miRNA-200a靶向BRD4對(duì)非小細(xì)胞肺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

田曉靜 周伊蘭 薛宏峰

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬常州市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，常州 213003)

肺癌是全世界發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)約占總肺癌病例數(shù)的85%以上，且易轉(zhuǎn)移、預(yù)后差，總體生存率低于20%[1,2]。因此深入研究NSCLC發(fā)病及轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的分子機(jī)理對(duì)其臨床診療具有重要價(jià)值。MicroRNAs (miRNAs)是一種長度為21～23個(gè)核苷酸的內(nèi)源性的保守非編碼小RNA，既往研究顯示miRNAs通過與靶mRNA 3′-UTR區(qū)的不完美配對(duì)，在轉(zhuǎn)錄后水平上負(fù)向調(diào)控基因的表達(dá)，從而廣泛參與包括腫瘤發(fā)生發(fā)展在內(nèi)的多種生理和病理過程[3]。miRNA-200a是miRNA-200家族成員之一，研究顯示miRNA-200a在乳腺癌、肝癌、腎癌以及子宮內(nèi)膜癌等多種腫瘤的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenehymal transition，EMT)、侵襲、轉(zhuǎn)移中起著重要作用[4,5]。本研究旨在探討miRNA-200a對(duì)NSCLC細(xì)胞EMT的影響及其可能的作用途徑。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1一般資料 收集2017年1月至2018年12月于我院進(jìn)行手術(shù)的NSCLC患者肺癌組織65例，同時(shí)取其癌旁組織(病理學(xué)檢查確認(rèn)無腫瘤細(xì)胞浸潤)作為對(duì)照。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者經(jīng)病理學(xué)檢查確認(rèn)為NSCLC；②患者臨床病理資料完整；③患者術(shù)前均未接受放療、化療以及其他抗腫瘤治療；④排除合并重大臟器功能疾病、自身免疫性疾病以及嚴(yán)重內(nèi)分泌疾病患者。其中男性48例，女性17例；年齡43～69歲，平均年齡(57.8±5.7)歲；根據(jù)WHO肺癌分類標(biāo)準(zhǔn)：鱗癌41例，腺癌24例； TNM分期：Ⅰ期16例，Ⅱ期27例，Ⅲ 期22例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35例，淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移30例。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或其家屬均簽署知情協(xié)議書。

1.1.2試劑和儀器 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549購自上海中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。RNAprep pure動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Applied Biosystems TaqMan RT-PCR試劑盒、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑、ECL化學(xué)發(fā)光液均購自美國Thermo Fisher Scientific公司。pAD-MIR-GFP-miRNA-200a或pAD-MIR-GFP-NC腺病毒表達(dá)載體購自山東維真生物科技公司。Dual-Luciferase?Reporter Assay System檢測試劑盒購自美國Promega公司。BRD4、E-cadherin、Vimentin鼠單克隆抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。Transwell小室購自美國Corning公司。

1.2方法

1.2.1RT-PCR 采用動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒分離NSCLC組織和癌旁組織總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。從NCBI上查詢?nèi)嗽磎iRNA-200a和內(nèi)參GAPDH的核苷酸序列，并設(shè)計(jì)、合成RT-PCR反應(yīng)引物： miRNA-200a-F：5′-CCCCTGTGAGCATCTTACC-3′，miRNA-200a-R：5′-GCGGGTCACCTTTGAACATC-3′；GAPDH-F：5′-CCACAGTCCATGCCATCAC-3′，GAPDH-R：5′-CAGGTCAGGTCCACCACTG-3′。根據(jù)RT-PCR試劑盒說明書配置反應(yīng)體系，上機(jī)，設(shè)置RT-PCR反應(yīng)程序：95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后采用2-ΔΔCt法分析miRNA-200a 的mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.2穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建 pAD-MIR-GFP-miRNA-200a或pAD-MIR-GFP-miRNA-NC腺病毒表達(dá)載體分別用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染人HEK 293T細(xì)胞，6 h后換液。48 h后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞有綠色熒光出現(xiàn)表明轉(zhuǎn)染成功。收集病毒培養(yǎng)上清，0.45 μm無菌濾器過濾，將病毒分別感染指數(shù)生長期的人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞，37℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)基中加入1 μg/ml的嘌呤霉素篩選未成功感染的細(xì)胞，至顯微鏡下的細(xì)胞均發(fā)出綠色熒光時(shí)表明miRNA-200a和miRNA-NC腺病毒過表達(dá)細(xì)胞系構(gòu)建成功。

1.2.3熒光素酶報(bào)告基因檢測 生物信息學(xué)分析BRD4可能是miRNA-200a的一個(gè)潛在的靶基因?？寺∫吧虰RD4的3′-UTR區(qū)(BRD4-WT)和缺失miRNA-200a配對(duì)區(qū)域的突變體BRD4的3′-UTR區(qū)(BRD4-MUT)片段，并構(gòu)建到熒光素酶報(bào)告基因載體pMIR-Report上。指數(shù)期miRNA-200a和miRNA-NC腺病毒過表達(dá)細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)，等密度接種到12孔板中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%時(shí)，分別轉(zhuǎn)染BRD4-WT和BRD4-MUT熒光素酶報(bào)告基因載體和對(duì)照熒光質(zhì)粒pRL-TK，培養(yǎng)48 h，采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒檢測細(xì)胞熒光素酶相對(duì)活性。

1.2.4Western blot 指數(shù)期miRNA-200a和miRNA-NC腺病毒過表達(dá)細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)，等密度接種到6孔板中，miRNA-NC細(xì)胞接種1組，miRNA-200a細(xì)胞接種3組。構(gòu)建pcDNA3.1-BRD4真核過表達(dá)載體，pcDNA3.1空載和pcDNA 3.1-BRD4過表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染其中2組miRNA-200a細(xì)胞，其他組細(xì)胞加入等體積的轉(zhuǎn)染試劑。24 h后收集細(xì)胞，RIPA裂解液冰上裂解30 min，高速離心取上清，加入5×SDS Loading buffer，煮沸10 min，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉。分別加入BRD4(1∶300)、E-cadherin(1∶200)、Vimentin(1∶500)抗體，4℃孵育過夜。PBST洗3次，加入二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h，PBST洗 3次，涂抹ECL化學(xué)發(fā)光液，Bio-Rad凝膠儀分析miRNA-NC組、miRNA-200a組、miRNA-200a+pcDNA組和miRNA-200a+ BRD4組中各蛋白的表達(dá)水平。

1.2.5Transwell分析 miRNA-NC組、miRNA-200a組、miRNA-200a+pcDNA組和miRNA-200a+BRD4組細(xì)胞胰酶消化，PBS洗2次，用5% FBS的培養(yǎng)基重懸并調(diào)整密度至5×105個(gè)/ml，分別接種100 μl細(xì)胞懸液到Transwell小室中，下室添加500 μl完全培養(yǎng)基。24 h后PBS洗滌Transwell小室2次，甲醇固定30 min。PBS洗滌2次，0.1%結(jié)晶紫孵育20 min。PBS洗滌2次，并用棉簽擦除上層未遷移細(xì)胞，顯微鏡下觀察細(xì)胞侵襲情況。

2 結(jié)果

2.1miRNA-200a在NSCLC組織和癌旁組織中的表達(dá) RT-PCR結(jié)果顯示，癌旁組織和NSCLC組織中miRNA-200a的mRNA相對(duì)表達(dá)水平分別為1.66±0.12和0.46±0.07，miRNA-200a在NSCLC組織中的相對(duì)含量顯著低于其癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

2.2miRNA-200a與BRD4靶向關(guān)系的驗(yàn)證 采用生物信息學(xué)在線預(yù)測網(wǎng)站(http://www.targetscan.org/)分析miRNA-200a可能的作用靶點(diǎn)，結(jié)果顯示：BRD4 mRNA 3′UTR與miRNA-200a存在互補(bǔ)區(qū)域，可能是它的一個(gè)潛在作用靶基因，見圖2A。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果表明，在過表達(dá)BRD4-WT的細(xì)胞中，miRNA-200a組細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性顯著低于miRNA-NC組細(xì)胞(P<0.05)；而在過表達(dá)BRD4-MUT的細(xì)胞中，miRNA-200a組和miRNA-NC組細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性差異無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2B。

2.3miRNA-200a過表達(dá)對(duì)BRD4、E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)的影響 采用Western blot探究miRNA-200a靶向BRD4是否影響NSCLC細(xì)胞EMT標(biāo)志蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示與miRNA-NC組比較，miRNA-200a組細(xì)胞BRD4和Vimentin的蛋白表達(dá)水平顯著下降，E-cadherin的蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)；而在miRNA-200a細(xì)胞中過表達(dá)BRD4后，與miRNA-200a+pcDNA組比較，Vimentin的蛋白表達(dá)水平明顯回升，E-cadherin的蛋白表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

圖1 miRNA-200a mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較Fig.1 Comparison of relative mRNA expression of miRNA-200aNote:*.P<0.05.

圖2 A549細(xì)胞中miRNA-200a與BRD4靶向關(guān)系的驗(yàn)證Fig.2 Verification of targeting relationship between miRNA-200a and BRD4 in A549 cellsNote:*.P<0.05.

圖3 miRNA-200a過表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞EMT蛋白E-cadherin、Vimentin的影響Fig.3 Effect of miRNA-200a overexpression on EMT-related protein E-cadherin,Vimentin in A549 cells

圖4 miRNA-200a過表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞侵襲的影響Fig.4 Effect of miRNA-200a overexpression on invasion of A549 cellsNote:*.P<0.05.

2.4miRNA-200a過表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞遷移的影響 Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，與miRNA-NC組(83.66±9.25)個(gè)比較，miRNA-200a組(32.73±6.02)個(gè)細(xì)胞的遷移數(shù)顯著下降(P<0.05)；與miRNA-200a+pcDNA組(35.06±5.89)個(gè)比較，miRNA-200a+BRD4組(60.02±7.28)個(gè)細(xì)胞的遷移數(shù)顯著回升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

3 討論

miRNA-200包括miRNA-141、miRNA-200a、miRNA-200b、miRNA-200c和miRNA-429五個(gè)子族，在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、EMT、侵襲轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)中起著重要作用[6,7]。大量研究顯示，miRNA-200家族成員在肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等眾多腫瘤中異常表達(dá)，并靶向下游基因參與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的調(diào)控[8]。miRNA-200a在機(jī)體惡性腫瘤中的調(diào)控作用不盡相同，如在子宮內(nèi)膜癌、結(jié)腸癌、鼻咽癌中作為癌基因促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并與腫瘤的分化程度密切相關(guān)[9,10]；而在乳腺癌、肝癌、胰腺癌等多種癌組織中表達(dá)下調(diào)，作為抑癌基因通過靶向不同蛋白抑制腫瘤細(xì)胞的EMT、侵襲和轉(zhuǎn)移[11,12]。本研究結(jié)果顯示，miRNA-200a在NSCLC組織中的相對(duì)含量顯著低于癌旁組織，提示miRNA-200a可能與NSCLC的發(fā)生發(fā)展存在密切關(guān)系。這一結(jié)果在TCGA數(shù)據(jù)庫中得到進(jìn)一步驗(yàn)證。

為了進(jìn)一步闡明miRNA-200a通過何種途徑參與NSCLC的調(diào)控，我們通過生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)溴化結(jié)構(gòu)蛋白4(bromodomain containing protein 4，BRD4)是miRNA-200a的潛在作用位點(diǎn)。BRD4是溴結(jié)構(gòu)域和超末端結(jié)構(gòu)(bromodomain and extra-terminal domain，BET)蛋白家族成員之一，可通過與組蛋白中乙?；揎椀馁嚢彼崽禺愋越Y(jié)合調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期和分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等各種生物學(xué)過程[13,14]。近期研究表明，BRD4在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，并參與腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移，已成為抗腫瘤治療的重要研究靶點(diǎn)[15]；此外，多項(xiàng)研究已證明BRD4的抑制劑對(duì)胰腺癌、乳腺癌、NSCLC、卵巢癌等多種惡性腫瘤具有良好的治療作用[16]。本研究采用熒光素酶檢測實(shí)驗(yàn)證實(shí)過表達(dá)BRD4-WT 3′UTR后，miRNA-200a組細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性顯著低于miRNA-NC組細(xì)胞，表明miRNA-200a可負(fù)向調(diào)控BRD4的表達(dá)。

EMT是腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移的重要途徑。腫瘤上皮細(xì)胞發(fā)生EMT后轉(zhuǎn)變?yōu)楦哌w移和侵襲能力的間質(zhì)細(xì)胞，離開原發(fā)病灶后可進(jìn)入機(jī)體循環(huán)系統(tǒng)，從而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。大量研究證明EMT表型與眾多腫瘤的組織學(xué)分級(jí)、TNM分期、分化程度和預(yù)后密切相關(guān)，已成為多種惡性腫瘤靶向治療和預(yù)后評(píng)估的新靶標(biāo)[17,18]。EMT是一種動(dòng)態(tài)過程，其發(fā)生特征是上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin、ZO-1表達(dá)的下調(diào)和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin、Fibronectin和Vimentin表達(dá)的上調(diào)[19]。在我們的研究中，NSCLC細(xì)胞過表達(dá)miRNA-200a后，其靶基因BRD4和Vimentin的表達(dá)顯著下降，E-cadherin的蛋白表達(dá)增加；而在miRNA-200a過表達(dá)細(xì)胞中重新誘導(dǎo)BRD4的表達(dá)后，Vimentin的表達(dá)水平明顯回升，E-cadherin的表達(dá)顯著回落。此外，通過Transwell進(jìn)一步分析miRNA-200a對(duì)NSCLC細(xì)胞生物行為學(xué)的影響。結(jié)果顯示，NSCLC細(xì)胞過表達(dá)miRNA-200a后，細(xì)胞侵襲能力受到顯著抑制；而在miRNA-200a過表達(dá)細(xì)胞中恢復(fù)BRD4的表達(dá)后，細(xì)胞侵襲能力呈現(xiàn)明顯回升態(tài)勢。上述結(jié)果表明miRNA-200a可通過靶向下調(diào)BRD4的表達(dá)抑制NSCLC細(xì)胞EMT的發(fā)展，從而抑制NSCLC細(xì)胞的侵襲和遷移。

綜上所述，miRNA-200a在NSCLC組織中的表達(dá)水平顯著降低，miRNA-200a過表達(dá)可靶向下調(diào)BRD4的表達(dá)，并抑制NSCLC細(xì)胞中BRD4誘導(dǎo)的EMT和侵襲遷移過程，有望為NSCLC的靶向治療開辟新的思路。