霍山石斛多酚氧化酶活力測定條件的優(yōu)化

張珍林，孫 立，王夢荷，劉 帥

(1.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安 237012；2.植物細(xì)胞工程安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽 六安 237012；3.安徽省中藥資源保護(hù)與持續(xù)利用工程實(shí)驗(yàn)室，安徽 六安 237012)

霍山石斛(學(xué)名：DendrobiumhuoshanenseC. Z. Tang et S. J. Cheng)俗稱米斛，是中國特有、蘭科石斛屬的草本植物，為國家一級保護(hù)植物，中國國家地理標(biāo)志產(chǎn)品[1](P117)。主要產(chǎn)于安徽省霍山縣，屬大別山區(qū)，大多成長于云霧繚繞的絕壁上，崖石縫隙間和高大樹木之上，山地林中樹干上或者山谷中巖石上[2]。

據(jù)《中華人民共和國藥典》記載[3](P70)，霍山石斛鮮品能大幅度地提高人體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)水平，有效地延緩衰老，對過度熬夜、經(jīng)常用腦、吸煙飲酒太過，身虛力乏者，頻繁食用十分相宜。而且霍山石斛鮮品對眼睛有明目作用，甚至能起到調(diào)和陰陽、壯陽補(bǔ)腎以及美容養(yǎng)顏之功效。所以近年來，模擬霍山石斛自然生長環(huán)境的大棚種植在不斷增加，產(chǎn)量得到了大幅度增高，但貯藏保鮮及商品化處理技術(shù)仍跟不上鮮品上長的量，霍山石斛采后鮮品的狀況仍未有很好的改善，多數(shù)只能采用干制技術(shù)來提高保存期[4-5]，這也使得霍山石斛產(chǎn)品價格偏高。因此，研究霍山石斛鮮品的保鮮手法和工藝，延長其有效保鮮期，對促進(jìn)霍山石斛鮮品產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有深遠(yuǎn)確切的意義。

大量研究認(rèn)為，植物鮮品不易保藏，這和病理、生理因素分不開[6-8]，也和鮮品不同采收期分不開[9-10]。研究霍山石斛在不同生長階段體內(nèi)活性物質(zhì)的變化，這和過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)主要體系酶關(guān)系極為密切，酶是霍山石斛鮮品抗氧化作用功效體現(xiàn)的物質(zhì)基礎(chǔ)，但也是易導(dǎo)致植物體采后褐變，品質(zhì)變差的物質(zhì)基礎(chǔ)，所以，鈍化酶的活性在生產(chǎn)上常見，主要用超高壓熱燙、高溫?zé)釥C、低溫冷藏以及氣調(diào)保鮮等技術(shù)手段，以其達(dá)到滅酶保鮮[11]。

本實(shí)驗(yàn)旨在研究提取不同生長期采收的霍山石斛主要酶以及測定酶活，為深入了解霍山石斛生長過程中主要酶活性動態(tài)變化情況，以及實(shí)體加工業(yè)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

霍山石斛一年生鮮條、三年生鮮條，由皖西學(xué)院安徽省中藥資源保護(hù)與持續(xù)利用工程中心提供。

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、聚乙烯吡絡(luò)烷酮(PVP)、鄰苯二酚、30%飽和度硫酸銨等均為分析純，購于國藥化學(xué)集團(tuán)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、高速組織搗碎機(jī)(上海凈信實(shí)驗(yàn)設(shè)備科技部)、SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水真空泵、ZMD-2型電子分析天平、DHG-9101-1型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、HH-4C型數(shù)顯恒溫水浴鍋、研缽、TU1901型紫外分光光度計、PHS-25型PH計、LDZX-50KBS型高壓蒸汽滅菌鍋、SW-CJ-IBU型超凈工作臺、MIKRO120型小型臺式高速離心機(jī)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 粗酶液的提取

準(zhǔn)確稱取霍山石斛鮮條一年生、三年生各5.00 g，加入0.5 g不溶性聚乙烯吡咯烷酮(事先用蒸餾水浸洗，然后過濾以除去雜質(zhì))和100 ml 0.1 mol/L磷酸緩沖液，混合并磨成勻漿，使用循環(huán)水式多用真空泵過濾，濾液中加入30%飽和度硫酸銨，用低溫離心機(jī)中5000 r/min離心10 min，分兩次離心，除沉淀，于上清液中再加入硫酸銨使其達(dá)到60%飽和度，再次離心收集沉淀。將所得沉淀溶于2～3 ml 0.01 mol/L磷酸緩沖液中，即得粗制酶液。

1.3.2 酶活性的測定

根據(jù)查閱文獻(xiàn)[12]，確定采用鄰苯二酚法測量霍山石斛多酚氧化酶活力。

在試管中加入3.9 ml 0.05 mol/L磷酸緩沖液，1.0 ml 0.1 mol/L兒茶酚在37 ℃恒溫水浴中保溫10 min，之后加入不同體積酶液進(jìn)行酶活性測定(可視酶活性增減用量)，迅速搖勻，倒入比色皿內(nèi)，將其于525 nm波長處，以時間掃描方式，在1～2 min時間內(nèi)測定吸光度變化(A)值。

1.3.3 酶活力測定條件的優(yōu)化

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)初步研究目的，在測定酶活力過程中，對緩沖溶液的pH值、酶濃度、反應(yīng)溫度、生長年限等單因素進(jìn)行分析，考察單因素最佳范圍，再利用正交試驗(yàn)優(yōu)化單因素，從而獲得多酚氧化酶酶活力最佳測定條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 緩沖溶液pH值

影響多酚氧化酶活力的因素緩沖液的pH值如圖1所示。由圖1得知當(dāng)緩沖溶液的pH從6.0增加到6.5時，酶活力顯著增大。而繼續(xù)增加pH值之后，酶活力反而減小。在pH為6.5的時候，酶活力最大。所以pH為6.5是最佳水平。

圖1 緩沖液的pH值對多酚氧化酶活力的影響

分析實(shí)驗(yàn)中所使用的緩沖溶液pH值對多酚氧化酶活力的影響，可以了解霍山石斛多酚氧化酶適合在中性或偏酸性的條件下存活，pH值過低不適合酶活性激發(fā)，過高也會抑制酶活性，過低過高都不能使酶活性達(dá)到最優(yōu)，所以根據(jù)單因素確定緩沖溶液pH值為6.5時是最優(yōu)酶活力測定值。

2.1.2 反應(yīng)溫度

影響多酚氧化酶活力的因素反應(yīng)溫度如圖2所示?？磮D2得，當(dāng)反應(yīng)溫度從0 ℃上升到40 ℃時，酶活力顯著增大。但是在繼續(xù)升溫之后，酶活力反而會變小。在反應(yīng)溫度為40 ℃的時候，酶活力最大。所以反應(yīng)溫度40 ℃是最佳水平。

圖2 反應(yīng)溫度對多酚氧化酶活力的影響

分析實(shí)驗(yàn)過程中反應(yīng)溫度對多酚氧化酶活力的影響，可以確定溫度的影響也是有最佳條件的，超過或不到最佳條件酶活性不能充分展現(xiàn)，只有在合適的溫度下才能達(dá)到最佳酶活力，本實(shí)驗(yàn)條件下反應(yīng)溫度為40 ℃是最佳。

2.1.3 酶濃度

影響多酚氧化酶活力的因素酶濃度如圖3所示。圖3顯示，在反應(yīng)過程中，隨著加入的酶濃度逐漸增大，整個反應(yīng)體系中酶活力增強(qiáng)。但當(dāng)酶濃度達(dá)到1.0 ml時，再繼續(xù)增加酶濃度，酶活力增加趨于平緩直到不再變化，由此得出當(dāng)酶濃度為1.0 ml時，酶活力達(dá)到最大。

圖3 酶濃度對多酚氧化酶活力的影響

分析酶濃度對多酚氧化酶活力的影響，圖3顯示在一定范圍內(nèi)，酶濃度對酶活力的影響成正比，隨著酶用量的不斷增加，酶活力也逐漸增大。但是當(dāng)酶溶液達(dá)到一定用量時，酶活力增加趨勢平緩，繼續(xù)增加酶濃度酶活力也不會再出現(xiàn)大幅度變化。由此確定霍山石斛多酚氧化酶的酶濃度為1.0 ml時最優(yōu)。

2.1.4 生長年限

霍山石斛生長年限對多酚氧化酶活力的影響如表1所示。由表1看出，從測定兩個生長年限的數(shù)據(jù)，生長年限為1年生的霍山石斛酶活力為28 U，生長年限為3年生的霍山石斛酶活力為72 U，3年生數(shù)據(jù)要明顯大于1年生的數(shù)據(jù)。

表1 生長年限對多酚氧化酶活力的影響

分析表1，可大致判斷，隨著霍山石斛生長年限的增加，多酚氧化酶活性是逐漸增加的，也即是多酚氧化酶酶活力呈現(xiàn)上漲趨勢，且明顯，所以后續(xù)在進(jìn)行正交優(yōu)化酶活力測定條件時僅以3年生霍山石斛為檢測對象。不在作為正交優(yōu)化考慮因素。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 正交分析因素與水平

正交分析因素與水平見表2。

表2 正交分析因素與水平

2.2.2 正交結(jié)果與分析

根據(jù)得到的正交實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計表結(jié)果，見表3。

由表3可知，緩沖液的pH值、多酚氧化酶濃度和反應(yīng)溫度這三個因素的極差大小順序?yàn)锳>C>B，即霍山石斛多酚氧化酶活力測定三主要影響因素的作用大小順序?yàn)椋壕彌_液的pH值>多酚氧化酶濃度>反應(yīng)溫度。霍山石斛多酚氧化酶活力測定的最佳條件為A3B1C2，即緩沖液的pH值為6.5，反應(yīng)溫度為40 ℃，酶濃度為1.0 ml，生長年限為3年，所測得最高酶活力值為39.153 U。

表3 正交分析結(jié)果

3 討論與結(jié)論

石斛的生長需要適宜的自然條件，安徽六安霍山得天獨(dú)厚的地理環(huán)境和氣候優(yōu)勢起到非常重要的作用。植物組織中PPO都具有各自明顯紫外吸收特征，不同植物不同組織中PPO的紫外吸收峰也不相同，如康娟等在絲瓜多酚氧化酶及過氧化物酶酶學(xué)特性的研究中，指出絲瓜PPO的最大吸收波峰為408 nm[13]；趙東海等對蘑菇中多酚氧化酶的酶學(xué)特性研究中，指出蘑菇PPO的最大吸收峰為410 nm[14]。在本實(shí)驗(yàn)中，對霍山石斛PPO的最大吸收峰為525 nm，當(dāng)以鄰苯二酚為底物，濃度為0.1 mol/L，多酚氧化酶濃度為1.0 ml，緩沖液的pH值為6.5、反應(yīng)溫度為40 ℃且生長年限為三年期時活性最高。

PPO作為各種植物的必要成分而存在，對它進(jìn)行深入研究是很有必要，如柳素潔對香蕉多酚氧化酶性質(zhì)及在果酒發(fā)酵中褐變控制的研究，明確了PPO是引起香蕉酶促褐變的主要因素并采取合適方法來抑制[15]；李全文對桑葉多酚氧化酶的提取、純化及其固定化研究，明確了桑葉PPO的制備[16]。霍山石斛是目前研究藥用性質(zhì)極佳的一種多年生草本中藥，具有優(yōu)良的營養(yǎng)和保健價值，但由于種植條件要求高，加工中也存在很多困難，霍山石斛多為楓斗保健飲用，被加工制成其他產(chǎn)品形式的不多，尤其在食品工業(yè)上。霍山石斛加工中也存在酶促褐變，極易使產(chǎn)品品質(zhì)劣變，影響產(chǎn)品市場，深入研究霍山石斛酶促褐變的因素及控制技術(shù)對闡明石斛褐變規(guī)律，促進(jìn)霍山石斛加工技術(shù)的發(fā)展，提高產(chǎn)品的品質(zhì)具有理論和實(shí)際意義，本實(shí)驗(yàn)探討了霍山石斛中PPO的酶學(xué)特性，為后期霍山石斛PPO的分離、提取、純化和霍山石斛新產(chǎn)品的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。