發(fā)酵食品中多種防腐劑檢測(cè)方法的建立

成 祝，劉 潔，冉 琴，鄧 星，羅 蓓，蘇小東

（重慶科技學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，重慶 401331）

發(fā)酵食品是指人們利用有益微生物加工制造的一類食品，日常食用的發(fā)酵食品主要有谷物發(fā)酵制品、豆類發(fā)酵制品和乳類發(fā)酵制品，其富含氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、糖類等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)人體健康有很大的益處[1]。發(fā)酵食品因存在多種細(xì)菌等，保質(zhì)期一般較短，為延長(zhǎng)食品的保質(zhì)期，往往會(huì)在加工過(guò)程中加入一些食品防腐劑。

苯甲酸和山梨酸是最常用的食品防腐劑，但過(guò)多食用苯甲酸和山梨酸會(huì)影響人體對(duì)維生素和鈣的吸收，加重人體肝臟負(fù)擔(dān)，并引起毒癥反應(yīng)或誘發(fā)癌癥[2-3]。因此國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[4]對(duì)苯甲酸、山梨酸的使用范圍與限量做了嚴(yán)格規(guī)定。

新近研究發(fā)現(xiàn)苯乳酸（phenyllactic acid，PLA）[5]可以有效的防止食物腐敗變質(zhì)，而且對(duì)多種食源性致病菌都有很強(qiáng)的抑菌作用[6]，可作為一種廣譜的殺菌劑、天然新型防腐劑用于食品防腐保質(zhì)。同時(shí)有研究者[7]發(fā)現(xiàn)，苯乳酸與防腐劑聯(lián)合作用，可以有效的減少食品中人工合成防腐劑的添加量，減少人工防腐劑對(duì)人體的危害。天然防腐劑苯乳酸復(fù)合其他人工合成防腐劑使用將成為食品防腐的發(fā)展趨勢(shì)。

目前，苯甲酸和山梨酸的檢測(cè)方法主要包括氣相色譜法（gas chromatography，GC）[8-10]、毛細(xì)管電泳法（capillary electrophoresis，CE）[11]、高效液相色譜法（high-performance liquid chromatography，HPLC）[12-15]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）[16]、液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[17]、液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜法（liquid chromatography-time of flight-mass spectrometry，LCTOF/MS）[18-19]和表面增強(qiáng)拉曼光譜法（surface enhanced raman spectroscopy，SERS）[20]等。但同時(shí)檢測(cè)苯乳酸和其他食品防腐劑還未報(bào)道。本研究利用高效液相色譜法（HPLC），通過(guò)簡(jiǎn)單的樣品前處理建立了一種同時(shí)、簡(jiǎn)便、快速檢測(cè)發(fā)酵食品中苯乳酸、苯甲酸、山梨酸的高效液相色譜的分析方法，以期將該方法運(yùn)用于多種發(fā)酵食品檢測(cè)，為苯乳酸與苯甲酸與山梨酸的復(fù)配提供技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1～9號(hào)樣品：市售；醋酸銨（分析純）、山梨酸（純度99%）：上海麥克林生化有限公司；苯甲酸（純度99%）、三氟乙酸（純度＞99.5%）：上海源葉生物有限公司；苯乳酸（純度98%）：阿拉丁控股集團(tuán)有限公司；乙酸鋅（分析純）、亞鐵氰化鉀（分析純）、甲醇（色譜純）：成都科隆有限公司；磷酸三鈉（分析純）：川東化學(xué)集團(tuán)有限公司；磷酸二氫鈉（分析純）：北京康普惠威科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

福立LC5090 高效液相色譜色譜儀：浙江福立分析儀器股份有限公司；ATY124分析天平：日本島津公司；T9紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；SB-120D超聲清洗機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜分析條件

色譜柱：采用SapphiresilTM C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動(dòng)相：0.020 mol/L乙酸銨（pH=6.4）-甲醇溶液（80∶20，V/V）；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；進(jìn)樣方式：滿環(huán)進(jìn)樣；色譜柱溫度：25 ℃，檢測(cè)器：紫外（ultraviolet，UV）檢測(cè)器。

1.3.2 樣品前處理

（1）含蛋白質(zhì)的樣品

參照王淼等[21]的方法并做修改，準(zhǔn)確稱取2.5 g樣品于25 mL比色管中，分別加入0.25 mol/L亞鐵氰化鉀溶液和0.50 mol/L乙酸鋅溶液各1.0 mL，用10%甲醇-水定容，振蕩2.0 min，混勻，取10 mL溶液4 000×g離心5.0 min，取上層清液過(guò)0.22 μm聚醚砜濾膜，待上機(jī)。

（2）其他樣品

準(zhǔn)確稱取2.5 g樣品于25 mL比色管中，用10%甲醇-水定容至10 mL，渦旋振蕩2.0 min，混勻，取上層清液過(guò)0.22 μm聚醚砜濾膜，待上機(jī)。

1.3.3 方法驗(yàn)證

在確定的色譜條件下，以苯乳酸、苯甲酸、山梨酸的質(zhì)量濃度為橫軸（X），峰面積為縱軸（Y），配制質(zhì)量濃度2.00 mg/L、5.00 mg/L、10.00 mg/L、20.00 mg/L、30.00 mg/L、40.00 mg/L、50.00 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而評(píng)估方法的線性度。將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液不斷稀釋至信噪比S/N=3，以此進(jìn)樣濃度為檢出限（limit of detection，LOD），以10倍信噪比對(duì)應(yīng)的濃度為定量下限（LOQ）。以原生醋做加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，通過(guò)計(jì)算回收率考察方法的準(zhǔn)確度，以回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）考察方法的精密度。在原生醋樣品中添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，加標(biāo)水平分別為5.00 mg/L、10.00 mg/L、20.00 mg/L，每個(gè)添加水平平行測(cè)定6 次，加標(biāo)回收率計(jì)算公式如下：

式中：Csm表示加標(biāo)檢測(cè)值，mg/L；Cm表示樣品檢測(cè)值，mg/L；Cs表示加標(biāo)量，mg/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)

液相色譜配備紫外檢測(cè)器進(jìn)行分析測(cè)試時(shí)，選擇分析物的最大吸收波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng)是不必要的[22]，但待分析物在檢測(cè)波長(zhǎng)下要求有較強(qiáng)的吸收。同時(shí)波長(zhǎng)選擇與流動(dòng)相有一定的關(guān)系，如含甲醇的流動(dòng)相不能在波長(zhǎng)低于210～220 nm檢測(cè)，這取決于甲醇的濃度[22]。苯乳酸、苯甲酸、山梨酸的紫外吸收光譜圖見(jiàn)圖1。由圖1可知，3種待測(cè)物都有紫外吸收，且各組分的最大吸收波長(zhǎng)不同，但3種防腐劑在波長(zhǎng)220 nm處均有較強(qiáng)紫外吸收，為均衡3種防腐劑的檢測(cè)靈敏度，選擇220 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 苯乳酸、苯甲酸及山梨酸的紫外吸收光譜圖Fig.1 Ultraviolet absorption spectrum of phenyllactate,benzoic acid and sorbic acid

2.1.2 流動(dòng)相

實(shí)驗(yàn)考察了甲醇-混合磷酸鹽（0.010 mol/L NaH2PO4+0.010 mol/L Na2HPO4，pH=6.8）（5∶95，V/V）、甲醇-三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）（0.020 mol/L TFA，pH=2.1，氨水調(diào)節(jié)pH為6.1）（5∶95，V/V）、甲醇-乙酸銨（0.020 mol/L，pH=6.4）（5∶95，V/V）等流動(dòng)相對(duì)分離效果的影響。當(dāng)使用第1種流動(dòng)相時(shí)，苯乳酸未出峰；使用第2種流動(dòng)相時(shí)，苯甲酸未出峰。前兩種流動(dòng)相未實(shí)現(xiàn)苯乳酸、苯甲酸、山梨酸的同時(shí)檢測(cè)。當(dāng)使用甲醇-乙酸銨（20∶80，V/V）為流動(dòng)相時(shí)，檢測(cè)靈敏度高，分離度均＞1.5，峰形尖銳。因此，選擇流動(dòng)相為甲醇-0.020 mol/L乙酸銨（20∶80，V/V）。

2.1.3 色譜分離條件

采用C18色譜柱分離，通過(guò)單因素法對(duì)各種色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化。甲醇比例增加，會(huì)使流動(dòng)相的極性減小，并能增加溶質(zhì)分子與溶劑分子之間相互作用的強(qiáng)度[22]。改變流動(dòng)相中甲醇和乙酸銨溶液的比例，發(fā)現(xiàn)隨著甲醇比例增加，3種待測(cè)物的保留時(shí)間變短；在1.0～1.2 mL/min范圍內(nèi)改變流速，22～40 ℃內(nèi)改變柱溫，0.010～0.050 mol/L范圍內(nèi)改變乙酸銨溶液的濃度，4.0～7.0范圍內(nèi)改變乙酸銨溶液的pH值進(jìn)行條件優(yōu)化。結(jié)果表明，當(dāng)乙酸銨流動(dòng)相pH值為6.4，濃度為0.020 mol/L，柱溫為25 ℃，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)靈敏度高，3種待測(cè)物分離度＞1.5，峰形較好，在12 min內(nèi)可實(shí)現(xiàn)色譜的分離檢測(cè)，高效液相色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 苯乳酸、苯甲酸及山梨酸混標(biāo)的高效液相色譜Fig.2 HPLC chromatography of mixed standards of phenyllactate,benzoic acid and sorbic acid

2.2 濾膜的選擇

實(shí)驗(yàn)考察了水系濾膜與有機(jī)系濾膜對(duì)苯乳酸、苯甲酸和山梨酸的影響。以10.00 mg/L的混合標(biāo)樣作為待過(guò)濾液，分別用0.22 μm聚醚砜濾膜、0.22 μm尼龍濾膜過(guò)濾后上機(jī)檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，尼龍濾膜的回收率在105.00%～110.00%，而聚醚砜濾膜的回收率在100.00%～105.00%，準(zhǔn)確度更高。因此，選擇0.22 μm聚醚砜濾膜進(jìn)行樣品過(guò)濾。

圖3 不同濾膜對(duì)回收率的影響Fig.3 Effect of different membranes on recovery

2.3 方法的線性范圍、檢出限及定量限

由表1可知，在優(yōu)化條件下，苯甲酸線性范圍為0.010～50.00 mg/L，苯乳酸為0.075～50.00 mg/L，山梨酸為0.050～50.00 mg/L，且相關(guān)系數(shù)R2均≥0.998，檢出限在0.010～0.050 mg/L，定量限在0.025～0.25 mg/L，表明該方法提供具有寬線性范圍的靈敏檢測(cè)。

表1 三種防腐劑分析的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、回歸方程、檢出限及定量限Table 1 Linear range,correlation coefficient,regression equation,detection limit and quantitation limit of three kinds of preservatives

2.4 樣品加標(biāo)回收率試驗(yàn)

為了驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性，本研究選取7號(hào)樣品（某原生醋）作為加標(biāo)回收試驗(yàn)。分別向樣品中加入5.00 mg/L、10.00 mg/L、20.00 mg/L不同質(zhì)量濃度的苯乳酸、苯甲酸、山梨酸的混合標(biāo)樣，混勻，經(jīng)過(guò)樣品前處理后測(cè)定其回收率。每個(gè)添加水平平行測(cè)定6次，其結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of adding standard recovery tests

由表2可知，該方法的回收率為96.93%～118.42%，精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.93%～6.21%，說(shuō)明方法的準(zhǔn)確度和精密度較高，此方法的精密度和準(zhǔn)確度符合實(shí)際樣品的檢測(cè)要求。

2.5 樣品中防腐劑的檢測(cè)

應(yīng)用所建立的方法對(duì)市售的幾種樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。該檢測(cè)結(jié)果對(duì)比GB7718—94《食品標(biāo)簽通用標(biāo)準(zhǔn)》[23]，樣品（1～3，7～8號(hào)）存在檢出與樣品標(biāo)簽不符的情況，但對(duì)比國(guó)標(biāo)GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[4]，樣品中苯甲酸與山梨酸檢出值均未超過(guò)添加限（1.00 g/kg）。其中1～3號(hào)樣品有包裝袋上未標(biāo)注的苯甲酸檢出，7～8號(hào)樣品有包裝袋上未標(biāo)注的苯甲酸、山梨酸檢出。

表3 發(fā)酵食品樣品中三種防腐劑檢測(cè)結(jié)果Table 3 Determination results of three kinds of preservatives in fermented food samples

由表3可知，發(fā)酵食品樣品里都含有不同程度的防腐劑，一般都含有天然的防腐劑——苯乳酸。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，某些食品在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)自身產(chǎn)生苯甲酸（內(nèi)源性苯甲酸），故不能確定檢出的苯甲酸是否為外源性苯甲酸，但山梨酸應(yīng)屬于人為添加。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC快速檢測(cè)食品中苯乳酸、苯甲酸、山梨酸，以分析標(biāo)準(zhǔn)品與樣品的保留時(shí)間對(duì)應(yīng)定性。在優(yōu)化的色譜條件下，3種防腐劑在12 min之內(nèi)完成分離檢測(cè)，檢出限在0.010～0.050 mg/L之間，定量限在0.025～0.25 mg/L，回收率為96.93%～118.42%，精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.39%～6.21%。該方法檢測(cè)速度快、所需設(shè)備簡(jiǎn)單、無(wú)需復(fù)雜的樣品前處理。