血小板功能檢測(cè)的常用方法及容易忽略的影響因素

賈媛 白世茹 李如意 杜榮品

050051 石家莊，河北省人民醫(yī)院心內(nèi)科

動(dòng)脈血栓性疾病是一類全球性疾病，具有發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高的特點(diǎn)，嚴(yán)重危害著人類健康[1]。血小板激活是血栓性疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵步驟，因此抗血小板治療是降低血小板反應(yīng)性，阻止血栓形成的關(guān)鍵方法，也是預(yù)防主要不良心血管事件的有效措施。然而近年來(lái)，隨著新型支架的引入、介入技術(shù)的改進(jìn)及強(qiáng)效抗血小板藥物的出現(xiàn)，大出血的發(fā)生率有所增加。缺血和出血風(fēng)險(xiǎn)都有可能對(duì)預(yù)后產(chǎn)生負(fù)面影響[2]。目前血小板功能檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)和方法尚不統(tǒng)一，且各種方法都存在自身的局限性。因此，各國(guó)學(xué)者都在探索能夠有效檢測(cè)抗血小板療效的工具，希望它能夠預(yù)測(cè)患者發(fā)生不良心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)及評(píng)估出血風(fēng)險(xiǎn)。本文比較目前常用的幾種血小板功能檢測(cè)方法，并對(duì)臨床中容易被忽略的幾個(gè)因素進(jìn)行概述。

1 常用的血小板功能檢測(cè)方法

1.1 光學(xué)比濁法(light transmission aggregometry，LTA)

LTA作為一種檢測(cè)血小板聚集功能的方法，最初在1960年提出，是測(cè)定血小板聚集度的傳統(tǒng)“金標(biāo)準(zhǔn)”。LTA的檢測(cè)原理是將血液通過(guò)離心方法分離出富含血小板的血漿，分別加入不同促聚集物質(zhì)(ADP、膠原、腎上腺素、花生四烯酸等)，由于血小板聚集、沉淀，其透光度增加，用比濁儀檢測(cè)透光度的變化來(lái)評(píng)估血小板的聚集功能。其優(yōu)點(diǎn)為價(jià)格低廉、應(yīng)用廣泛。其缺點(diǎn)為檢測(cè)所需血標(biāo)本量大；沒(méi)有一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化的操作流程，實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性差；并且需專門分離富含血小板的血漿，耗時(shí)耗力。LTA雖是近些年來(lái)檢測(cè)血小板功能最常用的方法，但離心后的血液樣本去除了紅、白細(xì)胞，且離心的過(guò)程也會(huì)導(dǎo)致血小板的激活，因此該方法不能準(zhǔn)確反映體內(nèi)血小板聚集和活化的水平。而且，血脂升高也會(huì)影響血漿透光度，從而影響檢測(cè)結(jié)果，故LTA不適用于高脂血癥患者。

1.2 血栓彈力圖

血栓彈力圖采用全血直接進(jìn)行血小板聚集功能的檢測(cè)。其原理為在體外模擬緩慢靜脈血流，當(dāng)全血被誘導(dǎo)劑激活后，血液凝固成血栓，用感受器測(cè)定血栓形成的時(shí)間和數(shù)量，并由計(jì)算機(jī)繪制血凝速度和強(qiáng)度曲線。其優(yōu)點(diǎn)為操作簡(jiǎn)便、快速，易規(guī)范，重復(fù)性較好。而缺點(diǎn)為與LTA法檢測(cè)結(jié)果的一致性仍有爭(zhēng)議；血栓彈力圖反映動(dòng)態(tài)血液凝固全過(guò)程，因此其主要影響因素包括血小板、凝血因子、纖維蛋白原等血液成分之間的相互作用、血凝的速度、纖維蛋白溶解系統(tǒng)活性的高低等。血栓彈力圖顯示患者的凝血全貌，可在一定程度上輔助指導(dǎo)成分輸血、判斷肝素療效、評(píng)估抗血小板用藥效果和診斷纖溶亢進(jìn)等，從而指導(dǎo)臨床醫(yī)師選擇更加合理的診療方案。

1.3 阻抗法

阻抗法又稱電阻法，其根據(jù)電阻抗原理，通過(guò)放大全血樣品中的阻抗變化來(lái)測(cè)定血漿中血小板聚集程度。工作原理為加入血小板激活劑后，血小板變形并粘附于電極上，導(dǎo)致電流變小。通過(guò)記錄浸泡于全血的電極間微小電流或電阻變化而形成的聚集曲線，觀察體外血小板聚集變化。其優(yōu)點(diǎn)為操作簡(jiǎn)便、需血量少；全血檢測(cè)；無(wú)需處理血樣。而缺點(diǎn)為耗時(shí)長(zhǎng)；對(duì)小聚集物形成不敏感；每次需清洗電極；電極日常維護(hù)要求高。該方法多用于實(shí)驗(yàn)研究，而臨床應(yīng)用較少。

1.4 血管舒張劑刺激磷酸蛋白(vasodilator-stimulated phosphoprotein，VASP)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定

VASP為血小板內(nèi)蛋白質(zhì)，是ADP受體P2Y12下游信號(hào)通路產(chǎn)物，當(dāng)P2Y12受體被ADP激活后，VASP被蛋白激酶磷酸化。其檢測(cè)原理為對(duì)細(xì)胞膜通透處理后，加入抗VASP磷酸化熒光抗體，即可采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)VASP進(jìn)行定量。其優(yōu)點(diǎn)包括P2Y12信號(hào)通路特異性強(qiáng)；與LTA檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性較好；重復(fù)性好；檢測(cè)結(jié)果能夠用于預(yù)測(cè)心腦血管不良事件的發(fā)生。而缺點(diǎn)為操作復(fù)雜，費(fèi)用較貴。因流式細(xì)胞儀測(cè)定需要特異的抗體，且流式技術(shù)檢測(cè)費(fèi)用昂貴，故該檢測(cè)方法目前多用于實(shí)驗(yàn)研究而尚未在臨床上常規(guī)開展。

1.5 Verify-Now快速血小板功能分析儀

Verify-Now是目前歐美國(guó)家應(yīng)用較多的血小板功能檢測(cè)方法。檢測(cè)原理：在一個(gè)試劑盒內(nèi)混有3種血小板激活劑之一(ADP、花生四烯酸、凝血酶受體激活肽)和纖維蛋白原包被的小珠。加入全血后血小板受激活劑作用而活化，其表面Ⅱb/Ⅲa受體復(fù)合物與小珠表面的纖維蛋白原交聯(lián)，使血小板聚集于小珠表面，試劑盒內(nèi)透光性增強(qiáng)。其優(yōu)點(diǎn)為操作簡(jiǎn)便、快速；床旁檢測(cè)；需血量少；全血檢測(cè)，無(wú)需處理血樣；可分別檢測(cè)阿司匹林、氯吡格雷、Ⅱb/Ⅲa受體拮抗劑的效應(yīng)。而缺點(diǎn)為無(wú)調(diào)校方法，價(jià)格貴。目前國(guó)外多項(xiàng)關(guān)于血小板功能檢測(cè)的大型研究均采用此種檢測(cè)方法。

1.6 PFA-200血小板功能分析儀

血小板功能分析儀(PFA)檢測(cè)原理：將檢測(cè)管中的全血標(biāo)本吸入富含膠原纖維、腎上腺素或ADP等血小板聚集誘導(dǎo)劑的孔隙，在剪切力的作用下，測(cè)定血小板血栓封閉孔隙所需的時(shí)間(封閉時(shí)間)來(lái)反映血小板的聚集率。其優(yōu)點(diǎn)為床旁檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)間短，檢測(cè)樣本量少。而缺點(diǎn)為操作流程繁瑣，標(biāo)準(zhǔn)化差。

1.7 P選擇素

P選擇素是一種在活化血小板和內(nèi)皮細(xì)胞表面起粘附分子作用的蛋白。檢測(cè)原理：血小板活化導(dǎo)致P選擇素轉(zhuǎn)移到細(xì)胞表面，利用流式細(xì)胞法定量檢測(cè)血小板P選擇素的表達(dá)。相關(guān)研究已經(jīng)證實(shí)，循環(huán)中可溶性P選擇素與血管性疾病的診斷和預(yù)后相關(guān)。與其他測(cè)試不同的是，它的優(yōu)點(diǎn)在于血液樣本可以固定保存且測(cè)試時(shí)間在28 d(甚至35 d)內(nèi)有效。而缺點(diǎn)為P選擇素的表達(dá)在個(gè)體之間有很大的差異，且沒(méi)有一個(gè)固定的界值[3](表1)。

表1 常用血小板功能檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)

2 各種檢測(cè)方法之間的相關(guān)性

ten Berg博士牽頭的POPULAR研究入選擇期經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)患者，給予阿司匹林和氯吡格雷雙聯(lián)抗血小板治療，分別比較了LTA、Verify-Now、Plateletworks、IMPACT-R、PFA-100、改良PFA P2Y共6種血小板功能檢測(cè)方法，結(jié)果顯示，僅LTA、Verify-Now和Plateletworks的檢測(cè)結(jié)果與臨床結(jié)局顯著相關(guān)，但各種血小板功能檢測(cè)方法總體預(yù)測(cè)價(jià)值不高，各方法的曲線下面積(AUC)為0.50～0.63，敏感度和特異度均<65%，并且這些檢測(cè)方法均不能預(yù)測(cè)患者的出血風(fēng)險(xiǎn)[4]。因此，不同血小板功能檢測(cè)方法的總體臨床預(yù)測(cè)價(jià)值并不高。

王曦等[5]的研究證實(shí)了各種方法之間具有明顯的相關(guān)性，LTA與血栓彈力圖的相關(guān)系數(shù)為0.6(P<0.05)，LTA與Verify-Now的相關(guān)系數(shù)為0.693，血栓彈力圖與Verify-Now的相關(guān)系數(shù)為0.564(均為P<0.05)。RECLOSE 2-ACS研究納入了1 789例急性冠狀動(dòng)脈綜合征患者，在接受負(fù)荷劑量氯吡格雷治療的患者中，用LTA檢測(cè)殘余血小板反應(yīng)性，并隨訪2年終點(diǎn)事件，發(fā)現(xiàn)高殘余血小板反應(yīng)活性與主要不良心血管事件的發(fā)生密切相關(guān)(P<0.001)[6]。楊雅薇等[7]的研究顯示，Verify-Now與血栓彈力圖、VASP、PL-11檢測(cè)的血小板抑制率結(jié)果有一定的相關(guān)性，其中PL-11系統(tǒng)的敏感性和特異性最高。Zhang等[8]的一項(xiàng)關(guān)于血小板功能檢測(cè)對(duì)經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)后患者臨床預(yù)后影響的薈萃分析顯示，LTA、MEA對(duì)主要不良心血管事件的預(yù)測(cè)作用較明確，但Verify-Now和VASP的預(yù)測(cè)作用有待進(jìn)一步證實(shí)。

常規(guī)抗血小板治療過(guò)程中，一般無(wú)需進(jìn)行血小板功能測(cè)定，對(duì)特殊高?；颊哂绕涫侨毖唢L(fēng)險(xiǎn)或調(diào)整抗血小板治療策略時(shí)，應(yīng)進(jìn)行血小板功能檢測(cè)，以幫助提升抗血小板藥物療效及用藥安全性。從血小板聚集成血栓的過(guò)程需要經(jīng)過(guò)血小板粘附、聚集、收縮、分泌、釋放及凝血因子參與等多個(gè)步驟，血小板被激活后不僅影響凝血系統(tǒng)，還介導(dǎo)白細(xì)胞激活及組織因子表達(dá)，以上諸多復(fù)雜效應(yīng)并不能單憑血小板聚集率這單一指標(biāo)顯示。不可否認(rèn)，血小板功能檢測(cè)是評(píng)價(jià)抗血小板藥物療效的參考指標(biāo)之一，但采用血小板反應(yīng)性評(píng)價(jià)血小板功能還是不夠的。各檢測(cè)機(jī)構(gòu)應(yīng)根據(jù)自身?xiàng)l件及不同檢測(cè)手段各自的優(yōu)缺點(diǎn)，開展相應(yīng)的血小板功能檢測(cè)。LTA法作為最經(jīng)典的血小板功能檢測(cè)方法，是診斷血小板功能缺陷病、監(jiān)測(cè)抗血小板治療、評(píng)價(jià)其他方法的“金標(biāo)準(zhǔn)”，根據(jù)目前國(guó)內(nèi)的應(yīng)用現(xiàn)狀，建議以LTA法為基礎(chǔ)，輔以血栓彈力圖、Verify-Now或PFA-200等其他手段。

3 臨床上容易被忽略的影響血小板功能檢測(cè)的因素

3.1 吸煙

吸煙與心肌梗死后更好的預(yù)后相關(guān)，這一悖論在溶栓時(shí)代被描述為“吸煙者悖論”。最近，這個(gè)術(shù)語(yǔ)也被用來(lái)描述吸煙與血小板功能的關(guān)系。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，臨床上口服氯吡格雷的吸煙患者比不吸煙患者顯示出更低的殘余血小板反應(yīng)性，這一現(xiàn)象通常歸因于：(1)吸煙引起的氯吡格雷活性代謝物產(chǎn)量增加；(2)吸煙者的高血紅蛋白水平。不過(guò)，The GEPRESS研究檢測(cè)了718例接受經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)的非ST段抬高型心肌梗死患者在口服氯吡格雷之前和之后1個(gè)月時(shí)的血小板功能，否定了以上兩種原因[9]。目前這種現(xiàn)象的機(jī)制尚不明確，需要進(jìn)一步研究。

3.2 標(biāo)本運(yùn)輸過(guò)程中震蕩

血小板最大聚集率和平均聚集率是臨床上判斷抗血小板聚集藥物療效的重要指標(biāo)，相關(guān)研究提示，震蕩后血小板最大聚集率和平均聚集率高于震蕩前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明震蕩容易造成血小板體外激活，使血小板功能檢測(cè)結(jié)果偏高。故在標(biāo)本運(yùn)輸過(guò)程中應(yīng)避免不當(dāng)?shù)恼鹗?，以免影響臨床對(duì)患者血小板功能的評(píng)估[10]。

3.3 標(biāo)本放置時(shí)間

程衛(wèi)紅[11]對(duì)70名健康人采集血液標(biāo)本后，應(yīng)用全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)隨著放置時(shí)間的推移，血小板的各項(xiàng)實(shí)際檢測(cè)值隨之升高，尤其是在采集4 h后最為顯著。朱遠(yuǎn)等[12]研究了不同放置時(shí)間對(duì)血小板功能檢測(cè)儀PL-11結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)花生四烯酸誘導(dǎo)血小板聚集受時(shí)間影響較小，但ADP與膠原誘導(dǎo)血小板聚集隨著標(biāo)本放置時(shí)間的延長(zhǎng)，血小板聚集率降低。因此，應(yīng)用PL檢測(cè)血小板功能時(shí)，花生四烯酸誘導(dǎo)應(yīng)在采血后4 h內(nèi)完成，ADP和膠原誘導(dǎo)應(yīng)在采血后2 h內(nèi)完成。有關(guān)LTA檢測(cè)血小板功能的研究推薦，檢測(cè)時(shí)間最好為采血后30 min至2 h，不能超過(guò)4 h[13]。

3.4 體育鍛煉

Lundberg等[14]的一項(xiàng)橫斷面研究探討了運(yùn)動(dòng)對(duì)抗血小板療效的影響，發(fā)現(xiàn)經(jīng)常運(yùn)動(dòng)者血小板基礎(chǔ)反應(yīng)性較低，對(duì)前列環(huán)素的抗聚合作用更敏感，雙聯(lián)抗血小板治療更有效。因此，積極的體育運(yùn)動(dòng)會(huì)增加血小板對(duì)藥物的敏感性，建議在個(gè)性化和優(yōu)化抗血栓治療策略時(shí)，適當(dāng)進(jìn)行體育鍛煉。

4 血小板功能檢測(cè)的新進(jìn)展

實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在家兔全血中加入抗原抗體復(fù)合物時(shí)，凝血時(shí)間明顯縮短，而不含血小板的血漿則無(wú)此現(xiàn)象，這是因?yàn)槊庖邚?fù)合物使補(bǔ)體活化進(jìn)而通過(guò)免疫粘著導(dǎo)致血小板聚集。血小板血栓形成與補(bǔ)體激活過(guò)程相似，兩個(gè)系統(tǒng)之間可以交叉激活。Sauter等[15]發(fā)現(xiàn)了冠狀動(dòng)脈疾病患者血小板上激活的糖蛋白Ⅱb/Ⅲa和血小板補(bǔ)體C3aR共同表達(dá)的情況，且血小板補(bǔ)體C3aR的表達(dá)與糖蛋白Ⅱb/Ⅲa的活化呈正相關(guān)。血小板上的C3a/C3aR軸可調(diào)節(jié)血栓形成的不同步驟，其機(jī)制是補(bǔ)體片段C3a活化后C3aR介導(dǎo)的信號(hào)調(diào)控Rap1b的激活，促進(jìn)血小板聚集和血栓形成。以上研究均表明，補(bǔ)體活化可能激活血小板進(jìn)而導(dǎo)致血栓形成，強(qiáng)調(diào)了心血管疾病中補(bǔ)體失調(diào)激活的有害作用，提示我們可進(jìn)一步研究參與動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成的補(bǔ)體成分。血小板激活的機(jī)制、參與血小板激活的受體等信號(hào)分子在病理性血栓形成、生理性止血過(guò)程中的作用非常復(fù)雜，明確這些信號(hào)分子的作用，應(yīng)有助于研發(fā)更理想的血小板功能測(cè)定方法。

5 展望

近年報(bào)告的關(guān)于血小板功能檢測(cè)對(duì)臨床心血管事件預(yù)測(cè)作用的幾個(gè)大型臨床試驗(yàn)ANTARCTIC、ARCTIC、GRAVITAS和TriggerPCI均以陰性結(jié)果收尾，因此各國(guó)的抗血小板治療指南不推薦將血小板功能檢測(cè)作為常規(guī)檢測(cè)，僅可適當(dāng)用于部分缺血高危患者。雖然大型試驗(yàn)的陰性結(jié)果使血小板功能檢測(cè)技術(shù)處在一個(gè)低迷時(shí)期，不過(guò)眾多研究證實(shí)了血小板高反應(yīng)性與經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療后血栓事件(尤其是支架內(nèi)血栓)具有強(qiáng)相關(guān)性，可用于預(yù)測(cè)臨床缺血事件的發(fā)生[16]。這與相關(guān)理論和大量臨床經(jīng)驗(yàn)均吻合。

人體內(nèi)血栓形成的環(huán)境非常復(fù)雜，當(dāng)前的血小板功能檢測(cè)只能從某一方面或幾個(gè)方面反映血小板受抑制的程度，并不能反映出體內(nèi)血小板功能的真實(shí)水平。理想的檢測(cè)方法應(yīng)該滿足以下幾點(diǎn)：經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性良好，執(zhí)行過(guò)程標(biāo)準(zhǔn)化，能夠提供最佳的抗血小板的治療范圍。近年來(lái)有關(guān)抗血小板新靶點(diǎn)受體(如血小板上的C3a/C3aR軸)的出現(xiàn)為臨床檢測(cè)血小板功能提供了新思路。同時(shí)，我們期待更理想的新型血小板功能檢測(cè)方法的出現(xiàn)。

利益沖突：無(wú)