NR2B/CREB在人參皂苷Rb1調(diào)節(jié)甲基苯丙胺誘導(dǎo)大鼠條件位置偏愛中的作用

楊根夢，何翠華，洪仕君， 李 娟，黃 儉，沈?qū)氂瘢铈骆?，?柳，曾曉鋒，李利華

(昆明醫(yī)科大學(xué) 1. 法醫(yī)學(xué)院、2. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500)

甲基苯丙胺(methamphetamine，METH)是一種苯丙胺類中樞神經(jīng)興奮劑，外觀呈白色透明不規(guī)則晶體，又稱為“冰毒”，其具有依賴性強(qiáng)、復(fù)吸率高、神經(jīng)毒性大等特點(diǎn)[1]。最新中國毒品的形勢報(bào)告顯示，近年來，新型合成毒品濫用呈蔓延之勢，METH已成為我國毒品濫用人數(shù)最多的毒品。METH成癮一方面嚴(yán)重危害毒品濫用者的身心健康，同時(shí)也對社會的安定造成嚴(yán)重影響。關(guān)于毒品成癮的神經(jīng)生物學(xué)假說較多，目前被普遍認(rèn)可的是獎賞物替代學(xué)說，并以此來解釋藥物濫用產(chǎn)生的機(jī)制[2]。但迄今為止，METH濫用成癮機(jī)制尚不清楚，并且還缺乏公認(rèn)有效地治療藥物和治療手段。

NMDAR是一種谷氨酸離子型的受體，由NR1和NR2A-D亞基組成。在神經(jīng)元分化、記憶形成和學(xué)習(xí)過程中具有重要作用[3]。NR2B是NMDAR發(fā)揮生理作用的重要亞基，具有增強(qiáng)學(xué)習(xí)和記憶能力的作用，并參與藥物依賴發(fā)生發(fā)展過程。CREB (cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白) 是機(jī)體中一種重要的調(diào)節(jié)因子，磷酸化的CREB對基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白的合成具有較為重要的調(diào)節(jié)作用，并可參與NR2B 表達(dá)的調(diào)節(jié)。此外，CREB在學(xué)習(xí)記憶中也扮演著重要作用，對海馬認(rèn)知功能具有較為重要的調(diào)節(jié)作用。

條件位置偏愛(conditioned place preference，CPP)是一種衡量藥物濫用誘導(dǎo)獎賞效應(yīng)的模型，能夠評價(jià)藥物濫用的精神依賴性，也是尋找治療藥物濫用成癮的有效工具。

人參皂苷Rb1 (ginsenoside Rb1,Rb1) 主要分布在人參、三七、西洋參等植物中，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和抗腫瘤等方面均發(fā)揮著較為重要的藥理作用。并且Rb1作為一種保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)的抗氧化劑和抗炎劑，近年來受到越來越多的關(guān)注。研究表明，人參皂苷Rb1對HIV-TAT蛋白和METH協(xié)同誘導(dǎo)大鼠血腦屏障損傷具有明顯的保護(hù)作用[4]。 然而Rb1對METH成癮方面的研究較少。因此，本研究旨在研究人參皂苷Rb1對METH誘導(dǎo)大鼠CPP的作用并觀察NR2B和CREB是否參上述調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 動物SD大鼠，♂，體質(zhì)量(180～220) g，購買于昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心[SCXK(滇)K2015-0002]。動物飼養(yǎng)條件為12 h白天/黑夜循環(huán)，溫度控制在(23±1) ℃，大鼠可以自由飲用食物和水，所有大鼠在CPP裝置中適應(yīng)環(huán)境3 d，然后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑和藥品METH來源于中國食品藥品檢定研究院(#171212-200603)，METH溶于生理鹽水，終濃度為為2 mg·kg-1。Rb1(純度89%)購自成都曼斯特生物科技有限公司(#41753-43-9)，Rb1溶于生理鹽水溶液中，終濃度為以10 mg·kg-1?？筃R2B，抗CREB和抗p-CREB體購買于CST (Danvers，MA，USA)，抗β-actin和抗兔以及抗鼠二抗購買于Sigma-Aldrich (St.Louis，MO，USA)。

1.3 CPP裝置CPP設(shè)備(上海欣軟信息有限公司，型號XR-XT401)由兩個(gè)相等大小的黑白箱組成，一側(cè)是白箱，柵欄狀黑色底面；另一側(cè)是黑色，網(wǎng)格狀黑色底面，黑白箱之間有一個(gè)黑色的小箱分隔，可讓大鼠自由穿梭于黑白箱之間。

1.4 CPP實(shí)驗(yàn)方案本實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分成4個(gè)組，對照組：10 mg·kg-1生理鹽水 (i.p),METH組：2 mg·kg-1METH (i.p),Rb1組：10 mg·kg-1Rb1 (i.p),Rb1+METH組：給予METH前1 h注射Rb1。CPP實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)階段 (1～3 d),每只大鼠在黑白箱之間自由活動30 min。在d 3，記錄大鼠CPP 15 min。CPP實(shí)驗(yàn)階段(4-13 d),封閉黑白箱，d 4、6、8、10和12，注射生理鹽水或Rb1 1 h之后，再進(jìn)行METH腹腔注射，隨后放在伴藥箱30 min；d 5、7、9、11和13，注射生理鹽水或Rb1 1 h后，腹腔注射生理鹽水并放入非伴藥箱30 min。第14 d，對大鼠進(jìn)行CPP測試15 min。CPP分?jǐn)?shù)統(tǒng)計(jì)分析方法參照文獻(xiàn)[5]。

1.5 Western blot分析用生理鹽水進(jìn)行心臟灌注，目的是便于固定和方便分離腦組織，取出大鼠全腦組織后立即置于冰上，分離出海馬組織并保存于-80 ℃?zhèn)溆?。用含?% PMSF和蛋白酶及磷酸酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液裂解適量的海馬組織，并用BCA試劑盒測蛋白濃度。用12% SDS-PAGE分離等量的蛋白質(zhì)(25 μg)并轉(zhuǎn)移至0.45 μm PVDF膜。膜用5%脫脂牛奶或者5% BSA在室溫下封閉2 h，隨后加入相應(yīng)的一抗 (1 ∶1 000) 于4 ℃冰箱過夜。d 2加相應(yīng)的二抗 (1 ∶5 000) 并于室溫下孵育1 h，最后用ECL顯影并于Bio-Rad凝膠成像儀上觀察結(jié)果。值得注意的是p-CREB蛋白很容易失活，因此分離完腦組織后應(yīng)立即保存在-80 ℃，并及時(shí)提蛋白，提蛋白必須在冰上進(jìn)行且裂解液應(yīng)加入蛋白酶及磷酸酶抑制劑，蛋白變性后及時(shí)進(jìn)行Western blot檢測。用β-actin作為內(nèi)參，應(yīng)用ImageJ軟件對Western blot條帶進(jìn)行灰度值比較。

2 結(jié)果

2.1 Rb1對METH誘導(dǎo)大鼠CPP的作用METH顯著增加了大鼠在伴藥箱的時(shí)間。而提前注射10 mg·kg-1Rb1后；與生理鹽水組相比，Rb1對大鼠CPP并沒有影響，而與METH組相比，大鼠在伴藥箱的時(shí)間明顯減少，說明Rb1對METH誘導(dǎo)大鼠CPP具有一定抑制作用。

Fig 1 Effect of Rb1 on METH-induced CPP in n=10)Post-pre value were expressed as the place preference date[9]. The results show that Rb1 attenuates the development of METH-induced CPP. **P<0.01 vs control;#P<0.05 vs METH

2.2 Rb1對METH誘導(dǎo)大鼠CPP軌跡圖的作用大鼠在 CPP 箱的運(yùn)動軌跡圖如Fig 2所示，注射Rb1和METH前，各組在非伴藥箱(黑箱)的軌跡比伴藥箱(白箱)多；給Rb1和METH后，給藥前后自身配對比較，METH組在伴藥箱的軌跡明顯增加；而提前注射Rb1后，與METH組相比，大鼠在伴藥箱的軌跡有所減少。

2.3 Rb1對NR2B 表達(dá)的影響METH組中NR2B的表達(dá)水平顯著升高，而提前1 h用Rb1預(yù)處理后，與METH組相比，NR2B的表達(dá)水平有所降低(Fig 3)。

2.4 Rb1對CREB，p-CREB和p-CREB/CREB表達(dá)的影響如Fig 4所示，METH顯著增加了海馬組織中p-CREB的表達(dá)水平和p-CREB/CREB的比值，而提前加入Rb1治療后，與METH組相比，p-CREB的表達(dá)水平和p-CREB/CREB的比值均有所下降，而給予METH和Rb1后，CREB表達(dá)水平均無顯著差異。

Fig 2 Effect of Rb1 on METH-induced trajectories in ratsA- D-1 represents pre-treated: control group (A-1), Rb1 group (B-1), METH group (C-1) and Rb1+METH group (D-1); A-D-2 represents post-treated: control group (A-2), Rb1 group (B-2), METH group (C-2) and Rb1+METH group (D-2).

Fig 3 Effect of Rb1 on NR2B in hippocampus of Rats were pretreated with Rb1 (10 mg·kg-1 i.p) for 1 h before METH (2 mg·kg-1 i.p), and the expression level of NR2B in hippocampus was detected by Western blot.**P<0.01 vs control;#P<0.05 vs METH.

Fig 4 Effects of Rb1 on CREB and p-CREB in hippocampus of Rats were pretreated with Rb1 (10 mg·kg-1 i.p) for 1 h before METH (2 mg·kg-1 i.p), and the expression levels of CREB and p-CREB in hippocampus were detected by Western blot.**P<0.01 vs control;#P<0.05 vs METH.

3 討論

本研究主要發(fā)現(xiàn)METH可明顯誘導(dǎo)大鼠CPP，這與之前的研究報(bào)道一致[6-7]。本研究用人參皂苷Rb1(10 mg·kg-1,i.p)進(jìn)行前干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)METH誘導(dǎo)大鼠CPP得到緩解，與METH組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明10 mg·kg-1Rb1對METH誘導(dǎo)大鼠CPP具有抑制作用。由于CPP實(shí)驗(yàn)可用來評價(jià)濫用藥物的獎賞效應(yīng)，且這種行為表型的緩解可認(rèn)為與藥物戒斷治療具有相同的效果[8]。因此，本研究結(jié)果認(rèn)為人參皂苷Rb1可作為治療METH依賴的潛在藥物。

海馬在調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)、記憶等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，也是腦邊緣系統(tǒng)中最重要的結(jié)構(gòu)之一，參與學(xué)習(xí)、記憶、情緒和條件反射的形成，海馬在藥物濫用發(fā)展過程中扮演著重要作用[9-10]。因此，本研究選擇的腦區(qū)為海馬。NMDAR是重要的興奮性氨基酸離子型受體，在精神興奮劑誘導(dǎo)的突觸可塑性中具有重要的調(diào)節(jié)作用，研究表明，NR-2B激活后，Ca2+大量內(nèi)流，胞內(nèi)Ca2+濃度持續(xù)升高，可引起一系列不良反應(yīng)。此外,大量Ca2+超載可誘導(dǎo)自由基連鎖反應(yīng)，而釋放的自由基又可使細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加，如此循環(huán)，最終可致神經(jīng)元發(fā)生變性和死亡[11-12]。CREB對學(xué)習(xí)和記憶過程尤為重要。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，METH可誘導(dǎo)海馬組織中NR2B和p-CREB的表達(dá)水平明顯升高,同時(shí)p-CREB/CREB的比值升高(P<0.01)，而提前加入Rb1干預(yù)治療后，與METH組相比，NR2B和p-CREB的表達(dá)水平以及p-CREB/CREB的比值有所下降(P<0.05)。本研究與先前的研究結(jié)果一致，認(rèn)為METH可誘導(dǎo)腦組織內(nèi)NR2B表達(dá)水平明顯升高[13]。研究表明，安非他明和METH誘導(dǎo)大鼠CPP與大鼠海馬CA1區(qū)NR2B的表達(dá)以及紋狀體和海馬中p-CREB和p-Fos的表達(dá)有關(guān)[14]。上述研究結(jié)果均說明NR2B和p-CREB對METH成癮具有調(diào)節(jié)作用。本研究使用的Rb1具有廣泛的藥理作用，是人參的主要活性成分，對神經(jīng)系統(tǒng)具有保護(hù)作用[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rb1對METH誘導(dǎo)的NR2B和p-CREB表達(dá)水平升高具有抑制作用，說明人參皂苷Rb1通過調(diào)節(jié)NR2B和p-CREB對METH誘導(dǎo)大鼠CPP具有一定的抑制作用。此外，有研究表明，鉤藤堿可抑制METH誘導(dǎo)斑馬魚CPP效應(yīng)，其機(jī)制與抑制NR2B的表達(dá)有關(guān)。說明NR2B在METH成癮中起著重要作用，使用藥物抑制NR2B對METH成癮具有潛在治療作用。

總之，NR2B和p-CREB參與了人參皂苷Rb1對METH誘導(dǎo)大鼠CPP的調(diào)節(jié)作用，但METH成癮的確切機(jī)制尚不清楚。在毒品問題全球化的影響下，尋找并開發(fā)新的治療藥物已成為解決當(dāng)今毒品濫用問題的迫切需求，也是毒品濫用研究領(lǐng)域今后研究的重點(diǎn)。