煙草病原菌及其生防菌株對烯酰嗎啉的敏感性

郭 敬，湯玲玲，趙世民，李淑君，康業(yè)斌

(1.河南科技大學(xué) 林學(xué)院，河南 洛陽 471023； 2.河南省洛陽市煙草公司，河南 洛陽 471023；3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 煙草研究所，河南 許昌 461000)

煙草疫霉(Phytophthoranicotianae)、瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、茄病鐮刀菌(Fusariumsolani)分別引起煙草黑脛病、猝倒病、立枯病、根腐病，都屬于土傳病原真菌[1-3]。賀曉輝等[4]采用菌絲生長速率法研究發(fā)現(xiàn)，烯酰嗎啉對云南省德宏州煙草黑脛病有較好的防控效果。劉暢等[5]在山東煙田土壤中篩選到對山東煙草黑脛病有較強(qiáng)拮抗作用的生防菌株，根據(jù)菌株形態(tài)和培養(yǎng)特征、ITS序列分析，鑒定該菌株為哈茨木霉(Trichodermaharzianum)；RAO等[6]通過雙重培養(yǎng)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，哈茨木霉可以抑制瓜果腐霉的生長；SANTAMARINA等[7]研究表明，哈茨木霉對立枯絲核菌具有較好的拮抗作用。HAN等[8]的研究結(jié)果顯示，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)對煙草疫霉具有很強(qiáng)的拮抗作用，可以破壞其菌絲結(jié)構(gòu)，引起菌絲畸形、破裂和原生質(zhì)滲漏；劉丹等[9]綜合分析認(rèn)為，枯草芽孢桿菌可以通過根際定殖競爭、生物膜競爭、抗菌作用、細(xì)胞溶解酶作用誘導(dǎo)系統(tǒng)抗病性，抑制煙草青枯病菌(Ralstoniasolanacearum)；蔡璘等[10]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌對二孢白粉菌(ErysiphecichoracearumDC.)菌絲生長和分生孢子萌發(fā)具有良好的抑制作用。陳倩倩等[11]研究表明，金黃垂直鏈霉菌(Streptomycesaureoverticillatus)對瓜果腐霉、煙草疫霉、尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)具有拮抗作用。尹敬芳等[12]研究表明，烯酰嗎啉-枯草芽孢桿菌菌藥合劑可以協(xié)同防治辣椒疫病(P.capsici)。但在防治煙草病害方面，烯酰嗎啉對瓜果腐霉、立枯絲核菌、茄病鐮刀菌的抑制作用，以及對生防菌株哈茨木霉、枯草芽孢桿菌、金黃垂直鏈霉菌的抑制作用均鮮有報道。鑒于此，測定了煙草病原菌煙草疫霉、瓜果腐霉、立枯絲核菌、茄病鐮刀菌，以及生防菌株哈茨木霉、枯草芽孢桿菌、金黃垂直鏈霉菌對烯酰嗎啉的敏感性，旨在明確煙草病原菌及其生防菌株對烯酰嗎啉的抗藥性水平，為烯酰嗎啉和哈茨木霉、枯草芽孢桿菌或金黃垂直鏈霉菌混合施用防治煙草主要土傳病原真菌提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

煙草病原菌煙草疫霉、瓜果腐霉、立枯絲核菌、茄病鐮刀菌和生防菌株哈茨木霉、枯草芽孢桿菌、金黃垂直鏈霉菌，均由河南科技大學(xué)植物病害分子鑒定與綠色防控實驗室提供。98%烯酰嗎啉購自上海江萊生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 烯酰嗎啉對供試真菌菌絲生長的抑制作用測定 在燕麥(OA)培養(yǎng)基上培養(yǎng)煙草疫霉，在菌落邊緣打取直徑6 mm的菌餅，菌絲面朝下接種到含烯酰嗎啉0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μg/mL的OA平板中央，以不含烯酰嗎啉的OA平板作為對照；在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基上分別培養(yǎng)瓜果腐霉、立枯絲核菌、茄病鐮刀菌、哈茨木霉，在菌落邊緣打取直徑6 mm的菌餅，將瓜果腐霉、立枯絲核菌、茄病鐮刀菌接種到含烯酰嗎啉0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μg/mL的PDA平板中央，哈茨木霉接種到含烯酰嗎啉0.5、1.0、2.0、4.0 μg/mL的PDA平板中央，以不含烯酰嗎啉的PDA平板作為對照。每組處理設(shè)置3個重復(fù)。25 ℃恒溫培養(yǎng)2～5 d后檢查各處理菌絲的生長情況，十字交叉法測量菌落直徑，計算抑制率。比較烯酰嗎啉對各病原菌和生防菌的抑制作用，并運用DPS軟件建立烯酰嗎啉對煙草疫霉的毒力回歸方程，計算抑制其菌絲生長的EC50值。

生長抑制率=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑×100%。

1.2.2 烯酰嗎啉對供試煙草疫霉孢子囊形成和哈茨木霉分生孢子分化的抑制作用測定 將煙草疫霉接種在含烯酰嗎啉0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 μg/mL的OA平板上，以不含烯酰嗎啉的OA平板為對照，培養(yǎng)5～7 d后，在培養(yǎng)皿內(nèi)加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的KNO3溶液濕潤菌絲，25 ℃恒溫培養(yǎng)3 d誘導(dǎo)孢子囊產(chǎn)生，以加入無菌水為對照。在菌落中央打取6個直徑為6 mm的菌餅，在10倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取1個視野觀察菌餅上的孢子囊個數(shù)，計算抑制率，每個質(zhì)量濃度設(shè)置3個重復(fù)。

將烯酰嗎啉加入冷卻至50 ℃的馬鈴薯葡萄糖液體(PD)培養(yǎng)基中，配制成0.5、1.0、2.0、4.0 μg/mL的含藥培養(yǎng)基(100 mL/250 mL)，以不加烯酰嗎啉為對照，加入4塊哈茨木霉菌餅，28 ℃、170 r/min培養(yǎng)10 d后，用2層紗布過濾取上清液，通過血球計數(shù)板觀察分生孢子的個數(shù)，計算抑制率。

孢子(囊)抑制率=[對照孢子(囊)個數(shù)-處理孢子(囊)個數(shù)]/對照孢子(囊)個數(shù)×100%。

1.2.3 烯酰嗎啉對供試拮抗細(xì)菌與放線菌的抑制作用測定 選擇牛肉膏蛋白胨(NA)培養(yǎng)基培養(yǎng)枯草芽孢桿菌,選擇高氏一號培養(yǎng)基培養(yǎng)金黃垂直鏈霉菌。將烯酰嗎啉分別與冷卻至50 ℃的NA、高氏一號培養(yǎng)基混勻，配制成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μg/mL的含毒平板，以不含烯酰嗎啉的平板為對照。每個培養(yǎng)皿加入100 μL適宜質(zhì)量濃度的菌懸液進(jìn)行涂布，每個質(zhì)量濃度3個重復(fù)，28 ℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)1、4 d后，統(tǒng)計各個培養(yǎng)皿內(nèi)的菌落個數(shù)，計算抑制率。

菌落抑制率=(對照菌落數(shù)-處理菌落數(shù))/對照菌落數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草病原菌對烯酰嗎啉的敏感性

2.1.1 煙草疫霉對烯酰嗎啉的敏感性 采用菌絲生長速率法測定煙草疫霉對烯酰嗎啉的敏感性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)，烯酰嗎啉對煙草疫霉菌絲生長具有很好的抑制作用，隨著烯酰嗎啉質(zhì)量濃度的增加，煙草疫霉的菌落直徑逐漸減小(圖1)，當(dāng)烯酰嗎啉的質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL時，對煙草疫霉菌絲生長的抑制率達(dá)到86.76%(表1)。經(jīng)DPS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，煙草疫霉菌絲生長對烯酰嗎啉敏感性的毒力回歸方程為y=3.091 3x+6.020 4，EC50為0.467 6 μg/mL，相關(guān)系數(shù)r為0.994 8。

a.CK; b.0.2 μg/mL; c.0.4 μg/mL; d.0.6 μg/mL; e.0.8 μg/mL; f.1.0 μg/mL

項目Item烯酰嗎啉質(zhì)量濃度/(μg/mL)Concentration of dimethomorph00.20.40.60.81.0抑制率/%Inhibition rate014.4837.5860.7776.2086.76毒力回歸方程Toxic regression equationy=3.091 3x+6.020 4EC50/(μg/mL)0.467 6相關(guān)系數(shù)Correlation coefficient0.994 8

通過孢子抑制法發(fā)現(xiàn)，煙草疫霉孢子囊的形成對烯酰嗎啉敏感。隨著烯酰嗎啉質(zhì)量濃度的增加，煙草疫霉孢子囊數(shù)目逐漸減少(圖2)，當(dāng)烯酰嗎啉質(zhì)量濃度為0.7 μg/mL時，對煙草疫霉孢子囊形成的抑制率為80.0%(表2)，表明烯酰嗎啉可以有效抑制煙草疫霉孢子囊的形成。

2.1.2 瓜果腐霉、立枯絲核菌、茄病鐮刀菌菌絲生長對烯酰嗎啉的敏感性 用菌絲生長速率法測定瓜果腐霉、立枯絲核菌、茄病鐮刀菌對烯酰嗎啉的敏感性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這3種土傳病原真菌菌絲生長對烯酰嗎啉不敏感。隨著烯酰嗎啉質(zhì)量濃度的增加，瓜果腐霉、立枯絲核菌、茄病鐮刀菌菌落直徑?jīng)]有明顯變化(表3)。當(dāng)烯酰嗎啉質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL時，對瓜果腐霉、立枯絲核菌、茄病鐮刀菌菌絲生長的抑制率分別為-2.00%、7.12%、0；烯酰嗎啉質(zhì)量濃度為8.0 μg/mL時，對其菌絲生長的抑制率分別為0、11.02%、4.78%。表明施用烯酰嗎啉防治煙草疫霉時，對瓜果腐霉、立枯絲核菌、茄病鐮刀菌菌絲生長無明顯抑制作用。

a.CK; b.0.1 μg/mL; c.0.2 μg/mL; d.0.3 μg/mL; e.0.4 μg/mL; f.0.5 μg/mL; g.0.6 μg/mL; h.0.7 μg/mL

烯酰嗎啉質(zhì)量濃度/(μg/mL)Concentration of dimethomorph隨機(jī)視野的孢子囊數(shù)/個Number of sporangia in random view抑制率/%Inhibition rate01000.19.673.30.26.3336.70.35.6743.30.44.3356.70.53.4465.60.62.4475.60.72.0080.0

表3 烯酰嗎啉對瓜果腐霉、立枯絲核菌、茄病鐮刀菌菌絲生長的抑制作用

2.2 生防菌株對烯酰嗎啉的敏感性

2.2.1 哈茨木霉菌絲生長及分生孢子分化對烯酰嗎啉的敏感性 通過菌絲生長速率法和孢子抑制法測定生防菌株哈茨木霉對烯酰嗎啉的敏感性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其菌絲生長及分生孢子分化對烯酰嗎啉不敏感。當(dāng)烯酰嗎啉質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL時，對哈茨木霉菌絲生長及分生孢子分化的抑制率分別為-1.67%、-19.00%；烯酰嗎啉質(zhì)量濃度為4.0 μg/mL時，對其菌絲生長及分生孢子分化的抑制率分別為11.98%和28.94%(表4)。表明施用烯酰嗎啉防治煙草疫霉時，可以與生防菌株哈茨木霉聯(lián)合使用。

2.2.2 枯草芽孢桿菌與金黃垂直鏈霉菌對烯酰嗎啉的敏感性 通過稀釋涂布平板法測定發(fā)現(xiàn)，生防菌株枯草芽孢桿菌、金黃垂直鏈霉菌對烯酰嗎啉不敏感。烯酰嗎啉質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL時，對枯草芽孢桿菌、金黃垂直鏈霉菌無明顯抑制作用；烯酰嗎啉質(zhì)量濃度為3.0 μg/mL時，對其抑制率為-10.37%、17.85%(表5)。表明施用烯酰嗎啉防治煙草疫霉時，可以與生防菌株枯草芽孢桿菌或金黃垂直鏈霉菌聯(lián)合應(yīng)用。

表4 烯酰嗎啉對哈茨木霉菌絲生長及分生孢子分化的抑制作用Tab.4 Inhibition of dimethomorph on mycelium growth and conidia differentiation of T.harzianum

表5 烯酰嗎啉對枯草芽孢桿菌和金黃垂直鏈霉菌的抑制作用Tab.5 Inhibition of dimethomorph on B.subtilis and S.aureoverticillatus

3 結(jié)論與討論

烯酰嗎啉為嗎啉類殺菌劑，可用于防治由鞭毛菌亞門卵菌綱真菌引起的蔬菜霜霉病、疫病等病害[13]，可以干擾病原菌細(xì)胞壁聚合體的組裝，抑制菌絲生長，以及孢子囊、游動孢子、休眠孢子的萌發(fā)和游動孢子囊的形成[14]。本試驗結(jié)果表明，烯酰嗎啉顯著抑制了煙草疫霉菌絲生長和孢子囊的產(chǎn)生，對菌絲生長的EC50為0.467 6 μg/mL，與戰(zhàn)徊旭等[15]的研究結(jié)果一致。

單一使用烯酰嗎啉防治煙草黑脛病，易導(dǎo)致煙草疫霉抗藥性發(fā)生[16]。胡燕[17]測定了烯酰嗎啉對煙草疫霉繼代培養(yǎng)物的毒力，結(jié)果表明,煙草疫霉對烯酰嗎啉存在較大的抗藥性風(fēng)險。牟文君等[18]通過煙草疫霉敏感菌株與抗性菌株纖維素合酶基因序列的比對，檢測到纖維素合酶基因CesA3上存在V1109L突變和Q1077H突變，說明煙草疫霉同時存在2種突變位點。

生防菌不僅可以抑制病原菌的生長，而且有促進(jìn)植物生長的作用[19]；但受環(huán)境條件、使用方法等的影響，防效不穩(wěn)定[20]。為了解決生防制劑見效慢、防效不穩(wěn)和化學(xué)殺菌劑存在的抗藥性及農(nóng)藥殘留等問題，可以將生防菌劑和化學(xué)殺菌劑混合使用，起到優(yōu)勢互補、降低農(nóng)藥使用量、增強(qiáng)防效和擴(kuò)大病害防治范圍的作用[21]。牟文君等[22]研究表明， 烯酰嗎啉與氟吡菌胺、解淀粉芽孢桿菌混合使用防治煙草黑脛病，較單獨使用生防菌劑和殺菌劑防效分別提高了22.93%、29.49%。本試驗結(jié)果表明，烯酰嗎啉對供試生防菌株哈茨木霉、枯草芽孢桿菌、金黃垂直鏈霉菌幾乎沒有抑制作用，但烯酰嗎啉與供試生防菌聯(lián)合后的田間防治效果需要進(jìn)一步探究。

烯酰嗎啉對煙草疫霉菌絲生長及孢子囊形成有顯著抑制作用，對煙草疫霉菌絲生長的EC50為0.467 6 μg/mL；烯酰嗎啉質(zhì)量濃度為4.0 μg/mL時，對哈茨木霉菌絲生長及分生孢子分化的抑制率分別為11.98%和28.94%,對瓜果腐霉、立枯絲核菌、茄病鐮刀菌的抑制率分別為-4.60%、3.90%、5.42%；烯酰嗎啉質(zhì)量濃度3.0 μg/mL時，對枯草芽孢桿菌、金黃垂直鏈霉菌的抑制率為-10.37%、17.85%。烯酰嗎啉可以和供試生防菌株聯(lián)合施用防治煙草黑脛病。