乙型肝炎病毒及其核心抗原對巨噬細胞極化的影響①

伊宏煜 張津睿 胡海峰 張 野 陳麗華 連建奇

(空軍軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院傳染病科，西安 710032)

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)感染長期以來一直是全球公共衛(wèi)生安全的重要威脅，盡管隨著乙肝疫苗的應用，乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)感染人數(shù)逐年下降，但全世界目前仍有大約2.5億人正在經受著HBV感染所帶來的危害[1,2]。乙肝感染的慢性化與機體免疫狀態(tài)有著非常密切的關系，既往研究證實適應性免疫應答的“耗竭”在HBV慢性化過程中發(fā)揮著重要作用，而以巨噬細胞為主的固有免疫應答在乙肝感染慢性化中的作用也成為了研究的熱點[3,4]。巨噬細胞是固有免疫系統(tǒng)中重要的一類細胞，它有很強的異質性，在不同刺激條件下，巨噬細胞可向經典活化的M1型巨噬細胞或替代活化的M2型巨噬細胞方向分化[5]。然而，在HBV感染背景下巨噬細胞的極化狀態(tài)及其免疫應答效應尚缺乏詳盡研究。有報道稱，HBV感染可以促進巨噬細胞向M2方向分化，并抑制機體免疫反應[6]，但另有研究發(fā)現(xiàn)，HBV感染后促進巨噬細胞分泌促炎因子從而發(fā)揮病毒清除的作用[7,8]。巨噬細胞亞群和自身免疫狀態(tài)的差異很可能是決定乙肝感染清除或慢性化的重要因素。

研究表明，乙肝相關抗原如表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)和e抗原(hepatitis B e antigen，HBeAg)可抑制巨噬細胞表面模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)從而削弱巨噬細胞功能，但乙肝核心抗原(hepatitis B core antigen，HBcAg)對巨噬細胞的作用并不明確。研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞表面的Toll樣受體2(Toll-like receptor 2，TLR2)能夠識別HBcAg并促進巨噬細胞分泌促炎因子[9]，而另有研究發(fā)現(xiàn)，HBcAg在肝臟枯否細胞(Kupffer cells，KCs)介導的HBV免疫耐受中發(fā)揮著重要作用[10]。

本研究分析比較了HBV與HBcAg對PMA誘導的THP-1來源巨噬細胞M1極化相關的CD86、CCR7和M2極化相關的CD206、CD163的表達水平以及THP-1來源巨噬細胞分泌炎癥細胞因子水平變化，試圖闡明HBcAg對巨噬細胞極化的影響，從而為進一步探索乙肝感染慢性化的免疫學機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 人白血病單核細胞系THP-1、人肝癌細胞系HepG2、HepG2.2.15來自空軍軍醫(yī)大學免疫學教研室凍存；佛波酯(PMA)購自Abcam；流式抗體CD86-FITC、CCR7-PE、CD163-FITC、CD206-PE、TLR2-BB515購自BD Biosciences；重組HBcAg購自ProSpec；TNF-α、IL-6、IL-10、TGF-β ELISA試劑盒購自上海西塘生物；Trizol、SYBR Premix Ex Taq試劑盒購自TaKaRa；RT-qPCR所需引物合成自上海生工生物工程。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) HepG2、HepG2.2.15細胞用含10%胎牛血清、100 U/ml鏈霉素、100 μg/ml青霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，THP-1細胞用含10%胎牛血清、100 U/ml鏈霉素、100 μg/ml青霉素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞均置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2細胞處理 參照文獻[11]的方法，將THP-1細胞以5×105ml-1鋪在6孔板，每孔2 ml培養(yǎng)基，同時加入PMA 25 ng/ml刺激THP-1 48 h將其誘導成M0巨噬細胞。預先將貼壁的HepG2、HepG2.2.15以5×105ml-1轉移至6孔板大小的Transwell小室上室中，待THP-1分化為巨噬細胞后，將上室移入6孔板，此時上室為HepG2/HepG2.2.15細胞，而下室為THP-1誘導的巨噬細胞，分別共培養(yǎng)24 h，收集下室THP-1細胞提RNA以及流式細胞染色，并收集下室培養(yǎng)上清進行ELISA檢測。另取一塊6孔板，將THP-1細胞以5×105ml-1鋪在6孔板，每孔2 ml培養(yǎng)基，用同樣方法誘導巨噬細胞，然后換新鮮培養(yǎng)基，分別加入10 μg/ml重組HBcAg和等體積PBS作對照，培養(yǎng)24 h后收集THP-1提RNA以及進行流式細胞染色，并收集培養(yǎng)上清做ELISA檢測。

1.2.3流式細胞儀檢測 用細胞刮刀將THP-1細胞收集于離心管，并于管中加入流式抗體(CD86、CD163、CD206、CCR7)孵育，每組用同型對照抗體(iso)做對照，染色結束后，用PBS洗滌2遍，流式固定液固定后用BD流式機進行流式檢測，并用FlowJo軟件分析結果。

1.2.4RT-qPCR檢測THP-1的CD86、CCR7、CD 163、CD206、TNF-α、IL-6、IL-10、TGF-β等基因的表達情況 收集處理后的THP-1細胞，用Trizol裂解并提取RNA，測定其在260 nm處的吸光度以確定RNA濃度，隨后用SYBR法在Bio-Rad上進行qPCR反應，每組基因均以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法分析基因的相對表達情況。

1.2.5ELISA檢測培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-6、IL-10以及TGF-β水平 收集與HepG2、HepG2.2.15以及重組HBcAg共培養(yǎng)后的THP-1細胞培養(yǎng)上清，1 000 r/min 離心5 min，取上清，按照ELISA試劑盒說明書操作，在450 nm處測定各組OD值，繪制標準曲線，計算各樣本數(shù)值。

2 結果

2.1HBV對THP-1巨噬細胞表面極化相關分子表達水平的影響 參考文獻[11]將CD86、CCR7作為巨噬細胞M1型極化的標志；將CD163、CD206作為巨噬細胞M2型極化的標志。流式結果顯示，與HepG2對照組細胞相比，同分泌HBV的HepG2.2.15細胞共培養(yǎng)24 h后，THP-1巨噬細胞表面CD86、CCR7表達水平升高(圖1A)；而CD163、CD206表達水平沒有差異(圖1B)。結果提示，HBV促進THP-1巨噬細胞向M1方向極化。

2.2HBcAg對THP-1巨噬細胞表面極化相關分子表達水平的影響 流式結果顯示，10 μg/ml HBcAg刺激后，THP-1巨噬細胞表面CD86、CD163、CD206表達較PBS對照組明顯升高，CCR7無明顯變化(圖2)。結果提示，HBcAg主要促進THP-1巨噬細胞向M2方向極化，但同時也促進M1型巨噬細胞CD86分子的表達。

圖1 THP-1巨噬細胞分別與HepG2和HepG2.2.15共培養(yǎng)后測定巨噬細胞極化相關表型的變化Fig.1 Changes of phenotypes of macrophages after THP-1 co-cultured with HepG2 and HepG2.2.15 respectivelyNote:Negative/positive gates are classified according to the isotype control.A.Changes of M1 phenotypes of macrophages;B.Changes of M2 phenotypes of macrophages.n=3.*.P<0.05，**.P<0.01.

圖2 THP-1巨噬細胞與HBcAg共培養(yǎng)后測定巨噬細胞極化相關表型的變化Fig.2 Changes of phenotypes of macrophages after THP-1 co-cultured with HBcAgNote:Negative/positive gates are classified according to isotype control.A.Changes of M1 phenotypes of macrophages;B.Changes of M2 phenotypes of macrophages.n=3.*.P<0.05，**.P<0.01.

2.3HBV以及HBcAg對THP-1巨噬細胞極化相關分子mRNA表達的影響 采用RT-qPCR方法驗證HBV以及HBcAg對THP-1巨噬細胞極化相關分子mRNA表達情況。在分別與HepG2細胞和HepG2.2.15細胞共培養(yǎng)24 h后，較HepG2對照組細胞而言，與HepG2.2.15細胞共培養(yǎng)的THP-1巨噬細胞CD86、CCR7的mRNA水平升高；而CD206、CD163的mRNA水平下降(圖3A)。 用10 μg/ml HBcAg作用THP-1巨噬細胞24 h后，較PBS對照組而言，THP-1巨噬細胞的 CD86、CCR7的mRNA表達水平無明顯變化；而CD206、CD163的mRNA表達水平明顯升高(圖3B)。

2.4HBV對THP-1巨噬細胞的細胞因子表達水平的影響 在分別與HepG2細胞和HepG2.2.15細胞共培養(yǎng)24 h后，較HepG2對照組細胞而言，與HepG2.2.15細胞共培養(yǎng)的THP-1巨噬細胞TNF-α、IL-6和IL-10的mRNA表達升高，而TGF-β的mRNA表達降低(圖4A)；而用ELISA測定與HepG 2細胞和HepG2.2.15細胞共培養(yǎng)24 h后的THP-1巨噬細胞培養(yǎng)上清中的細胞因子后發(fā)現(xiàn)，TNF-α、IL-6和IL-10的分泌增加，而TGF-β則無統(tǒng)計學差異(圖4B)。結果提示，HBV主要促進THP-1巨噬細胞分泌促炎因子。

2.5HBcAg對THP-1巨噬細胞的細胞因子表達水平的影響 在HBcAg共培養(yǎng)環(huán)境下，測定THP-1巨噬細胞相關細胞因子的mRNA表達情況。結果發(fā)現(xiàn)，與PBS對照組相比，HBcAg處理組能夠促進THP-1巨噬細胞中IL-10、TGF-β以及TNF-α的mRNA表達水平(圖5A)。收集共培養(yǎng)24 h后THP-1的細胞培養(yǎng)上清進行ELISA檢測，發(fā)現(xiàn)TGF-β、IL-10和TNF-α的分泌增加，而IL-6無統(tǒng)計學差異(圖5B)。結果提示，HBcAg主要促進THP-1巨噬細胞分泌抑炎因子，但同時也使部分促炎因子(如TNF-α)表達升高。

圖3 THP-1巨噬細胞分別與HepG2/HepG2.2.15(A)以及HBcAg(B)共培養(yǎng)后巨噬細胞極化相關表型的mRNA表達水平的變化Fig.3 mRNA expression level of phenotypes after THP-1 co-cultured with HepG2/HepG2.2.15(A) and HBcAg(B) respectivelyNote:A.mRNA expression level of M1 or M2 phenotypes when co-cultured with HepG2/HepG2.2.15;B.mRNA expression level of M1 or M2 phenotypes when co-cultured with HBcAg.n=3.*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001,****.P<0.000 1.

圖4 THP-1巨噬細胞分別與HepG2/HepG2.2.15共培養(yǎng)后相關細胞因子的mRNA表達(A)以及細胞因子分泌水平(B)的變化Fig.4 mRNA expression(A) and secretion level(B) of cytokines after THP-1 co-cultured with HepG2/HepG2.2.15 respectivelyNote:A.mRNA expression level of cytokines when co-cultured with HepG2/HepG2.2.15 for 24 h respectively;B.Changes of cytokines secreted by THP-1 co-cultured with HepG2/HepG2.2.15 for 24 h respectively.n=3.*.P<0.05，**.P<0.01.

圖5 THP-1巨噬細胞與HBcAg共培養(yǎng)后相關細胞因子的mRNA表達(A)以及細胞因子分泌水平(B)的變化Fig.5 mRNA expression(A) and secretion level(B) of cytokines after THP-1 co-cultured with HBcAgNote:A.mRNA expression level of cytokines when co-cultured with HBcAg for 24 h;B.Changes of cytokine secreted by THP-1 co-cultured with HBcAg for 24 h.n=3.*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001,****.P<0.0001.

3 討論

乙肝病毒被認為是一種“隱匿性病毒(stealth virus)”，感染HBV后機體損傷主要是因為病毒所誘發(fā)的免疫炎癥反應所引起，而非病毒對肝細胞的直接破壞[1,12]。研究發(fā)現(xiàn)，機體免疫反應不僅在HBV感染的病理損傷中發(fā)揮重要作用，在病程的慢性化過程中也有舉足輕重的影響，而巨噬細胞作為重要的固有免疫細胞，在慢性乙肝感染中的作用日益凸顯[13]。

由于巨噬細胞存在高度的異質性，它的極化與其功能有著密切關系，然而在慢性乙肝感染中，巨噬細胞的極化狀態(tài)與功能存在著諸多矛盾觀點。一方面，肝臟的枯否細胞主要表達M2型巨噬細胞極化標志，可通過分泌IL-10、TGF-β等細胞因子或上調抑制性受體PD-1的表達介導CD8+T細胞功能耗竭，從而抑制機體抗病毒免疫效應[10,14,15]，這種免疫耐受狀態(tài)能夠保護機體免受免疫炎癥的損傷，但也促進了乙肝病毒的免疫逃逸。有研究者將HBV耐受的小鼠體內枯否細胞清除后，隨著感染時間的延長，處于免疫耐受狀態(tài)的小鼠抗病毒免疫得以恢復，并逐步清除了 HBV病毒感染[16]。另一方面，有報道稱在感染HBV后，外周血中Ly6Chi單核細胞能夠遷移至肝臟并分化為促炎的M1型巨噬細胞，釋放炎癥因子，從而促進HBV清除，發(fā)揮重要的抗病毒作用[17,18]。在急性HBV感染中，巨噬細胞主要發(fā)揮促炎作用清除病毒，然而，在慢性HBV感染中，為了維持免疫微環(huán)境穩(wěn)態(tài)，防止過度的炎癥反應對肝臟的損傷，巨噬細胞更趨向于向M2方向極化[6,18]。與既往研究類似，我們的研究結果表明，用含有HBV病毒的細胞培養(yǎng)上清刺激巨噬細胞后，能夠促進其向促炎的M1方向極化并釋放大量炎癥因子，這提示HBV病毒感染能夠激活巨噬細胞的抗病毒反應[7]。

為了進一步闡述巨噬細胞在慢性乙肝中的極化狀態(tài)和功能，越來越多的研究著眼于HBV相關抗原的作用。體外實驗表明，HBsAg和HBeAg能夠抑制巨噬細胞上TLR所介導的固有免疫反應，削弱巨噬細胞的免疫應答，從而使HBV逃脫免疫清除[4,19]。但目前為止，針對慢性乙肝感染中HBcAg對巨噬細胞的功能和表型的影響尚存在一定爭議。HBcAg分子量為21 kD，它包裹HBV的前基因組RNA(pgRNA)并形成HBV的核衣殼蛋白[20]，小鼠體內實驗證實，HBcAg可通過TLR2通路來促進KCs分泌抑炎因子IL-10并導致T細胞耗竭從而介導乙肝的免疫耐受[10]；但近來有團隊發(fā)現(xiàn)，相較轉染了攜帶有HBV完整基因質粒的小鼠而言，轉染HBcAg缺陷的HBV質粒的小鼠，其HBV感染持續(xù)時間更長，提示HBcAg的缺失可能限制了免疫系統(tǒng)對HBV的清除[16,21]。本實驗發(fā)現(xiàn)，HBcAg對巨噬細胞的影響十分復雜。一方面HBcAg刺激能夠使得部分巨噬細胞向抗炎的M2方向極化，并分泌抑炎因子(如TGF-β、IL-10等)導致免疫耐受；另一方面也能夠促進部分巨噬細胞分泌促炎因子(如TNF-α)導致病毒清除。HBcAg對THP-1巨噬細胞極化和功能的復雜影響，反映了巨噬細胞在HBV慢性感染中的抗炎/促炎的“雙刃劍”作用，同時也說明了乙肝慢性感染機制的復雜性。此外，考慮到不同個體表現(xiàn)出的巨噬細胞異質性可能對乙肝病毒及乙肝相關抗原存在不同反應性，并最終導致疾病轉歸和預后的差異，針對HBcAg對巨噬細胞的極化和功能的影響尚需納入更多實驗進一步驗證。

綜上所述，通過比較HBV和HBcAg對巨噬細胞表型和功能的影響，我們發(fā)現(xiàn)HBV能夠使巨噬細胞向M1型方向極化，而HBcAg的作用主要促進巨噬細胞向M2極化，同時也上調CD86和TNF-α等M1型巨噬細胞標志的表達。這種對巨噬細胞極化和功能的差異效應可能在乙肝慢性化過程中發(fā)揮重要作用，值得未來進一步的探索研究。