秦皮乙素對(duì)Lewis肺癌小鼠凋亡及Wnt/β-catenin通路的影響

邢德君 孫慶霞 (吉林省腫瘤醫(yī)院內(nèi)三科，吉林 長(zhǎng)春 30000；吉林省前衛(wèi)醫(yī)院檢驗(yàn)科)

受大氣污染、環(huán)境致癌物及吸煙人群等因素的影響，肺癌的發(fā)病率逐年增加，其發(fā)病率及病死率均居于各類腫瘤的前列，危害巨大〔1〕。肺癌晚期患者的治療主要為化療、放療及靶向治療，其中化療選擇性較差，對(duì)人體正常細(xì)胞也有較大的影響，易產(chǎn)生惡心嘔吐、骨髓抑制、肝腎功能損害等諸多反應(yīng)；放療也會(huì)導(dǎo)致放射性肺炎、放射性脊髓病、放射性食管炎、放射性心包炎等危害；而靶向治療目前只有少數(shù)受體陽(yáng)性的肺癌患者才能采用，其療效也有待于進(jìn)一步評(píng)估〔2〕。因此，尋找對(duì)肺癌敏感的藥物是醫(yī)務(wù)人員及科研工作者始終關(guān)注的焦點(diǎn)問題。

秦皮乙素是從檸檬葉、苦櫪白蠟樹樹皮、地黃、曼陀羅、顛茄等植物中提取的單體成分，又稱6，7-二羥基香豆素，為香豆素的衍生物?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，秦皮乙素具有治療糖尿病、腸道疾病、保肝、化痰平喘、抗氧化、抗菌及抗炎等多種活性〔3〕。近年來(lái)，秦皮乙素在腫瘤治療中的應(yīng)用得到廣泛重視，其對(duì)白血病、骨髓瘤、腦膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌、腸癌、胰腺癌、肝癌及胃癌等均有治療作用〔4〕。秦皮乙素對(duì)人肺癌H460細(xì)胞也有一定的抑制作用，但相關(guān)研究?jī)H局限于體外實(shí)驗(yàn)，且作用機(jī)制并未闡明〔5〕。本研究選擇Lewis肺癌小鼠模型，在秦皮乙素抗肺癌作用的基礎(chǔ)上，探討其與凋亡及Wnt/β-catenin通路的相關(guān)性，旨在為臨床肺癌的治療尋找新的低毒、高效的化療藥物。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞與動(dòng)物 小鼠Lewis肺癌細(xì)胞，購(gòu)于美國(guó)ATCC公司，培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)液中(含10%胎牛血清)。雄性C57BL/6小鼠，6～8周齡，SPF級(jí)，購(gòu)于吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(吉)2016-0001；自由飲水，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2藥品與試劑 秦皮乙素〔高效液相色譜法(HPLC)>90%〕，南京道斯夫生物公司，批號(hào)：20180225；順鉑注射液，南京制藥公司，批號(hào)：20171109；胎牛血清及DMEM培養(yǎng)液，美國(guó)Gibco公司；Annexin-V-異硫氨酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡檢測(cè)試劑盒，美國(guó)BD公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，上海生科公司；實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)試劑盒，美國(guó)BD公司；caspase3、8和9活性測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所；β-catenin，Cyclin D1、c-Myc抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，上海碧云天公司。

1.3主要儀器設(shè)備 分析天平(FA2004B)，上海精科公司；CO2培養(yǎng)箱(BPN-150RHP)，上海一恒儀器公司；倒置顯微鏡(IX53)，日本奧林巴斯公司；流式細(xì)胞儀(FACSCanto Ⅱ)，美國(guó)BD公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(StepOne TM)，美國(guó)ABI公司；紫外/可見分光光度計(jì)(6010)，上?；萜諆x器公司。

1.4建立小鼠Lewis肺癌模型 將凍存的Lewis肺癌細(xì)胞復(fù)蘇并培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在C57BL/6小鼠背側(cè)皮下接種(0.2 ml)，2 w后，脫頸處死小鼠。常規(guī)消毒，將腫瘤組織剝離，于無(wú)菌平皿中剪碎，在組織研磨器中研磨；加入適量4℃生理鹽水，調(diào)整Lewis肺癌細(xì)胞液濃度為1×107/L。小鼠右腋皮下注射將上述細(xì)胞液0.2 ml以建立小鼠Lewis肺癌模型。

1.5分組及給藥 隨機(jī)分為模型組、順鉑組、秦皮乙素高劑量組及秦皮乙素低劑量組各12只。順鉑組(1 mg/kg)腹腔注射給藥，秦皮乙素高劑量組(100 mg/kg)及秦皮乙素低劑量組(50 mg/kg)灌胃給藥，模型組灌胃等體積溶媒；造模后第2天開始給藥，1次/d，共14 d。

1.6瘤質(zhì)量及抑瘤率測(cè)定 在末次給藥的次日，處死小鼠，無(wú)菌條件下將腫瘤組織剝離。用預(yù)冷的生理鹽水沖洗，并經(jīng)濾紙拭干后，稱量瘤質(zhì)量；按照公式計(jì)算抑瘤率。抑瘤率=(1-藥物組瘤質(zhì)量/模型組瘤質(zhì)量)×100%。

1.7凋亡率測(cè)定 常規(guī)方法制備瘤組織單細(xì)胞懸液，并用磷酸鹽緩沖液調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml，取100 μl細(xì)胞懸液至于1.5 ml離心管中。向離心管中再加入PI和Annexin-V-FITC溶液各5 μl，避光4℃條件下放置30 min，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.8Bax及Bcl-2 mRNA表達(dá)測(cè)定 取剪碎后的瘤塊組織，Trizol法提取瘤塊組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄法合成cDNA，引物序列信息如表1所示，由大連寶生物工程有限公司合成。采用實(shí)時(shí)定量PCR法測(cè)定Bax及Bcl-2 mRNA表達(dá)水平。擴(kuò)增條件為：96℃，預(yù)變性5 min；96℃變性30 s，62℃退火30 s，70℃延伸30 s，共計(jì)35個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行定量分析。

表1 引物序列信息

1.9caspase3、8和9活性測(cè)定 取剪碎后的瘤塊組織，在冰上加入預(yù)冷的裂解緩沖液，制備10%勻漿液。離心(10 000 r/min，5 min)，收集上清液，備用。利用紫外/可見分光光度計(jì)，按照試劑盒說(shuō)明書中的操作步驟，檢測(cè)瘤組織caspase3、8和9活性。

1.10Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白表達(dá)測(cè)定 取1.9中的10%瘤組織勻漿上清液，采用Western印跡法測(cè)定秦皮乙素對(duì)荷瘤小鼠瘤組織β-catenin、Cyclin D1和c-Myc蛋白表達(dá)的影響。二喹啉酸法測(cè)定上清液總蛋白濃度后，按比例將上清液與上樣緩沖液混合，加熱煮沸10 min進(jìn)行變性。加入20 μl蛋白樣品于加樣孔中，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。依次進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、一抗孵育、洗膜、二抗孵育、顯色及曝光等操作后；通過與內(nèi)參蛋白β-actin比較，分析目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1秦皮乙素對(duì)Lewis肺癌小鼠瘤質(zhì)量及抑瘤率的影響 與模型組比較，順鉑組、秦皮乙素高劑量組及秦皮乙素低劑量組瘤質(zhì)量均顯著降低(均P<0.05)；與順鉑組比較，秦皮乙素高劑量組及秦皮乙素低劑量組瘤質(zhì)量均顯著增加(均P<0.05)。見表2。

表2 各組瘤質(zhì)量及抑瘤率

與模型組比較：1)P<0.05；與順鉑組比較：2)P<0.05；下表同

2.2秦皮乙素對(duì)Lewis肺癌小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡率的影響 與模型組〔(8.75±1.23)%〕比較，順鉑組、秦皮乙素高劑量組及秦皮乙素低劑量組腫瘤細(xì)胞凋亡率〔(42.14±6.31)%、(33.46±5.80)%、(20.82±3.79)%〕顯著增加(P<0.05)；與順鉑組比較，秦皮乙素高劑量組及秦皮乙素低劑量組腫瘤細(xì)胞凋亡率均顯著降低(P<0.05)，且秦皮乙素高劑量組誘導(dǎo)凋亡效果優(yōu)于秦皮乙素低劑量組。見圖1。

2.3秦皮乙素對(duì)Lewis肺癌小鼠腫瘤組織Bax及Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響 與模型組比較，順鉑組、秦皮乙素高劑量組及秦皮乙素低劑量組腫瘤組織Bax mRNA表達(dá)顯著增加，而Bcl-2 mRNA表達(dá)顯著降低(均P<0.05)；與順鉑組比較，秦皮乙素高劑量組及秦皮乙素低劑量組腫瘤組織Bax mRNA表達(dá)顯著降低，而Bcl-2 mRNA表達(dá)顯著增加(均P<0.05)。見表3。

2.4秦皮乙素對(duì)Lewis肺癌小鼠腫瘤組織caspase3、8和9活性的影響 與模型組比較，順鉑組、秦皮乙素高劑量組及秦皮乙素低劑量組caspase3、8和9活性均顯著增加(均P<0.05)；與順鉑組比較，秦皮乙素高劑量組及秦皮乙素低劑量組caspase3、8和9活性均顯著降低(均P<0.05)。見表3。

2.5秦皮乙素對(duì)Lewis肺癌小鼠腫瘤組織Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與模型組比較，順鉑組、秦皮乙素高劑量組及秦皮乙素低劑量組β-catenin、Cyclin D1和c-Myc蛋白表達(dá)被明顯抑制，表達(dá)量均顯著降低(均P<0.05)；與順鉑組比較，秦皮乙素高劑量組及秦皮乙素低劑量組β-catenin、Cyclin D1和c-Myc蛋白表達(dá)均顯著增加(均P<0.05)。見表4和圖2。

圖1 秦皮乙素對(duì)Lewis肺癌小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡率的影響

組別BaxBcl-2caspase3(U/mg)caspase8(U/mg)caspase9(U/mg)模型組0.41±0.050.74±0.090.54±0.070.45±0.050.24±0.02順鉑組1.13±0.201)0.23±0.031)1.87±0.221)0.98±0.131)0.62±0.071)秦皮乙素高劑量組0.97±0.141)2)0.32±0.041)2)1.69±0.151)2)0.77±0.081)2)0.56±0.061)2)秦皮乙素低劑量組0.86±0.111)2)0.59±0.081)2)1.31±0.211)2)0.62±0.091)2)0.45±0.041)2)

表4 各組腫瘤組織Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白表達(dá)

圖2 Western印跡檢測(cè)秦皮乙素各組腫瘤組織Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討 論

腫瘤細(xì)胞凋亡過程受阻是腫瘤發(fā)生的重要因素〔6〕。本研究提示秦皮乙素抑制Lewis肺癌小鼠的腫瘤生長(zhǎng)與誘導(dǎo)凋亡作用有關(guān)。Bcl-2基因家族在線粒體通路調(diào)控細(xì)胞凋亡進(jìn)程中有關(guān)鍵性重要作用，其中Bax和Bcl-2是功能截然相反的兩個(gè)基因，Bax可促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡，而Bcl-2主要抑制細(xì)胞凋亡進(jìn)程，二者共同調(diào)控線粒體功能介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡〔7〕。本研究證明秦皮乙素可誘導(dǎo)Lewis肺癌小鼠腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。秦皮乙素還可抑制肺瘤小鼠腫瘤組織caspase3、8和9的活性。caspase3的活化標(biāo)志著凋亡進(jìn)入不可逆階段，是細(xì)胞凋亡的主要效應(yīng)分子，為caspase家族中最為重要的凋亡執(zhí)行者〔8〕。caspase8具有活化下游caspase3、6和7的作用，而caspase9可以與凋亡相關(guān)因子1結(jié)合聚合形成凋亡小體，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡〔9〕。本研究結(jié)果表明，秦皮乙素抑制Lewis肺癌小鼠腫瘤生長(zhǎng)的作用與誘導(dǎo)凋亡有關(guān)。Wnt信號(hào)通路包括Wnt/β-catenin信號(hào)通路、平面細(xì)胞極性信號(hào)通路及Wnt/Ca2+信號(hào)通路，其中經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的凋亡、周期及增殖等過程〔10〕。研究表明〔11〕，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異?；罨c肺癌、前列腺癌、膀胱癌、結(jié)腸癌等相關(guān)，其中Wnt信號(hào)通路中最關(guān)鍵的轉(zhuǎn)導(dǎo)因子β-catenin，參與調(diào)控細(xì)胞凋亡、分化、生長(zhǎng)及黏附等過程。β-catenin活化后，下游Cyclin D1、c-Myc等效應(yīng)分子表達(dá)增加，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生〔12〕。另有研究表明〔13〕，肺癌與Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)系密切，可影響肺癌的惡性程度，決定著患者生存與預(yù)后情況。因而，Wnt/β-catenin信號(hào)通路可作為肺癌治療的靶點(diǎn)，抑制該通路的激活，可起到抗肺癌作用〔14〕。本研究表明秦皮乙素具有抑制Wnt/β-catenin通路活化的作用。綜上，秦皮乙素可通過誘導(dǎo)凋亡及抑制Wnt/β-catenin通路激活，發(fā)揮抑制Lewis肺癌小鼠腫瘤生長(zhǎng)的作用，但具體機(jī)制還有待于深入研究。