新疆發(fā)酵駝乳中分解植酸鹽酵母菌的篩選及鑒定

王建程，李 珊，劉 月，李王強(qiáng)，李寶坤

（石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子 832000）

植酸是一種天然有機(jī)化合物，主要存在于豆類、谷類等一些種子的胚芽組織中，螯合金屬離子為植酸鹽[1-2]。植酸酶是一類可分解植酸或植酸鹽生成肌醇和磷酸的酶類。植酸酶根據(jù)來源可分為動(dòng)物植酸酶、植物植酸酶和微生物植酸酶[3]。前兩類植酸酶存在活力低和穩(wěn)定性差的問題，而微生物植酸酶易生產(chǎn)、活力高和穩(wěn)定，應(yīng)用最廣、研究最深入。研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)植酸酶的微生物包括細(xì)菌（大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和乳桿菌等）、酵母菌（啤酒酵母和畢赤酵母等）和真菌（曲霉、根霉和毛霉）。

植酸酶目前主要用于飼料添加劑，其在食品工業(yè)中的研究較少。由于人和單胃動(dòng)物缺乏分解植酸鹽的植酸酶，植酸鹽與腸道內(nèi)物質(zhì)如蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)反應(yīng)，不僅降低單胃動(dòng)物對(duì)磷等金屬離子的吸收和利用，還影響蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，因此，使用植酸酶降低食品中植酸鹽含量有重要的研究價(jià)值。目前，食品用植酸酶主要由基因工程構(gòu)建的真菌產(chǎn)生，這類酶對(duì)熱敏感，在高溫條件下易不可逆失活，所以增加腸道中可分解植酸鹽的微生物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收有重要的補(bǔ)充意義。發(fā)酵乳品是篩選分解植酸鹽益生菌的寶貴資源庫，富含大量可分解植酸鹽的酵母菌，如釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、馬克思克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）和庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）等[4-5]。GREPPI A等[6]從發(fā)酵乳品中篩選到一株庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii），其胞外植酸酶酶活性可達(dá)49.17 mU/mL，具有應(yīng)用潛力。我國《可用于保健食品的真菌名單》包含釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、產(chǎn)朊假絲酵母（Cadida atilis）和乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis），而在許多工業(yè)發(fā)酵或者自發(fā)酵食物中存在眾多不在名單中的酵母菌種[4-5，7-8]。在此背景下，發(fā)酵食物是一個(gè)攝入酵母菌的重要途徑。

為發(fā)掘和保護(hù)新疆牧區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵駝乳中的益生酵母菌資源，本研究以新疆伊犁地區(qū)不同牧區(qū)的12份發(fā)酵駝乳為原料，采用酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基分離，富含植酸二鉀的培養(yǎng)基初篩及降解植酸鹽能力的測定從中篩選可降解植酸鹽的酵母菌，通過形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)及5.8S rDNA ITS1/ITS4區(qū)域序列同源性分析鑒定菌種，并測定其耐酸及耐膽鹽性能。以期篩選到具有降解植酸鹽的酵母菌，為后期在發(fā)酵食品中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

12份發(fā)酵駝乳樣品：采集自新疆伊犁州國營牧場、巴音傲瓦鄉(xiāng)牧區(qū)、伊克烏圖布拉格牧場、精河小海子牧區(qū)、精河闊岱管護(hù)站牧區(qū)，均是哈薩克族、蒙古族和維吾爾族牧民采用傳統(tǒng)方法發(fā)酵而成。

1.1.2 試劑

膽鹽、植酸二鉀、胃蛋白酶、硝酸鉀、亞硝酸鈉（均為分析純）：生工生物工程（上海）股份有限公司；酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、D-半乳糖、棉子糖、可溶性淀粉（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基[9]：葡萄糖20 g/L，酵母膏10 g/L，蛋白胨20 g/L，121 ℃高壓滅菌15 min。

Phy+培養(yǎng)基[10]：葡萄糖20 g/L，氯化鉀1.7 g/L，硫酸二胺7.5 g/L，七水硫酸鎂0.74 g/L，植酸二鉀1.85 g/L，121 ℃高壓滅菌15 min。

Phy-培養(yǎng)基[10]：葡萄糖20 g/L，氯化鉀1.7 g/L，硫酸二胺7.5 g/L，七水硫酸鎂0.74 g/L，121 ℃高壓滅菌15 min。

Phy基礎(chǔ)培養(yǎng)基[10]：葡萄糖20 g/L，磷酸二氫鉀3.5 g/L，硫酸二胺7.5g/L，七水硫酸鎂0.74g/L，121℃高壓滅菌15min。

以上為液體培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基添加20 g/L的瓊脂粉。

1.2 儀器與設(shè)備

W-CJ-1CG超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；DNP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏試驗(yàn)設(shè)備公司；5417R高速冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf公司；TC-512聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增儀：美國Techne公司；MLS-3750型高溫高壓滅菌鍋，日本SANYO公司；722S可見分光光度計(jì)：上海欣茂儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酵母菌的分離純化

取500 μL發(fā)酵駝乳于4.5 mL無菌生理鹽水中，按10倍梯度進(jìn)行稀釋，均勻涂布于YPD培養(yǎng)基，在28 ℃條件下培養(yǎng)48 h，觀察并記錄菌落特征，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行美蘭染色，鏡檢，觀察并記錄細(xì)胞形態(tài)，將不同形態(tài)的酵母菌重復(fù)劃線純化，直至形態(tài)單一，保存在30%的甘油中，-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.3.2 分解植酸鹽酵母菌的篩選[6]

菌株的活化：將甘油管中的酵母菌在YPD固體培養(yǎng)基上劃線活化，28 ℃條件下培養(yǎng)48 h，連續(xù)活化三代至長勢良好。

種子液的制備：將活化好的單菌落接種于5mLYPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)24 h；按2%（V/V）的接種量接種于50 mL YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)24 h得到種子液。

按2%（V/V）的接種量將種子液接種于YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)24 h，4 ℃條件下經(jīng)5 000×g離心10 min，收集菌泥，無菌生理鹽水清洗3次后，用無菌生理鹽水重懸。按2%（V/V）的接種量將菌種重懸液分別接種于YPD液體培養(yǎng)基、Phy+液體培養(yǎng)基及Phy-液體培養(yǎng)基，于28 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)24 h，采用分光光度計(jì)調(diào)整培養(yǎng)液的OD600nm值=0.1；將菌種重懸液梯度稀釋，吸取100 μL分別涂布于YPD固體培養(yǎng)基、Phy+固體培養(yǎng)基及Phy-固體培養(yǎng)基，于28 ℃條件下培養(yǎng)，三種培養(yǎng)基中均生長的菌株為可分解植酸鹽的酵母菌。

1.3.3 分解植酸鹽能力的測定

將篩選得到的酵母菌的種子液按2%（V/V）的接種量接種于Phy液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)。用Phy液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基將培養(yǎng)液具體濃度稀釋到108CFU/mL，吸取100 μL于Phy+固體培養(yǎng)基中的牛津杯中，在28 ℃條件下培養(yǎng)，采用游標(biāo)卡尺分別測定培養(yǎng)24 h和48 h的透明圈直徑。透明圈直徑＞1 cm被認(rèn)為具有分解植酸鹽的能力[6]。

1.3.4 菌株的鑒定

（1）形態(tài)觀察[11]

對(duì)篩選菌株的菌落形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)、繁殖方式進(jìn)行觀察。

（2）生理生化試驗(yàn)[11]

通過糖發(fā)酵試驗(yàn)、碳源同化試驗(yàn)、氮源同化試驗(yàn)、類淀粉化合物生成試驗(yàn)、產(chǎn)酯試驗(yàn)、產(chǎn)酸試驗(yàn)等生理生化特征對(duì)篩選菌株進(jìn)行鑒定。

（3）分子生物學(xué)鑒定[12-13]

將篩選得到的菌株接種于YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃條件下培養(yǎng)36 h，取1 mL菌液，12 000 r/min離心1 min，收集菌泥，采用酵母菌基因組脫氧核糖酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒（離心柱型）提取DNA。以基因組DNA為模板，使用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）對(duì)菌株的5.8 S rDNA ITS區(qū)域序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：DNA模板2 μL，ITS 1（10 μmol/L）2 μL，ITS 4（10 μmol/L）2 μL，2×TaqPCR MasterMix 25 μL，加雙蒸水（ddH2O）補(bǔ)充至50 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸50 s，共36個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收后送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結(jié)果在美國國家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對(duì)，選取同源性較高的模式菌株的5.8 SrDNAITS區(qū)域序列，采用MEGA軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.5 菌株耐酸耐膽鹽能力的測定[14]

按照2%（V/V）的接種量將種子液接種于YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)24 h至對(duì)數(shù)期末期形成菌種原液。將200 μL制備好的菌種原液分別加入pH 4.0和含0.3%膽鹽的10 mL YPD液體培養(yǎng)中，混勻后置于28 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)2 h、4 h后取出，菌種原液中活菌數(shù)為初始菌落，使用平板計(jì)數(shù)法測得菌落數(shù)，并計(jì)算存活率，其計(jì)算公式如下：

式中：N0為初始菌落數(shù)，CFU/mL；N1和N2分別是模擬胃液2 h和模擬腸液4 h后的菌落數(shù)，CFU/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 分解植酸鹽酵母菌的分離和篩選

通過YPD培養(yǎng)基從12份發(fā)酵駝乳中共分離純化得到284株酵母菌，通過Phy+培養(yǎng)基及Phy-培養(yǎng)基初步篩選得到15株可分解植酸鹽的酵母菌，菌株編號(hào)分別為D7-10、DW1-1、D7-6、G1-16、DY1-13、G1-10、TY1-2、BJ9-4、BJ9-5、BJ9-12、DY1-2、TS1-1、TXMY1-2、B13-3和H1-3。

2.2 分解植酸鹽能力的測定

對(duì)15株酵母菌分解植酸鹽的能力進(jìn)行測定。結(jié)果見圖1。

圖1 15株酵母菌分解植酸鹽能力的測定結(jié)果Fig.1 Determination results of phytate degradation ability of 15 strains of yeast

由圖1可知，除酵母菌B13-3、DW1-1、TXMY1-2和TY1-2不能形成透明圈外，其余酵母菌都可形成透明圈，且培養(yǎng)48 h時(shí)的透明直徑顯著大于24 h的透明圈直徑（P＜0.01），其中酵母菌H1-3僅在培養(yǎng)48 h時(shí)才形成透明圈。在培養(yǎng)48 h時(shí)，各酵母菌的透明圈直徑差異不顯著（P＞0.05）。結(jié)果表明，可分解植酸鹽的酵母菌有11株。

2.3 可分解植酸鹽酵母菌株的鑒定

2.3.1 形態(tài)觀察及生理生化試驗(yàn)結(jié)果

11株可分解植酸鹽酵母菌株的菌落形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)、繁殖方式見表1，生理生化試驗(yàn)結(jié)果見圖2。

表1 11株酵母菌菌株的形態(tài)觀察結(jié)果Table 1 Results of morphology observation of 11 strains of yeast

由表1可知，除菌株H1-3外，其余10株酵母菌的菌落均為乳白色，表面干燥，而菌株H1-3的菌落為乳黃色且表面光滑；大部分菌株菌落邊緣整齊，少數(shù)菌株呈不規(guī)則圓形；大部分菌株細(xì)胞形態(tài)呈橢圓，少數(shù)呈棒狀；繁殖方式為裂殖或芽殖。

圖2 11株酵母菌生理生化試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Results of physiological and biochemical tests of 11 strains of yeast

由圖2可知，所有菌株不可發(fā)酵麥芽糖、不可同化硝酸鉀和亞硝酸鈉；除菌株H1-3外，其余菌株不可發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、乳糖，不可同化蔗糖、乳糖、麥芽糖和棉子糖。

結(jié)合表1酵母菌的菌落形態(tài)和圖2生理生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果，并查閱《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》[13]，初步將分離到的11株菌株歸屬于3個(gè)不同的屬，即酵母菌D7-10、D7-6、G1-16、DY1-13、G1-10、BJ9-4、BJ9-12和TS1-1為畢赤酵母屬（Pichia）；酵母菌H1-3為克魯維酵母屬（Kluyveromyces）；酵母菌BJ9-5、DY1-2為地霉屬（Geotrichum）。

2.3.2 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

11株可分解植酸鹽的酵母菌的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。

圖3 基于5.8S rDNA ITS1/ITS2區(qū)域序列11株菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of 11 strains based on 5.8S rDNA ITS1/ITS2 regional sequences

由圖3可知，菌株D7-10、D7-6、G1-16、DY1-13、G1-10、BJ9-4、BJ9-12和TS1-1均與庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）聚于一支，親緣關(guān)系最近；菌株BJ9-5和DY1-2均與白地霉（Geotrichum candidum）聚于一支，親緣關(guān)系最近；菌株H1-3與乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）聚于一支，親緣關(guān)系最近。結(jié)合形態(tài)觀察及生理生化試驗(yàn)結(jié)果，鑒定菌株D7-10、D7-6、G1-16、DY1-13、G1-10、BJ9-4、BJ9-12、TS1-1均為庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii），菌株BJ9-5、DY1-2均為白地霉（Geotrichum candidum），菌株H1-3為乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）。乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）在我國《可用于保健食品的真菌菌種名單》中。庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）也稱為東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis），可用于發(fā)酵面團(tuán)、酒和醋等[15-16]；白地霉（Geotrichum candidum）在制作霉菌成熟干酪時(shí)可作為次級(jí)發(fā)酵劑分解酯類和酪蛋白形成獨(dú)特風(fēng)味[17]，美國食品藥品監(jiān)督管理（food and drug administration，F(xiàn)DA）規(guī)定這些酵母為一般認(rèn)為安全（generally recognized as safe，GRAS）[18]。

2.4 分解植酸鹽菌株耐酸耐膽鹽能力測定

隨發(fā)酵食品入腸道后，酵母存活、分解植酸鹽，需要耐受胃（極酸）和/或腸（高膽鹽）環(huán)境。11株分解植酸鹽酵母菌株的耐酸存活率與耐膽鹽存活率見表2。

表2 11株酵母菌株的存活率Table 2 Survival rates of 11 strains of yeast

由表2可知，11株菌株對(duì)模擬胃腸道的極端環(huán)境都具有耐受性，耐酸存活率為24.00%～87.89%，耐0.3%膽鹽存活率為40.25%～109.54%。其中菌株BJ9-12在酸和0.3%膽鹽脅迫下存活率分別達(dá)到87.79%和81.50%，具有良好的耐酸耐膽鹽能力；菌株D7-6和DY1-2在膽鹽脅迫下正常生長，具有很強(qiáng)的膽鹽耐受性。

迪娜熱爾·迪力達(dá)西等[7]從新疆傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品乳酪乳清中分離出的東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）在模擬人工胃液中存活率達(dá)到132.22%，乙醇假絲酵母（Candida ethanolica）在模擬腸液中存活率達(dá)到101.27%。肖新云等[19]研究發(fā)現(xiàn)，漢遜德巴利酵母菌（Debaryomyces hansenii）在pH 1.5和0.4%膽鹽下仍然能夠存活，并且在模擬人工胃腸液下，該菌并沒有被抑制反而能夠適應(yīng)性生長繁殖；而一株伯頓畢赤酵母菌（Pichia burtonii）在人工胃液環(huán)境（pH 1.5）培養(yǎng)4 h后存活率達(dá)到42.78%[20]。在本研究中8株畢赤庫德酵母菌只有菌株BJ9-12在耐酸耐膽鹽能力較為突出可見?？梢姴煌N的酵母菌或者同種不同株的酵母菌耐受胃腸環(huán)境脅迫能力呈株特異性。

3 結(jié)論

利用植酸二鉀培養(yǎng)基和植酸鹽透明圈篩選出11株可分解植酸鹽的酵母菌，經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)及分子生物學(xué)鑒定8株為庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii），2株為白地霉（Geotrichum candidum），1株為乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）。其中，庫德畢赤酵母BJ9-12在模擬胃液和腸液中的存活率分別為87.79%和81.50%，培養(yǎng)48 h時(shí)，分解植酸鹽的透明圈直徑為3.45 cm，在發(fā)酵食品中具有良好的應(yīng)用潛力。