土鱉蟲生物活性肽對高脂血癥大鼠腸道菌群調節(jié)作用研究

王少平,姜 珊,趙一慕,林 鶯,張加余,代 龍

(1.濱州醫(yī)學院藥學院,山東 煙臺 264003;2.山東中醫(yī)藥大學藥學院,山東 濟南 250000)

土鱉蟲，最早記載于《神農本草經》，為鱉蠊科昆蟲地鱉(EupolyphagasinensisWalker)及中華冀土鱉(SteleophagaPlancyiBoleny)的干燥雌蟲體，具有活血逐瘀、續(xù)筋接骨的功效[1]?，F(xiàn)代臨床主要用于高血脂、骨折、高尿酸血癥等疾病的治療[2]。土鱉蟲富含蛋白質，經文獻報道土鱉蟲蛋白質占到總蟲體質量的60%[3]。然而，大分子蛋白無法被人體整體吸收，需經胃腸道蛋白消化酶的作用轉變?yōu)樾》肿踊钚噪暮蠓侥鼙晦D運進入人體發(fā)揮藥效作用。而土鱉蟲主要以復方形式經口服給藥方式發(fā)揮藥效作用。因此，本實驗前期基于蛋白質消化原理和土鱉蟲給藥特點提出以胃蛋白酶、胰蛋白酶為酶介質的體外仿生酶解技術。并采用此技術對土鱉蟲蛋白質進行處理得到了土鱉蟲生物活性肽(active peptide ofEupolyphaga，APE)。

高脂血癥為人體常見代謝性疾病之一，臨床表現(xiàn)為血清甘油三酯(triglyceride，TG)、膽固醇(cholesterol，TC)和低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)異常升高；高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)降低[4-6]。大量臨床文獻研究腸道菌群的多樣性可保證脂質的正常吸收與代謝。高脂血癥患者腸道菌群存在不同程度的缺陷。而調整腸道菌群則可降低高脂血癥患者血清內的血脂指數(shù)。這也說明腸道菌群與高脂血癥之間存在緊密聯(lián)系[7-10]。

土鱉蟲作為“活血化瘀”藥物已在臨床應用千年，但是APE是否可以調節(jié)腸道菌群來改善高脂血癥狀，目前未見報道。因此本實驗建立飲食性高脂血癥SD大鼠模型，利用 16S rDNA方法檢測SD大鼠的腸道菌群變化，探討APE對腸道菌群多樣性以及高脂血癥的改善作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑與儀器 土鱉蟲經濱州醫(yī)學院林鶯副教授鑒定為鱉蠊科中華冀土鱉的雌蟲，購自山東省長清土元養(yǎng)殖場；大鼠代謝籠；TC、TG、LDL和HDL生化試劑盒(購自南京建成生物鑒定所提供)；ML104型十萬分一、ME104E型萬分之一天平(梅特勒上海精密儀器公司)、萊卡TD203石蠟包埋機；美國伯樂T90組織切片機；250 mL生理鹽水(山東魯抗醫(yī)藥集團)、600 mL去離子水(浙江娃哈哈純凈水公司)、10 L飲用純凈水(濟南普利斯飲用水公司)、戊巴比妥鈉(國藥試劑有限公司)甲醛、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、濃鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉均為分析級；產自天津富宇化學試劑廠。

1.1.2實驗動物 實驗用SD大鼠，♂；體質量：(180～200) g，由山東省朋悅實驗動物繁育中心提供，生產許可證號：SCXK(魯)20140007。

1.2 實驗方法

1.2.1APE制備 取土鱉蟲藥材500 g，粉粹過80目篩，加入去離子水5 000 mL，加熱煮沸，保持15 min；后放涼至40 ℃，調pH至1.5；加入5.0 g胃蛋白酶，37 ℃酶解1 h。再調pH至8.5，加胰蛋白酶酶解3 h；酶解完成加熱煮沸15 min，冷卻后保存12 h。離心，取上清液，得土鱉蟲粗酶解液。采用電滲析儀器對土鱉蟲粗酶解液進行脫鹽實驗，得土鱉蟲脫鹽液。將土鱉蟲脫鹽液用3 000 ku超濾膜處理，得到APE溶液。

1.2.2肽含量測定

1.2.2.1標準曲線建立 以牛血清白蛋白為對照品，采用文獻報道的folin方法[11]進行肽標準曲線的建立。

1.2.2.2APE含量 取APE溶液50 mL，冷凍干燥機進行干燥，得干燥品，加入適量去離子水溶解。采用“2.2.1”肽標準曲線方法對APE溶液進行肽含量測定。重復6次，計算平均值。

1.2.3高脂血癥大鼠模型建立

1.2.3.1造模方法 SD大鼠，60只；適應性飼養(yǎng)7 d，然后分組，分別為空白組、模型組、辛伐他汀組、土鱉蟲活性高、中、低劑量組，每組10只。給藥劑量為；APE劑量組為1.5、0.75、0.375 g·kg-1。除空白組外，其他各組大鼠采用特定的高脂飼料進行飼養(yǎng)，高脂飼料組成為基礎飼料65%、豬油15%、膽固醇5%、蛋黃10%、膽汁酸鈉5%。持續(xù)造模45 d，于d 46開始，土鱉蟲各組大鼠給予規(guī)定劑量藥物，給藥15 d后取各組大鼠新鮮糞便，肝臟，血清等樣品，所有生物樣品保存至-80 ℃冰箱。

1.2.3.2檢測指標 采用石蠟包埋機和冷凍切片機對各組大鼠肝臟進行處理制得肝臟切片，并結合蘇木精-伊紅(HE)染色方法制得各組大鼠肝臟病理切片，在200倍電子顯微鏡下進行觀察。同時采用TG、TC、LDL和HDL生化試劑盒對各組大鼠血清進行測定。通過肝臟病理變化和血脂四項變化判斷造模情況。

1.2.3.3大鼠菌群測定 取空白組、模型組、APE高劑量組大鼠新鮮糞便，提取腸道微生物 DNA，根據(jù)序列中的保守區(qū)域設計相應引物，并添加樣本特異性Barcode序列，采用NEB公司的Q5高保真DNA聚合酶對rRNA基因可變區(qū)(單個或連續(xù)的多個)或特定基因片段進行PCR擴增。PCR擴增產物通過2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，接著采用lllumina公司的TruSeqNano DNA LT Library Prep Kit制備測序文庫，最后使用MiSeq測序儀進行2×300 bp的雙端測序。

1.2.3.4數(shù)據(jù)處理方法 應用SMCAP15.1軟件(USA；2016)采用組學數(shù)據(jù)處理方法進行基于有效數(shù)據(jù)的OTUs聚類分析，再對所獲得的OTU進行Alpha多樣性和Beta 多樣性計算，結合t檢驗，以P<0.05為閾值得出代表序列的物種注釋、物種信息和基于物種的豐度分布情況。

2 結果

Fig 1 Result of peptide standard curve

2.2 高脂血癥大鼠血脂恢復情況

2.2.1肝臟HE染色結果分析 各組大鼠肝臟HE染色病理切片顯示：空白組大鼠肝組織結構清晰，肝小葉結構完整，肝細胞形態(tài)正常，細胞核染色清晰可見，同時未見炎細胞浸潤、變性、壞死等病理變化。而模型組肝組織結構不完整，界限不清晰，肝小葉結構被破壞，肝細胞排列紊亂，肝細胞核模糊不清，肝竇消失，肝細胞脂滴分布密集，部分脂滴形成大空泡，這一結果說明造模后肝細胞出現(xiàn)泡沫化。與模型組比較，陽性藥組肝細胞恢復良好，肝結構完整，界限清晰，APE高、中、低劑量組肝脂肪變性程度均有不同程度的改善，脂滴體積比較小，大部分肝小葉結構清晰，肝細胞排列相對整齊。說明APE可以改善脂肪過量攝取引起的肝臟細胞形態(tài)變化，結果見Fig 2。

2.2.2血脂四項測定結果 對實驗各組大鼠血清中的TG、TC、LDL和HDL進行測定，結果見Tab 1。由表可知，長期給予高脂飼料，模型組大鼠血液內TG、TC和LDL的含量較空白組明顯上升，HDL含量則明顯降低，差異具有顯著性(P<0.05，P<0.01)，說明模型制作成功。陽性藥組、辛伐他汀可以明顯降低高脂血癥大鼠血液內TG、TC、LDL含量，同時升高HDL含量。APE給藥后，大鼠TG、TC、LDL含量明顯下降，與模型組比較，差異具有顯著性(P<0.05，P<0.01)。說明APE可以下調高脂血癥大鼠血液內TG、TC、LDL的含量。

2.3 菌群測定結果

2.3.1門相對豐度分析 與空白組進行比較，模型組大鼠腸道內厚壁菌門的相對豐度明顯下降，而擬桿菌門、軟壁菌門的相對豐度則明顯增加。而經APE干預后，給藥組大鼠腸道內厚壁菌門的相對豐度增加，而擬桿菌門、軟壁菌門的相對豐度顯著下降，見Fig 3。

Tab 1 Results of blood lipid in rats

#P<0.05,##P<0.01vsBlank group;*P<0.05,**P<0.01vsModel group

Fig 2 Pathological results of HE stainingA:Blank group;B：Model group;C：Simvastatin group;D：High dose group;E：Middle dose group;F：Low dose group.

Fig 3 Relative abundance experimental results of PhylumA：The relative abundance mean results of Phylum; B：The relative abundance results of Phylum with all samples; C: The heatmap results of Phylum.

2.3.2綱相對豐度分析 與空白組比較，模型組大鼠腸道內擬桿菌綱相對豐度則明顯上升，而梭狀芽胞桿菌相對豐度明顯下降。經APE干預后，給藥組大鼠腸道內雙歧桿菌、梭狀芽胞桿菌豐度明顯升高，而擬桿菌綱則明顯下降，見Fig 4。

2.3.3目相對豐度分析 與空白組大鼠進行比較，模型組大鼠腸道內擬桿菌目、梭菌目相對豐度明顯上升，而乳桿菌目相對豐度明顯下降。經APE干預后，給藥組大鼠腸道內乳桿菌目、桿菌目豐度明顯升高。而梭菌目、擬桿菌目豐度明顯下降，見Fig 5。

2.3.4菌群差異物種分析 與空白組比較，模型組大鼠腸道菌群組成發(fā)生明顯變化，芽孢桿菌、乳酸桿菌、狄氏副擬桿菌、雙歧桿菌明顯下降，而馬賽博斯氏菌含量乳酸菌噬菌體含量、旋毛形線蟲數(shù)量則明顯上升，經APE干預后，給藥組大鼠腸道內乳酸桿菌、芽孢桿菌和雙歧桿菌含量明顯增加，而擬桿菌屬的產酸菌、馬賽博斯氏菌含量則明顯下降，見Fig 6。

3 結論

本實驗基于SD大鼠高脂血癥動物研究土鱉蟲生物活性肽降血脂和對腸道菌群調節(jié)作用，結果表明，土鱉蟲生物活性肽可明顯降低高脂血癥大鼠血清內TC、TG、LDL 的水平，升高HDL水平，這一現(xiàn)象則說明土鱉蟲具有明顯的降血脂功效。 進一步通過 16S rDNA 高通量測序技術分析各組大鼠腸道菌群分布情況，此方法可有效彌補傳統(tǒng)的微生物體外培養(yǎng)導致的菌落種群丟失以及結構變化等不足。研究結果顯示，模型組大鼠腸道菌群多樣性和豐度不同程度降低，與 Martinez 等[12]報道一致。給予APE后，大鼠腸道菌群豐度及多樣性均有一定程度改善。Ley等[13]報道正常動物的擬桿菌門相對豐度較肥胖個體顯著降低，結果顯示，APE可降低高脂血癥大鼠擬桿菌門、軟壁菌門豐度。說明APE可以通過降低擬桿菌門、軟壁菌門豐度實現(xiàn)對血脂的間接干預。

高脂血癥發(fā)生時，腸道中微生物賴以生存的環(huán)境將會發(fā)生改變，其理化性質及物質結構的改變則會直接破壞雙歧桿菌、乳酸桿菌和腸球菌等有益菌的生長繁殖，使其數(shù)量急劇減少，而使得擬桿菌和梭菌等革蘭氏陰性菌含量增加。有害菌的增加使得腸道產生過氧化炎癥因子和脂質抑制因子，例如脂多糖(LPS)和氧化三甲胺(TMAO)[14-15]，這些因子會直接抑制脂質的氧化代謝，增加脂質在機體內的堆積。本實驗表明，APE可以調節(jié)高脂血癥大鼠腸道菌群變化，也可以降低模型大鼠血液內血脂含量，推測APE可能通過改善腸道菌群種類并抑制相關因子達到干預脂質代謝的作用。后期實驗對此機制進行深入研究。

Fig 4 Relative abundance experimental results of ClassA:The relative abundance Mean results of Class;B:The relative abundance results of Class with all samples;C:The heatmap results of Class.

Fig 5 Relative abundance experimental results of OrderA:The relative abundance Mean results of Order;B:The relative abundance results of Order with all samples;C:The heatmap results of Order.

Fig 6 Relative abundance experimental results of SpeciesA:The relative abundance Mean results of Species;B:The relative abundance results of Species with all samples;C:The heatmap results of Species.