒸汽滅菌20min。

發(fā)酵培養(yǎng)基[11]：蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，酵母浸膏10 g/L，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

722N型可見分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-IF超凈工作臺(tái)：蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；JY96-IIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；H3018DR高速冷凍離心機(jī)：上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司；SPX-100B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酵母菌株的篩選

初篩：采用七葉苷功能篩選法進(jìn)行初篩[12]。稱取一定質(zhì)量的酒曲，用無菌生理鹽水稀釋至適當(dāng)梯度后，涂布于篩選培養(yǎng)基，28 ℃條件下培養(yǎng)72 h，挑取黑色圈明顯的菌株為目標(biāo)菌株進(jìn)行復(fù)篩。

復(fù)篩：將初篩菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，28 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)72 h，測定β-葡萄糖苷酶活性，從中篩選酶活力較高的菌株[13]。

1.3.2β-葡萄糖苷酶活性的測定

取發(fā)酵液20 mL，5 000 r/min離心5 min，棄上清，收集菌體。將菌體懸浮于10 mL磷酸緩沖鹽（phosphate buffer saline，PBS）溶液（pH7.0）中，采用超聲波破碎細(xì)胞（250 W超聲破碎1 min，間歇30 s，破碎30次），4 ℃、10 000 r/min離心，取上清液，即為β-葡萄糖苷酶粗酶液。參考文獻(xiàn)[14]并作修改測定β-葡萄糖苷酶活力，具體方法：取0.1 mL適當(dāng)稀釋的粗酶液，加入0.9 mL 5.0 mmol/L p-NPGlc（pH 6.0的Britton-Robinson緩沖液配制），50 ℃恒溫水浴反應(yīng)10 min，加入1 mL 1 mol/L的Na2CO3終止反應(yīng)，靜置5 min，顯色，于波長400 nm處測定吸光度值。同時(shí)，以加熱失活的酶液作為空白對照。

β-葡萄糖苷酶活力單位定義：在pH 6.0、50 ℃反應(yīng)條件下，每分鐘催化水解1 μmol p-NPGlc所需要的酶量為1個(gè)酶活力單位（IU）。

1.3.3 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株的分子生物學(xué)鑒定

采用酵母基因組提取試劑盒提取篩選菌株的基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），以其為模板，參考文獻(xiàn)[15]對菌株的26S rDNA D1/D2區(qū)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果提交至美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）網(wǎng)站的GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST搜索比對，分析序列同源性。選取同源性較高的模式菌株的26S rDNA D1/D2區(qū)基因序列，采用MEGA X10軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4β-葡萄糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)研究

底物特異性[16]：以p-NPGlc、p-NPGal、p-NPCel和p-NPXyl為底物，測定β-葡萄糖苷酶活力，以最高酶活力為100%，計(jì)算相對酶活力。

最適反應(yīng)溫度：在25～70 ℃條件下測定β-葡萄糖苷酶活力，以最高酶活力為100%，計(jì)算相對酶活力。

溫度穩(wěn)定性：將粗酶液分別置于25～70 ℃條件下恒溫水浴120 min，迅速冷卻至室溫，測定β-葡萄糖苷酶活力，以最高酶活力為100%，計(jì)算相對酶活力。

最適反應(yīng)pH值：在pH值為3.0～8.0條件下測定β-葡萄糖苷酶活力，以最高酶活力為100%，計(jì)算相對酶活力。

pH穩(wěn)定性：將粗酶液分別在pH值為3.0～8.0條件下室溫靜置1 h，測定β-葡萄糖苷酶活力，以最高酶活力為100%，計(jì)算相對酶活力。

金屬離子對酶活性的影響：在反應(yīng)體系中添加1 mmol/L或100 mmol/L的金屬離子（Ca2+、Mn2+、Mg2+、Co2+、Zn2+、Fe2+、Ni+、K+、Al3+、Cu2+），測定β-葡萄糖苷酶的活力，以不含金屬離子的酶活力為100%，計(jì)算相對酶活力。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)用SPSS24.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酵母菌株的篩選

以廣東客家娘酒發(fā)酵過程中的酒糟為分離源，通過七葉苷功能篩選法，初步篩選出β-葡萄糖苷酶活力較高的酵母18株，部分菌株的篩選結(jié)果見圖1。

圖1 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株的篩選結(jié)果Fig.1 Screening results of β-glucosidase producing strain

由圖1可知，具有β-葡萄糖苷酶活力的菌株會(huì)呈現(xiàn)黑色，黑色圈越大或出現(xiàn)越早則意味著菌株酶活力較高。然后通過復(fù)篩，得到β-葡萄糖苷酶活力最高的菌株，命名為kj_312，酶活力達(dá)到56.2 IU/L。因此，以該菌株作為試驗(yàn)菌株進(jìn)行下一步的研究。

2.2 26S rDNA D1/D2區(qū)基因序列分析

將菌株kj_312的26S rDNA D1/D2區(qū)基因序列與Gen-Bank數(shù)據(jù)庫中已鑒定的酵母的26S rDNA D1/D2區(qū)序列進(jìn)行同源性比對，選取同源性較高的模式菌株的26S rDNA D1/D2區(qū)基因序列，采用MEGA X10軟件中的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖2。

圖2 基于26S rDNA D1/D2區(qū)序列的產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of β-glucosidase producing strains based on 26S rDNA D1/D2 domain sequence

由圖2可知，菌株kj_312與假絲酵母Candida apicolaAN16聚于一支，親緣關(guān)系最近。因此，初步鑒定該菌株為假絲酵母Candida apicola。

2.3 β-葡萄糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 底物特異性

由圖3可知，該β-葡萄糖苷酶可以水解p-NPGlc、p-NPCel、p-NPGal和p-NPXyl，其中以p-NPGlc為底物時(shí)，相對酶活力最高，其次為p-NPCel和p-NPGal。表明假絲酵母kj_312所產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶具有較寬的底物特異性，能夠水解多種底物，屬于多功能酶[17-18]，且其最適底物為p-NPGlc。

圖3 菌株kj_312所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的底物特異性Fig.3 Substrate specificity of β-glucosidase produced by strain kj_312

2.3.2 最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性

圖4 菌株kj_312所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性Fig.4 Optimal reaction temperature and temperature stability of β-glucosidase produced by strain kj_312

由圖4可知，在反應(yīng)溫度25～60 ℃范圍內(nèi)，β-葡萄糖苷酶活力隨著溫度的升高而升高；當(dāng)反應(yīng)溫度為60 ℃時(shí)，酶活性達(dá)到最高；當(dāng)溫度高于60 ℃之后，酶活力呈現(xiàn)緩慢下降趨勢。因此，確定β-葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)溫度為60 ℃。當(dāng)粗酶液在溫度25～75 ℃范圍內(nèi)恒溫水浴120 min，酶活力隨著處理溫度的升高逐漸下降，當(dāng)處理溫度為65 ℃時(shí)，相對酶活性為64%；當(dāng)處理溫度高于65 ℃之后，相對酶活力＜50%，說明β-葡萄糖苷酶在25～65 ℃具有較好的穩(wěn)定性。與其他酵母來源的β-葡萄糖苷酶[8，19]比較，本研究假絲酵母kj_312所產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶具有較廣的溫度適應(yīng)性。

2.3.3 最適反應(yīng)pH值及pH穩(wěn)定性

目前很多研究表明，絕大多數(shù)β-葡萄糖苷酶的最適pH值在3.5～5.5范圍內(nèi)，適宜于釀酒環(huán)境介質(zhì)中應(yīng)用[8，20]。由圖5可知，假絲酵母kj_312所產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)pH值為4.5，并且在pH值4.0～7.0酸性范圍內(nèi)相對酶活力＞80%，表現(xiàn)出較高的pH穩(wěn)定性。結(jié)果表明，該β-葡萄糖苷酶能極大地滿足在釀酒期間的pH要求，為該菌株在釀酒中的應(yīng)用提供了依據(jù)。

圖5 菌株kj_312所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)pH值及pH穩(wěn)定性Fig.5 Optimal reaction pH and pH stability of β-glucosidase produced by strain kj_312

2.3.4 金屬離子對β-葡萄糖苷酶活性的影響

表1 不同金屬離子對β-葡萄糖苷酶活性的影響Table 1 Effect of metal ions on β-glucosidase activity

由表1可知，金屬離子種類及濃度對酶活性的影響不同。在1 mmol/L濃度下，Ca2+、Mn2+、Zn2+和Fe2+使相對酶活力分別提高至140%、136%、113%和176%，其余金屬離子則使相對酶活力降至56%～87%；而在100 mmol/L濃度下，Ca2+、Zn2+和Fe2+使相對酶活力提高至218%、201%和232%，Mg2+使相對酶活力降低至56%，Mn+、Co2+、Ni2+、Na+、K+、Al3+和Cu2+則使β-葡萄糖苷酶完全失活。

3 結(jié)論

從廣東客家娘酒發(fā)酵過程中的酒糟中篩選得到1株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活力較高的酵母菌，命名為kj_312，經(jīng)26srDNA D1/D2區(qū)基因序列分析，鑒定其為假絲酵母Candida apicola。酶學(xué)性質(zhì)研究表明，該酵母所產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶具有較寬的底物特異性，對多種底物較具有高的催化活性，最適底物為對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷；最適反應(yīng)溫度為60 ℃，在25～65 ℃范圍內(nèi)相對酶活力＞50%；最適pH值為4.5，在pH 4.0～7.0酸性范圍內(nèi)相對酶活力＞80%；1 mol/L的Ca2+、Mn2+、Zn2+和Fe2+及100 mol/L的Ca2+、Zn2+和Fe2+能顯著提高酶活力。