砷暴露的體外及體內(nèi)微核試驗研究

鄭艷艷，謝晶，甘永金，梁丹玉，李羨筠

廣西壯族自治區(qū)職業(yè)病防治研究院中毒與毒理研究所，廣西 南寧 530021

20世紀(jì)90年代開始，用微核技術(shù)檢測化學(xué)致癌物對細(xì)胞的遺傳損傷研究得到了發(fā)展[1-2]。已有大量數(shù)據(jù)表明，砷可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[3-5]。為了進(jìn)一步了解砷的遺傳損傷作用，本研究采用體外胞質(zhì)分裂阻滯法微核試驗及體內(nèi)外周血嗜多染紅細(xì)胞微核試驗觀察不同劑量砷暴露引起的微核率改變。

1 材料與方法

1.1 體外實驗

1.1.1 材料 正常人肝素鈉抗凝外周血；RPMI1640培養(yǎng)基(中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供)；亞砷酸鈉(NaAsO2，廣州化學(xué)試劑廠)；細(xì)胞松弛素B(CytoB，Sigma)；甲醇、冰醋酸為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 試驗方法 在4.5 mL RPMI1640培養(yǎng)基中取加入正常人抗凝血0.4 mL及0.1 mL不同濃度的NaAsO2溶液(砷終濃度為0 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L、400 μg/L)，置37℃培養(yǎng)至72 h 收獲細(xì)胞(44 h 時加入終濃度為6 μg/mL 細(xì)胞松弛素B)，用常規(guī)方法制片，Giemsa染色后封片保存。在油鏡下計數(shù)結(jié)構(gòu)完整、著色清晰的雙核淋巴細(xì)胞微核數(shù)。

1.2 體內(nèi)實驗

1.2.1 材料 實驗動物為體質(zhì)量25～30 g 的無特定病原體動物(SPF)級ICR 雄性小鼠40 只，由湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司提供[許可證號：SCXK(湘)2016-0002]。本實驗室取得廣西壯族自治區(qū)科技廳頒發(fā)的《實驗動物使用許可證》，許可證號：SYXK桂2016-0005。

1.2.2 試驗方法 將ICR 雄性小鼠40 只應(yīng)用完全隨機化的方法分為陰性對照組、10 mg/(kg·bw)組、20 mg/(kg·bw)組、30 mg/(kg·bw)組，每組10 只，亞砷酸鈉按劑量要求經(jīng)口灌胃染毒，隔天染毒1次，共染毒3次，陰性對照組給予生理鹽水。末次染毒后第3天從動物尾靜脈采集外周血用血涂片法直接涂片，空氣干燥后放入甲醇固定10 min，Giemsa染色后在油鏡下觀察嗜多染紅細(xì)胞的微核。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 利用SPSS13.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計數(shù)資料進(jìn)行χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度NaAsO2對體外淋巴細(xì)胞微核的影響 由表1 可見，體外胞質(zhì)分裂阻滯法微核試驗中雙核淋巴細(xì)胞在砷終濃度為200 μg/L、400 μg/L 時的微核率高于0 μg/L，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=125.856，P＜0.05)。雙核淋巴細(xì)胞的微核率隨含砷濃度增加，微核率呈線性增多。圖1 為含有1 個微核的雙核淋巴細(xì)胞。

表1 不同濃度NaAsO2的體外淋巴細(xì)胞微核試驗結(jié)果

圖1 含微核的雙核淋巴細(xì)胞(×100)

2.2 不同濃度NaAsO2對體內(nèi)微核的影響 體內(nèi)試驗經(jīng)口給予亞砷酸鈉后，20 mg/(kg·bw)、30 mg/(kg·bw)劑量組受試動物出現(xiàn)活動減少、嗜睡等中毒癥狀，出現(xiàn)個別動物死亡。由表2可見，體內(nèi)微核試驗外周血嗜多染紅細(xì)胞微核率30 mg/(kg·bw)劑量組明顯高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=13.930，P＜0.05)，并呈劑量-反應(yīng)關(guān)系。圖2為油鏡下觀察的外周血嗜多染紅細(xì)胞，箭頭所指的是含有微核的嗜多染紅細(xì)胞。

表2 不同濃度NaAsO2的體內(nèi)微核試驗結(jié)果

圖2 油鏡下外周血嗜多染紅細(xì)胞(箭頭所指為有微核的嗜多染紅細(xì)胞，×100)

3 討論

微核是由具有遺傳損傷的物質(zhì)作用于細(xì)胞后導(dǎo)致染色體斷裂或整條染色體丟失形成的。微核試驗是國際上公認(rèn)用于篩選遺傳損傷物質(zhì)的毒理學(xué)試驗，可分為體內(nèi)試驗和體外試驗。

體外淋巴細(xì)胞微核試驗是將受試物暴露于淋巴細(xì)胞，37℃培養(yǎng)，加入植物血凝素促其分裂增殖，利用細(xì)胞松弛素B 抑制細(xì)胞胞質(zhì)分裂但不影響細(xì)胞核分裂，再觀察雙核淋巴細(xì)胞微核率，反映出受試物在染色體水平上所受到的遺傳損傷。體內(nèi)微核試驗是通過適當(dāng)染毒方法給予受試物后，觀察動物外周血嗜多染紅細(xì)胞微核發(fā)生率，以評價受試物發(fā)生突變的可能性。在紅細(xì)胞系祖細(xì)胞分裂期如有遺傳損傷的物質(zhì)作用會導(dǎo)致中期染色體分裂異常形成微核，有核紅細(xì)胞發(fā)生脫核形成無核的紅細(xì)胞過程中胞漿中的微核并不能通過脫核排出，殘留于紅細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中，形成攜帶微核的嗜多染紅細(xì)胞[6]。由于嗜多染紅細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)含有核糖體，成熟紅細(xì)胞核糖體已消失，可通過選擇性的染色即Giemsa 染色將嗜多染紅細(xì)胞染成灰藍(lán)色，而成熟紅細(xì)胞染成淡橘紅色，通過顯微鏡下觀察細(xì)胞顏色的不同將兩種細(xì)胞區(qū)別開來。

隨著經(jīng)濟的不斷發(fā)展，砷化物的開采、冶煉等不斷增加，砷雖是個古老的毒物，但砷對人類健康造成的危害不容忽視。砷可阻止細(xì)胞呼吸，導(dǎo)致細(xì)胞代謝發(fā)生障礙，對多種酶有抑制作用，流行病學(xué)資料顯示，砷暴露人群可導(dǎo)致DNA 損傷等明顯的細(xì)胞遺傳毒性[7-11]。長期暴露砷可導(dǎo)致自然流產(chǎn)、試產(chǎn)、早產(chǎn)發(fā)生率及低出生體重危險度顯著升高，長期吸入高濃度大于100 ng/m3砷死產(chǎn)OR 值高達(dá)8.4[12]。國際癌癥研究機構(gòu)將無機砷確認(rèn)為人類致癌物，但砷致癌流行病研究和動物試驗結(jié)果并不完全相同。為減少人群混雜因素的影響，本研究在實驗室單一條件下分別進(jìn)行體內(nèi)和體外微核試驗，體外試驗用胞質(zhì)分裂阻滯法微核試驗研究砷暴露引起的淋巴細(xì)胞遺傳損傷，試驗結(jié)果表明砷終濃度為200 μg/L、400 μg/L 的條件下，淋巴細(xì)胞雙核微核率明顯增加。在試驗過程中發(fā)現(xiàn)高濃度砷暴露可導(dǎo)致淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率下降，細(xì)胞死亡現(xiàn)象明顯，雙核淋巴細(xì)胞容易觀察到多個微核出現(xiàn)，且容易觀察到核質(zhì)橋和核芽，核質(zhì)橋和核芽是近期發(fā)現(xiàn)的早期染色體損傷的生物學(xué)標(biāo)志，核質(zhì)橋是基因錯誤修復(fù)的標(biāo)志，而核芽是基因擴增的標(biāo)志[13]。試驗中高濃度砷暴露出現(xiàn)的核質(zhì)橋和核芽的改變將成為下一步研究的重點。體外微核試驗的優(yōu)點是直接或間接誘導(dǎo)DNA損傷，判斷有無誘發(fā)染色體異常的毒理效應(yīng)，但體外試驗是一種非正常生理條件下的實驗，因此在實驗設(shè)計時增加了體內(nèi)微核試驗。體內(nèi)微核試驗以ICR 雄性小鼠為研究對象，實驗動物經(jīng)口灌胃給予亞砷酸鈉后，通過觀察動物外周血嗜多染紅細(xì)胞微核率的發(fā)生情況，判斷砷暴露引起的遺傳損傷，體內(nèi)試驗結(jié)果表明，嗜多染紅細(xì)胞微核隨著染毒劑量的增加而增加，呈劑量-反應(yīng)關(guān)系。本次通過體內(nèi)體外兩種方式分別研究砷暴露的遺傳損傷，其結(jié)果均提示砷可導(dǎo)致遺傳損傷。