SCAD重組腺病毒治療大鼠心肌梗死后心力衰竭的實驗研究

蘇永少,廖英勤,鐘小藝,馬智超,劉培慶,路 靜,臧林泉,周四桂

(1. 廣東藥科大學藥學院臨床藥學系，2.中山大學藥學院藥理與毒理學實驗室，廣東 廣州 510006)

心力衰竭是指心臟舒縮功能障礙，無法滿足機體生命活動需要時產生的疾病[1-2]。心力衰竭機制包括心肌肥厚、心肌纖維化、氧化應激、能量代謝、神經體液因素等[3-5]。得益于日益改善的心血管疾病治療策略的運用，心力衰竭的病死率明顯下降。但心力衰竭的發(fā)病機制與年齡密切相關，隨著人口老齡化的進程，心力衰竭的發(fā)病率正不斷增長，每年因此死亡的人數(shù)并沒有明顯減少。因此，尋找新的心力衰竭治療方法，顯得尤為重要。

短鏈酰基輔酶A脫氫酶(short-chain acyl-CoA dehydrogenase, SCAD)是?；o酶A脫氫酶家族的一員，能特異性地分解短鏈?；o酶A底物，是線粒體脂肪酸β氧化的第一個限速酶[6]。我們首次發(fā)現(xiàn)了SCAD在自發(fā)性高血壓大鼠心肌肥厚中的表達明顯下調[7]。進一步研究顯示，在慢性心力衰竭大鼠、心肌梗死后心力衰竭大鼠以及心肌細胞凋亡模型中，SCAD的表達均出現(xiàn)了顯著下調[8-10]。以上研究表明，SCAD對心力衰竭具有負性調控作用。然而SCAD重組腺病毒對心力衰竭大鼠是否具有保護作用，尚不清楚。

本研究以大鼠冠狀動脈左前降支結扎術(left anterior descending coronary artery, LAD)構建大鼠心肌梗死后心力衰竭模型，將SCAD重組腺病毒注射到心尖室壁方向，使SCAD蛋白特異性過表達。探討在急性病理應激情況下，SCAD重組腺病毒對心力衰竭大鼠心臟功能和線粒體能量代謝的影響。

1 材料

1.1 實驗動物與試劑SD大鼠，♂，體質量(210±20)g，購自南方醫(yī)科大學動物中心。許可證號：SCXK(粵)2017-0041。SCAD重組腺病毒、GFP空載體腺病毒(漢恒生物)，SYBR(DRR420S)(大連TaKaRa，批號：AJ12457A)、SCAD酶活性試劑盒(上海杰美生物，批號：1-2018412-10)，單克隆兔抗SCAD(Abcam，批號：GR117677-4)，單克隆鼠抗GAPDH(ProteinTech，批號：60004-1-1g)。

1.2 儀器血壓計(美國KENT)，化學發(fā)光儀(上海勤翔)，冷凍離心機(廣州湘儀)，-80 ℃超低溫冰箱(中科都菱)，酶標儀(Thermo)，熒光定量PCR儀(Bio-Rad)。

2 方法

2.1 大鼠心肌梗死后心力衰竭模型的構建大鼠適應性飼養(yǎng)1周，禁食12 h，采用LAD術構建急性心力衰竭大鼠模型將大鼠麻醉后，通過喉嚨進行氣管插管術，連接小動物呼吸機維持呼吸。于大鼠胸部沿左側第三、第四肋間隙打開并結扎左冠狀動脈，結扎完成后迅速分層縫合胸壁。Sham組方法同上，但開胸穿線后扎松結。

2.2 重組腺病毒介導的SCAD在大鼠心臟特異性過表達模型的構建按隨機數(shù)字表法將動物分組為：Sham+NS組、LAD+NS組、Sham+Ad-GFP組、Sham+Ad-SCAD組、LAD+Ad-GFP組、LAD+Ad-SCAD組，共6組。對大鼠心臟開胸進行LAD術的同時，采用1-guage針頭注射器，吸取純化后的重組腺病毒顆粒(Ad-SCAD:5.596×1011Viral particles, Ad-GFP:5.596×1011Viral particles)，在結扎部位往下(心尖方向)心室壁多點注射重組腺病毒顆粒(100 μL，3～5處)。各組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)6周。

2.3 鼠尾動脈收縮壓測定采用無創(chuàng)血壓儀(CADA Monitor，美國KENT公司)測定各組大鼠尾動脈收縮壓(systolic blood pressure, SBP)，LAD術前測量1次，術后每2周測量1次，直至第6周結束。

2.4 超聲心動圖檢查重組腺病毒注射6周后，采用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，采用超聲心動圖檢測大鼠心功能的變化，取M超曲線，分別測量大鼠的心臟博出量 (cardiac output, CO)、心臟每博輸出量 (stroke volume, SV)、收縮末期左心室內徑 (left ventricular dimensions at end systole, LVIDs)、舒張末期左心室內徑 (left ventricular dimensions at end diastole, LVIDd)、收縮末期左心室容積 (left ventricular end systolic volume, LVESV)、舒張末期左心室容積 (left ventricular end diastole volume, LVEDV)、心臟射血分數(shù) (ejection fraction, EF)和心臟的縮短分數(shù)(fractional shortening, FS)。

2.5 動物取材各組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)6周后，禁食12 h，3%戊巴比妥鈉經腹腔注射麻醉，經腹主動脈取血，靜置后分離血清，液氮速凍置于-80 ℃保存。取血后取出心臟。部分心臟組織經液氮速凍后-80 ℃保存進行后續(xù)實驗，部分心臟經4%多聚甲醛固定進行石蠟包埋切片，剩余部分心臟組織進行冰凍切片。

2.6 活性氧含量測定部分心臟組織進行冰凍切片，二氫乙啶(dihydroethidium, DHE)染色使活性氧(reactive oxygen species, ROS)呈紅色熒光，觀察產生的紅色熒光，分析ROS在心臟的產生情況。

2.7 心肌組織形態(tài)學檢查心臟組織多聚甲醛固定，進行石蠟包埋切片，進行Masson染色及TUNEL染色。Masson染色后心肌纖維呈紅色，膠原纖維呈藍色，借此得出大鼠心臟是否出現(xiàn)心肌纖維化以及纖維化的嚴重程度。采用TUNEL染色法檢測心肌細胞凋亡情況并計算凋亡指數(shù)。

2.8 線粒體膜腫脹程度檢測采用組織線粒體純化試劑盒提取大鼠心肌組織線粒體。采用酶標儀測定鈣誘導的線粒體膜通透性轉換孔(mitochondrial permeablity transition pore，mPTP)的開放程度。應用BCA試劑盒測定線粒體蛋白含量。線粒體反應緩沖液組分為150 mmol·L-1KCl、10 mmol·L-1Tris、20 mmol·L-1MOPS、5 mmol·L-1KH2PO4(pH 7.4))，以線粒體在540 nm波長處A值的下降幅度(A值變化的量ΔA與初始A值之比，即ΔA/A)表示大鼠心肌組織線粒體膜腫脹程度，結果用百分數(shù)表示來評價。

2.9 ATP含量測定根據熒光素酶需要消耗ATP催化產生螢光素的原理，檢測心肌組織勻漿中的ATP濃度。實驗操作嚴格按照說明書進行。

2.10 SCAD酶活性檢測采用分光光度法檢測SCAD酶活性。實驗操作嚴格按照SCAD酶活性檢測試劑盒說明書進行。

2.11 游離脂肪酸含量檢測采用ELISA法測定大鼠心肌和血清游離脂肪酸含量。具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

2.12 Western blot分析提取心臟組織總蛋白后，采用BCA蛋白定量試劑盒測定570 nm波長處的OD值，代入標曲進行蛋白定量。配制SDS-PAGE凝膠，上樣，電泳，條件為：濃縮膠70 V, 30 min，分離膠110 V，60 min。按照典型的“三明治”法進行轉膜，轉膜條件：230 mA恒流，90 min。轉膜結束后洗膜并封閉，條件為：5% BSA溶液，1 h。一抗：SCAD抗體(1 ∶1 000)、GAPDH抗體(1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜。二抗：兔抗(1 ∶10 000)、鼠抗(1 ∶10 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜。采用化學發(fā)光儀進行顯影。

2.13Real-timePCR采用TRIzol裂解法提取心肌中總RNA，通過紫外分光光度計測定總RNA樣品純度并計算出RNA濃度。采用RT-PCR試劑盒(TaKaRa)逆轉錄后合成cDNA。按照 SYBR Green試劑盒說明書配制Real-time PCR 反應體系。引物由上海生工合成，具體引物序列見Tab 1。

Tab 1 Sequences of primers for Real-time PCR

3 結果

3.1 各組大鼠血壓比較由Fig 1所示，與Sham+NS組相比，LAD+NS大鼠呈持續(xù)性低血壓狀態(tài)；與LAD+NS組相比，LAD+Ad-SCAD組術后第2周SBP明顯上升(P<0.05)，第4周和第6周的SBP同樣明顯上升(均P<0.05)，但較第2周有所降低，可能與術后心力衰竭的時間進程有關。表明SCAD重組腺病毒心肌過表達能改善心力衰竭大鼠持續(xù)低血壓狀態(tài)。

Fig 1 Comparison of systolic blood pressure(SBP) of rats in each *P<0.05 vs Sham+NS group;#P<0.05 vs LAD+NS group

3.2 各組大鼠超聲心動圖由Fig 2A所示，Sham+NS組、Sham+Ad-GFP組、Sham+Ad-SCAD組左室前、后壁的舒縮功能正常，組間差異無顯著性；LAD+NS組和LAD+Ad-GFP組左心室前壁的舒縮功能基本喪失，心室腔明顯增大；而LAD+Ad-SCAD組，左心室前壁舒縮功能同樣受損嚴重，但尚有微弱的舒縮功能，心室腔增大，但較LAD+NS組有所改善。由Fig 2B所示，與Sham組比較，LAD+NS組CO、SV、LVEF和FS均明顯減小(P<0.05)，LVIDd、LVIDs、LVEDV、LVESV明顯增大，表明LAD術后6周大鼠心臟的收縮/舒張功能嚴重受損，心臟泵血功能嚴重障礙，心功能明顯下降，發(fā)展為嚴重的心力衰竭；而與LAD+NS組相比，LAD+Ad-SCAD組CO、SV、LVEF和FS明顯升高(均P<0.05)，LVIDd、LVIDs、LVEDV、LVESV明顯降低。以上結果表明， SCAD重組腺病毒過表達能明顯延緩LAD術后心力衰竭的進程，大鼠的心功能得到很大提升，心臟收縮功能得到明顯改善。

3.3 各組大鼠心臟形態(tài)學檢查由Fig 3 Masson染色所示，心肌纖維呈紅色，膠原纖維呈藍色。Sham+NS組、Sham+Ad-GFP組、Sham+Ad-SCAD組均無明顯心肌纖維化；LAD+NS組和LAD+Ad-GFP組左心室前壁結扎位置以下心尖部位出現(xiàn)明顯的心肌纖維化，室壁變薄，室壁組成只有少量紅色的心肌細胞，基本由藍色的心肌纖維構成。而LAD+Ad-SCAD組，左心室前壁結扎位置以下心尖部位出現(xiàn)部分心肌纖維化現(xiàn)象，梗死區(qū)域膠原沉積明顯減少，心肌纖維化明顯改善。

Fig 2 Echocardiographic detection B: Changes of echocardiographic parameters.*P<0.05 vs Sham+NS group;#P<0.05 vs LAD+NS group

Fig 3 Masson staining analysisA:Sham+NS group; B: LAD+NS group; C: Sham+Ad-GFP group;D:Sham+Ad-SCAD group;E:LAD+Ad-GFP group;F:LAD+Ad-SCAD group

3.4 各組大鼠心肌細胞凋亡比較由Fig 4 TUNEL染色結果顯示，凋亡細胞呈棕褐色。其中Sham+NS組、Sham+Ad-GFP組有部分凋亡細胞，屬正?，F(xiàn)象；Sham+Ad-SCAD組心肌細胞凋亡有所減少；LAD+NS組和LAD+Ad-GFP組左心室前壁結扎位置以下心尖部位出現(xiàn)大量的心肌細胞凋亡，凋亡指數(shù)明顯高于Sham組(均P<0.05)。與LAD+NS組相比，LAD+Ad-SCAD組左心室前壁結扎部位以下心尖部位出現(xiàn)部分的心肌細胞凋亡情況得到明顯的改善，心肌細胞凋亡明顯減少，凋亡指數(shù)明顯下降(P<0.05)。

3.5 各組大鼠心肌ROS含量的變化由Fig 5 DHE染色結果顯示，與Sham+NS組相比，LAD+NS、LAD+Ad-GFP組ROS含量出現(xiàn)明顯增高(均P<0.05)；與LAD+NS組相比，LAD+Ad-SCAD組心肌ROS含量明顯降低(P<0.05)。

3.6 各組大鼠線粒體膜腫脹變化由Fig 6所示，與Sham+NS組相比，LAD+NS組、LAD+Ad-GFP組線粒體膜腫脹明顯上升(P<0.05)，表明心力衰竭大鼠的線粒體結構受到明顯的損傷。與Sham+NS組相比，Sham+Ad-SCAD組線粒體膜腫脹程度下降(P<0.05)。與LAD+NS組相比，LAD+Ad-SCAD組線粒體膜腫脹程度明顯下降(P<0.05)，表明SCAD重組腺病毒過表達對心肌線粒體具有明顯的保護作用。

3.7 各組大鼠術后6周SCAD mRNA和蛋白表達在心肌中的變化情況由Fig 7所示，與Sham+NS組相比，LAD+NS組心肌SCAD mRNA和蛋白表達均明顯降低(P<0.05)。與LAD+NS組相比，LAD+Ad-SCAD組SCAD mRNA和蛋白表達均明顯升高(P<0.05)。表明LAD術后6周，重組腺病毒介導的SCAD在心肌中存在過表達。

3.8 各組大鼠SCAD 酶活性、ATP含量、游離脂肪酸含量的變化由Fig 8所示，與Sham+NS組相比，LAD+NS組大鼠SCAD酶活性和ATP含量明顯降低、心肌和血清游離脂肪酸含量均明顯升高(均P<0.05)。與LAD+NS組相比，LAD+Ad-SCAD組大鼠SCAD酶活性和ATP含量明顯升高，游離脂肪酸含量均明顯降低(均P<0.05)。表明術后6周重組腺病毒介導的SCAD過表達，引起SCAD酶活性增高，增強了心肌線粒體脂肪酸氧化能力，生成更多的ATP，游離脂肪酸明顯減少。

Fig 4 Light microscopic observation of myocardial cell apoptosis in rat TUNEL Sham+NS; B: LAD+NS; C: Sham+Ad-GFP;D: Sham+Ad-SCAD; E: LAD+Ad-GFP; F: LAD+Ad-SCAD.*P<0.05 vs Sham+NS group;#P<0.05 vs LAD+NS group

Fig 5 Detection of ROS by DHE staining in myocardial tissues of rats in each Sham+NS; B: LAD+NS; C: Sham+Ad-GFP;D: Sham+Ad-SCAD; E: LAD+Ad-GFP; F: LAD+Ad-SCAD.*P<0.05 vs Sham+NS group;#P<0.05 vs LAD+NS group

Fig 6 Swelling changes of mitochondrial in *P<0.05 vs Sham+NS group;#P<0.05 vs LAD+NS group

Fig 7 Expression SCAD protein and A: Sham+NS; B: LAD+NS; C: Sham+Ad-GFP;D: Sham+Ad-SCAD; E: LAD+Ad-GFP; F: LAD+Ad-SCAD.*P<0.05 vs Sham+NS group;#P<0.05 vs LAD+NS group

Fig 8 Comparison of SCAD activity, ATP and free fatty acid content in myocardium of rats in each A: Sham+NS; B: LAD+NS; C: Sham+Ad-GFP;D: Sham+Ad-SCAD; E: LAD+Ad-GFP; F: LAD+Ad-SCAD.*P<0.05 vs Sham+NS group;#P<0.05 vs LAD+NS group

4 討論

心力衰竭發(fā)病機制尤為復雜，至今尚未完全闡明。目前公認的導致心力衰竭基本機制是心臟舒縮功能障礙，導致供血不能滿足機體活動需要，能量代謝改變是心臟舒縮功能障礙的關鍵因素[11]。正常狀態(tài)下，約70%的心肌能量來源于心肌線粒體脂肪酸β氧化。然而，心力衰竭時代謝底物由脂肪酸轉變?yōu)槠咸烟牵舅嵫趸芰︼@著減弱，導致心肌供能不足，葡萄糖氧化無法代償性增加，進一步加強了心力衰竭的能量生成障礙[12-14]。

我們前期研究顯示，SCAD的表達下調與心力衰竭的發(fā)展密切相關[8]。為了進一步明確SCAD在心力衰竭中的作用，利用SCAD重組腺病毒對心力衰竭大鼠進行心臟多點注射，研究SCAD過表達對心臟舒縮功能以及心肌線粒體能量代謝的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，在LAD術應激下，同時進行SCAD重組腺病毒過表達，能改善大鼠由LAD術后引起的持續(xù)性低血壓。超聲心動圖檢測結果顯示，過表達SCAD能改善心肌梗死導致的心臟舒縮功能障礙，各項超聲心動圖指標得到明顯改善。同時，過表達SCAD能明顯改善LAD術后引起的心肌纖維化和心肌細胞的大量喪失，減少心肌膠原沉積，改善心肌細胞的凋亡，降低ROS含量和線粒體膜腫脹程度，保護線粒體結構，有效延緩了心力衰竭的病理性重構。

LAD+Ad-SCAD組大鼠SCAD酶活性提高，ATP含量增高，游離脂肪酸含量減少，表明SCAD促進了線粒體脂肪酸β氧化反應，改善了LAD手術導致心肌缺血缺氧引起的心肌能量代謝障礙。以上結果提示，SCAD重組腺病毒過表達可以減緩心肌梗死大鼠向心力衰竭發(fā)展的進程，可能與SCAD對心臟能量代謝的正性調節(jié)作用和抑制線粒體凋亡途徑，從而保護心肌細胞的作用密切相關。

綜上所述，SCAD重組腺病毒在心力衰竭治療中可能發(fā)揮了至關重要的作用，這為心力衰竭的防治提供了一個新靶點和新思路，為進一步研究SCAD在心力衰竭中的作用奠定了基礎。然而，SCAD過表達改善心力衰竭的作用機制還有待進一步深入研究。