拉曼光譜聯(lián)合ICP-AES 法鑒定鹿茸真?zhèn)?/h1>
2020-05-12 13:37:46源高麗君韓笑苑廣信孫晶波
中成藥 2020年2期
馮 源高麗君韓 笑苑廣信孫晶波?
（1.北華大學(xué)藥學(xué)院，吉林 吉林 132013；2.北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 吉林 132013）
鹿茸是指梅花鹿或馬鹿的雄鹿未骨化而帶茸毛的幼角，是名貴的藥材［1］?！侗静菥V目》 記載鹿茸、鹿角、鹿角膠、鹿角霜、鹿鞭、鹿血、鹿腦、鹿尾、鹿腎、鹿筋、鹿脂、鹿肉、鹿頭肉、鹿骨、鹿齒、鹿髓等都可入藥，有極高的藥用價(jià)值和保健功能，能夠預(yù)防和治療多種疾病。而鹿的初生幼角—鹿茸更是被視作“寶中之寶”［2］。鹿茸中的性激素對(duì)女性的更年期綜合征有預(yù)防和治療作用，其中的生物堿基，包括尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷等具有抑制單胺氧化酶的抗衰老作用，尤其有研究表明其中含有的胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF-1），對(duì)糖尿病及其并發(fā)癥有特殊的療效［3］。鹿茸中也含有豐富的微量元素，如Ca、Co、Mg、P、Mn、Cu 等微量元素，這些微量元素不僅參與骨骼和軟組織的構(gòu)成，也是細(xì)胞中許多維持生命的化合物的重要成分，并能夠促進(jìn)人體對(duì)鹿茸中有效成份的吸收［4］。然而市場(chǎng)上常有采用茸角無藥效動(dòng)物，如水鹿、白臀鹿、白唇皮等茸角偽充鹿茸銷售［5］。為更好地鑒別鹿茸樣品的真?zhèn)危环N快速有效的鑒別方法尤為重要。
拉曼光譜（SERS），是一種散射光譜。無論樣品是固體、液體、膠體、粉末、還是軟膏都可以快速表征其化學(xué)成分和結(jié)構(gòu)［6］。相比于其他常規(guī)分析方法，具有樣品制備簡(jiǎn)單，操作方便，不受水份干擾，樣品可回收，綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)［7］。近年來SERS 也多被用于食品、藥品、生物制品的鑒定中。其具有檢測(cè)限低、吸附選擇性良好，可以增強(qiáng)振動(dòng)信號(hào)的優(yōu)點(diǎn)，因此在中藥鑒定中具有重要意義［4］。
電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜（ICP-AES），利用樣品受到激發(fā)后發(fā)射出光譜的波長(zhǎng)及強(qiáng)度，對(duì)樣品進(jìn)行定性及定量分析。目前多用ICP 作為激發(fā)光源，ICP-AES 方法具有檢出限低、精確度高、選擇性好、線性范圍寬、分析速度快、測(cè)定范圍廣等特點(diǎn)，能夠同時(shí)測(cè)定多種元素，從而被廣泛應(yīng)用于中藥分析［8］。
鹿茸中有效成分復(fù)雜，依靠單一組分無法進(jìn)行真?zhèn)舞b別［2］。SERS 法可以直接測(cè)得鹿茸樣品，全面表征其中多種成分的共同特征［9］；而ICP-AES 可同時(shí)檢測(cè)樣品中多種微量元素，借以對(duì)不同樣品進(jìn)行分析、鑒別［7］。鑒于上述分析，課題組采用上述2 種方法相結(jié)合對(duì)鹿茸進(jìn)行定性鑒定，以期建立快速、穩(wěn)定、有效的真?zhèn)舞b別方法［10］。
1 方法
1.1 材料 Renishaw inVia 顯微拉曼光譜儀（英國(guó)雷尼紹公司）；VISTA-MPX 電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀（美國(guó)瓦瑞安公司）；MAS 微波消解儀（上海新儀微波化學(xué)科技有限公司）。硝酸、濃鹽酸均為優(yōu)級(jí)純、溴化鉀、硝酸銀、檸檬酸三鈉，均購(gòu)自吉林市欣利化學(xué)試劑有限公司。標(biāo)準(zhǔn)離子貯備液：國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 μg/mL），購(gòu)自國(guó)家鋼鐵材料測(cè)試中心鋼鐵研究總院。
實(shí)驗(yàn)所用20 例正品鹿茸樣品為梅花鹿茸和馬鹿茸樣品（北京同仁堂新城藥店、吉林省長(zhǎng)春市雙陽(yáng)區(qū)鹿鄉(xiāng)、吉林省吉林市匯豐參茸行、吉林省吉林市龍?zhí)秴^(qū)鹿廠）；35 例偽品鹿茸（國(guó)藥控股國(guó)大藥店、安國(guó)萬(wàn)達(dá)、史有開中醫(yī)診所、恒瑞白云店、吉林省長(zhǎng)春市雙陽(yáng)區(qū)鹿鄉(xiāng)、珠海生來堂藥店、吉林省吉林市匯豐參茸行）。所有樣品均經(jīng)吉林市食品藥品檢定所金英蘭主任藥師進(jìn)行真?zhèn)舞b定。
1.2 測(cè)試條件
1.2.1 SERS 條件 光譜測(cè)量范圍0～3 200 cm-1；采用波長(zhǎng)為633 nm 激光作為光源；總功率20 mA；物鏡50 倍；激發(fā)光源的強(qiáng)度均為10%；掃描時(shí)間約1 min；平均掃描3次［11］。最佳檢測(cè)波長(zhǎng)見表1。
1.2.2 ICP-AES 條件功率 1 000 W；等離子 氣15 mL/min；輔助氣體積流量200 kPa；霧化氣、自動(dòng)積分及接口吹掃均開啟；采用多色器高吹。
表1 各元素最佳檢測(cè)波長(zhǎng)
1.3 處理方法
1.3.1 樣品處理 鹿茸粉末，取鹿茸切片，冷凍干燥48 h，取出，研磨，過100 目篩，分別放入1.5 mL EP 管中，編號(hào)，于4 ℃條下保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.2 銀膠溶液配制 參考Lee 等［12］的方法，以檸檬酸三鈉還原硝酸銀制備銀納米粒子。取硝酸銀溶液100 mL 放于磁力攪拌器上攪拌（1 000 r/min）加熱至90 ℃，再將2.6 mL 檸檬酸三鈉溶液（0.039 mol/L）逐滴加入，保持90 ℃恒 溫1 h，直到溶 液呈黃綠色，避光保存（現(xiàn)配現(xiàn)用）。
1.3.3 SERS 法 取適量樣品置于載玻片上，滴加“1.3.2”項(xiàng)下新制銀膠溶液，待其成糊狀后，用載玻片壓平并進(jìn)行拉曼掃描檢測(cè)。
1.3.4 ICP-AES 方法 取樣品0.2 g 于消化管中，依次加入濃硝酸6 mL、濃鹽酸2 mL，浸泡24 h，將消化管放入微波消解儀器中，消解功率1 000 W，升溫8 min 至110 ℃保持6 min，再升溫至140 ℃維持6 min，升溫至180 ℃維持30 min，消解完成后將消化管直接放入加熱套中，150 ℃條件下趕酸，待酸剩余1 mL 左右取出，將剩余液體轉(zhuǎn)入25 mL 量瓶中，用去離子水定容后直接進(jìn)樣、檢測(cè)。
1.4 數(shù)據(jù)處理
1.4.1 SERS 數(shù)據(jù)預(yù)處理 為排除其他因素對(duì)SERS 的影響，應(yīng)用Origin8.0 軟件對(duì)SERS 進(jìn)行平滑處理以消除噪聲，得到SERS 信號(hào)，進(jìn)而在0～3 500 cm-1范圍內(nèi)對(duì)每條譜線進(jìn)行歸一化處理，便于比較不同光譜的形狀及光譜強(qiáng)度之間的差異，最后得出真、偽鹿茸樣品的平均表面增強(qiáng)拉曼光譜。
1.4.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0 對(duì)兩獨(dú)立樣本的強(qiáng)度均值進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析；建立Fisher 識(shí)別函數(shù)。
1.4.3 ICP-AES 選取鹿茸中所含的5 種人體必需的常量元素，Ca、K、Mg、P、Na；人體必需的微量元素，F(xiàn)e、Zn、Mn、Sr、Cr；一般無機(jī)元素，Ba 為代表，進(jìn)行ICPAES 檢測(cè)［13］。運(yùn)用Graphpad prism 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，建立元素含有量折線圖，以便于對(duì)鹿茸樣品中元素含有量進(jìn)行快速分析。
2 結(jié)果與討論
2.1 拉曼光譜及分析
2.1.1 條件及方法選擇 鹿茸樣品的常規(guī)拉曼光譜以及表面增強(qiáng)拉曼光譜，見圖1，鹿茸粉末直接測(cè)試?yán)庾V（1A）沒有明顯的特征吸收峰，只有一個(gè)熒光包，這應(yīng)該是由于中藥材中成分含有量復(fù)雜、自身熒光較強(qiáng)導(dǎo)致的。然而經(jīng)過測(cè)試，滴加了新制銀膠溶液的鹿茸樣品，則出現(xiàn)了多個(gè)吸收峰，選取多個(gè)樣品點(diǎn)，驗(yàn)證得出了SERS 圖，該圖非常穩(wěn)定，特征拉曼吸收峰的位置固定，因此可用來鑒別鹿茸的真?zhèn)巍?/p>
圖1 鹿茸粉末樣品SERS 圖
2.1.2 結(jié)果 掃描后運(yùn)用Origin8.0 軟件得正品和偽品鹿茸2 組樣品面積歸一化后的SERS 光譜，見圖2，選取0～3 500 cm-1的區(qū)間范圍作為研究對(duì)象，鹿茸的生物分子歸屬見表2［14-21］。真、偽鹿茸的平均SERS 光譜的形態(tài)和譜峰大體相 似。主要的 譜峰位 于155、227、723、954、999、1 094、1 322、1 460、1 587、2 918 cm-1位移處，但譜峰強(qiáng)度存在差異（P＜0.05），進(jìn)一步采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較，結(jié)果 顯示在155、227、723、954、999、1 094、1 322、1 460、1 587 cm-1位移處正品鹿茸的SERS強(qiáng)度強(qiáng)于偽品鹿茸（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在2 918 cm-1位移處偽品鹿茸的 SERS 強(qiáng)度強(qiáng)于正品（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。真?zhèn)? 組鹿茸樣品的SERS 光譜強(qiáng)度比較，見表3。
表2 鹿茸SERS 譜峰歸屬
2.1.3 Fisher 識(shí)別函數(shù)建立 分別選取5 個(gè)經(jīng)上述拉曼檢測(cè)已知真?zhèn)蔚穆谷渍芳皞纹窐悠窔w一化的SERS 吸收峰強(qiáng)度值，運(yùn)用SPSS 16.0 建立判別鹿茸樣品真?zhèn)蔚腇isher識(shí)別函數(shù)，通過計(jì)算得出正品及偽品的判別函數(shù)如下，（F1 代表正品鹿茸樣品組，F(xiàn)2 代表偽品鹿茸樣品組，X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7分別為鹿茸155、227、723、959、999、1 094、1 322 cm-1位移所對(duì)應(yīng)的拉曼強(qiáng)度）。
圖2 正品與偽品鹿茸歸一化后平均SERS 光譜
表3 真?zhèn)? 組鹿茸樣品的SERS 光譜強(qiáng)度比較
若F2＞F1，鹿茸為偽品；F2＜F1，鹿茸為正品。
2.1.4Fisher識(shí)別函數(shù)驗(yàn)證 表4 表明，55 個(gè)鹿茸樣品中，20 個(gè)鹿茸樣品有19 個(gè)準(zhǔn)確識(shí)別，準(zhǔn)確率為95%；35個(gè)偽劣鹿茸中有34 個(gè)準(zhǔn)確識(shí)別，準(zhǔn)確率為97%。由此可見Fisher 函數(shù)對(duì)已知真?zhèn)蔚穆谷拙哂泻芎玫淖R(shí)別效果，這一方法可用于未知鹿茸樣品鑒別。
表4 識(shí)別函數(shù)對(duì)已知樣本的識(shí)別效果
2.2 微量元素含有量 將上述53 種來源不同的真、偽鹿茸片進(jìn)行ICP-AES 檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見表5～6。
表5 不同來源正品鹿茸片中11 種微量元素含有量平均值（n＝5，mg/kg）
本研究檢測(cè)了鹿茸樣品中Ba、Ca、Cr、Fe、K、Mg、Mn、Na、P、Sr、Zn 等11 種元素的含有量，見圖3～4，其中Na 元素的含有量在20 例正品鹿茸中的平均含有量1 000≤Na ≤1 500 mg/kg，而偽品鹿茸中含有量為Na ＜1 000 mg/kg；正品鹿茸中K 元素含有量均大于等于500 mg/kg，偽品鹿茸K＜500 mg/kg。通過計(jì)算元素含有量的平均值，見表5～6，發(fā)現(xiàn)正品鹿茸中Ca、Mg、Na、P、Zn 的含有量平均高于偽品鹿茸，而Fe、Sr 的平均含有量偽品鹿茸高于正品鹿茸，但差距不是很大。
圖3 真?zhèn)温谷讟悠分蠳a 元素平均含有量走勢(shì)圖
表6 不同來源偽品鹿茸片中11 種微量元素含有量平均值（mg/kg）
圖4 真?zhèn)温谷讟悠分蠯 元素平均含有量走勢(shì)圖
3 結(jié)論
中藥成分含有量復(fù)雜，各成分含有量比例也不同，因此其光譜也具有差異［22］，本研究利用表面增強(qiáng)SERS 法、微量元素檢測(cè)法對(duì)55 種鹿茸樣品進(jìn)行分析。運(yùn)用SERS 法可以通過155、227、723、954、999、1 094、1 322、1 460、1 587 cm-1位移處正品鹿茸的SERS 強(qiáng)度強(qiáng)于偽品鹿茸（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在2 918 cm-1位移處偽品鹿茸的SERS 強(qiáng)度強(qiáng)于正品（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)行鹿茸的真?zhèn)舞b別且通過SERS 檢測(cè)所得拉曼強(qiáng)度建立的Fisher 識(shí)別函數(shù)，對(duì)已知鹿茸的鑒別正確率達(dá)96%，因此可以通過Fisher 識(shí)別函數(shù)結(jié)合拉曼光譜法實(shí)現(xiàn)對(duì)鹿茸的準(zhǔn)確識(shí)別。
微量元素檢測(cè)法可以通過分析人體必需常量元素Na、K 元素在鹿茸中的含有量對(duì)真?zhèn)温谷走M(jìn)行鑒別，正品鹿茸中Na 元素含有量應(yīng)1 000 ≤Na ≤1 500 mg/kg、K 元素含有量也應(yīng)大于等于500 mg/kg［23］。
因此，表面增強(qiáng)拉曼光譜法聯(lián)合應(yīng)用Fisher 識(shí)別函數(shù)以及微量元素檢測(cè)法更適用于對(duì)鹿茸樣品的鑒別，該方法準(zhǔn)確、有效。根據(jù)研究結(jié)果建立鹿茸真?zhèn)蔚蔫b別方法，利用鹿茸對(duì)照品建立其表面增強(qiáng)拉曼光譜庫(kù)，以期為鹿茸的研究提供依據(jù)。
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馮 源高麗君韓 笑苑廣信孫晶波?
（1.北華大學(xué)藥學(xué)院，吉林 吉林 132013；2.北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 吉林 132013）
鹿茸是指梅花鹿或馬鹿的雄鹿未骨化而帶茸毛的幼角，是名貴的藥材［1］?！侗静菥V目》 記載鹿茸、鹿角、鹿角膠、鹿角霜、鹿鞭、鹿血、鹿腦、鹿尾、鹿腎、鹿筋、鹿脂、鹿肉、鹿頭肉、鹿骨、鹿齒、鹿髓等都可入藥，有極高的藥用價(jià)值和保健功能，能夠預(yù)防和治療多種疾病。而鹿的初生幼角—鹿茸更是被視作“寶中之寶”［2］。鹿茸中的性激素對(duì)女性的更年期綜合征有預(yù)防和治療作用，其中的生物堿基，包括尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷等具有抑制單胺氧化酶的抗衰老作用，尤其有研究表明其中含有的胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF-1），對(duì)糖尿病及其并發(fā)癥有特殊的療效［3］。鹿茸中也含有豐富的微量元素，如Ca、Co、Mg、P、Mn、Cu 等微量元素，這些微量元素不僅參與骨骼和軟組織的構(gòu)成，也是細(xì)胞中許多維持生命的化合物的重要成分，并能夠促進(jìn)人體對(duì)鹿茸中有效成份的吸收［4］。然而市場(chǎng)上常有采用茸角無藥效動(dòng)物，如水鹿、白臀鹿、白唇皮等茸角偽充鹿茸銷售［5］。為更好地鑒別鹿茸樣品的真?zhèn)危环N快速有效的鑒別方法尤為重要。
拉曼光譜（SERS），是一種散射光譜。無論樣品是固體、液體、膠體、粉末、還是軟膏都可以快速表征其化學(xué)成分和結(jié)構(gòu)［6］。相比于其他常規(guī)分析方法，具有樣品制備簡(jiǎn)單，操作方便，不受水份干擾，樣品可回收，綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)［7］。近年來SERS 也多被用于食品、藥品、生物制品的鑒定中。其具有檢測(cè)限低、吸附選擇性良好，可以增強(qiáng)振動(dòng)信號(hào)的優(yōu)點(diǎn)，因此在中藥鑒定中具有重要意義［4］。
電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜（ICP-AES），利用樣品受到激發(fā)后發(fā)射出光譜的波長(zhǎng)及強(qiáng)度，對(duì)樣品進(jìn)行定性及定量分析。目前多用ICP 作為激發(fā)光源，ICP-AES 方法具有檢出限低、精確度高、選擇性好、線性范圍寬、分析速度快、測(cè)定范圍廣等特點(diǎn)，能夠同時(shí)測(cè)定多種元素，從而被廣泛應(yīng)用于中藥分析［8］。
鹿茸中有效成分復(fù)雜，依靠單一組分無法進(jìn)行真?zhèn)舞b別［2］。SERS 法可以直接測(cè)得鹿茸樣品，全面表征其中多種成分的共同特征［9］；而ICP-AES 可同時(shí)檢測(cè)樣品中多種微量元素，借以對(duì)不同樣品進(jìn)行分析、鑒別［7］。鑒于上述分析，課題組采用上述2 種方法相結(jié)合對(duì)鹿茸進(jìn)行定性鑒定，以期建立快速、穩(wěn)定、有效的真?zhèn)舞b別方法［10］。
1 方法
1.1 材料 Renishaw inVia 顯微拉曼光譜儀（英國(guó)雷尼紹公司）；VISTA-MPX 電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀（美國(guó)瓦瑞安公司）；MAS 微波消解儀（上海新儀微波化學(xué)科技有限公司）。硝酸、濃鹽酸均為優(yōu)級(jí)純、溴化鉀、硝酸銀、檸檬酸三鈉，均購(gòu)自吉林市欣利化學(xué)試劑有限公司。標(biāo)準(zhǔn)離子貯備液：國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 μg/mL），購(gòu)自國(guó)家鋼鐵材料測(cè)試中心鋼鐵研究總院。
實(shí)驗(yàn)所用20 例正品鹿茸樣品為梅花鹿茸和馬鹿茸樣品（北京同仁堂新城藥店、吉林省長(zhǎng)春市雙陽(yáng)區(qū)鹿鄉(xiāng)、吉林省吉林市匯豐參茸行、吉林省吉林市龍?zhí)秴^(qū)鹿廠）；35 例偽品鹿茸（國(guó)藥控股國(guó)大藥店、安國(guó)萬(wàn)達(dá)、史有開中醫(yī)診所、恒瑞白云店、吉林省長(zhǎng)春市雙陽(yáng)區(qū)鹿鄉(xiāng)、珠海生來堂藥店、吉林省吉林市匯豐參茸行）。所有樣品均經(jīng)吉林市食品藥品檢定所金英蘭主任藥師進(jìn)行真?zhèn)舞b定。
1.2 測(cè)試條件
1.2.1 SERS 條件 光譜測(cè)量范圍0～3 200 cm-1；采用波長(zhǎng)為633 nm 激光作為光源；總功率20 mA；物鏡50 倍；激發(fā)光源的強(qiáng)度均為10%；掃描時(shí)間約1 min；平均掃描3次［11］。最佳檢測(cè)波長(zhǎng)見表1。
1.2.2 ICP-AES 條件功率 1 000 W；等離子 氣15 mL/min；輔助氣體積流量200 kPa；霧化氣、自動(dòng)積分及接口吹掃均開啟；采用多色器高吹。
表1 各元素最佳檢測(cè)波長(zhǎng)
1.3 處理方法
1.3.1 樣品處理 鹿茸粉末，取鹿茸切片，冷凍干燥48 h，取出，研磨，過100 目篩，分別放入1.5 mL EP 管中，編號(hào)，于4 ℃條下保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.2 銀膠溶液配制 參考Lee 等［12］的方法，以檸檬酸三鈉還原硝酸銀制備銀納米粒子。取硝酸銀溶液100 mL 放于磁力攪拌器上攪拌（1 000 r/min）加熱至90 ℃，再將2.6 mL 檸檬酸三鈉溶液（0.039 mol/L）逐滴加入，保持90 ℃恒 溫1 h，直到溶 液呈黃綠色，避光保存（現(xiàn)配現(xiàn)用）。
1.3.3 SERS 法 取適量樣品置于載玻片上，滴加“1.3.2”項(xiàng)下新制銀膠溶液，待其成糊狀后，用載玻片壓平并進(jìn)行拉曼掃描檢測(cè)。
1.3.4 ICP-AES 方法 取樣品0.2 g 于消化管中，依次加入濃硝酸6 mL、濃鹽酸2 mL，浸泡24 h，將消化管放入微波消解儀器中，消解功率1 000 W，升溫8 min 至110 ℃保持6 min，再升溫至140 ℃維持6 min，升溫至180 ℃維持30 min，消解完成后將消化管直接放入加熱套中，150 ℃條件下趕酸，待酸剩余1 mL 左右取出，將剩余液體轉(zhuǎn)入25 mL 量瓶中，用去離子水定容后直接進(jìn)樣、檢測(cè)。
1.4 數(shù)據(jù)處理
1.4.1 SERS 數(shù)據(jù)預(yù)處理 為排除其他因素對(duì)SERS 的影響，應(yīng)用Origin8.0 軟件對(duì)SERS 進(jìn)行平滑處理以消除噪聲，得到SERS 信號(hào)，進(jìn)而在0～3 500 cm-1范圍內(nèi)對(duì)每條譜線進(jìn)行歸一化處理，便于比較不同光譜的形狀及光譜強(qiáng)度之間的差異，最后得出真、偽鹿茸樣品的平均表面增強(qiáng)拉曼光譜。
1.4.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0 對(duì)兩獨(dú)立樣本的強(qiáng)度均值進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析；建立Fisher 識(shí)別函數(shù)。
1.4.3 ICP-AES 選取鹿茸中所含的5 種人體必需的常量元素，Ca、K、Mg、P、Na；人體必需的微量元素，F(xiàn)e、Zn、Mn、Sr、Cr；一般無機(jī)元素，Ba 為代表，進(jìn)行ICPAES 檢測(cè)［13］。運(yùn)用Graphpad prism 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，建立元素含有量折線圖，以便于對(duì)鹿茸樣品中元素含有量進(jìn)行快速分析。
2 結(jié)果與討論
2.1 拉曼光譜及分析
2.1.1 條件及方法選擇 鹿茸樣品的常規(guī)拉曼光譜以及表面增強(qiáng)拉曼光譜，見圖1，鹿茸粉末直接測(cè)試?yán)庾V（1A）沒有明顯的特征吸收峰，只有一個(gè)熒光包，這應(yīng)該是由于中藥材中成分含有量復(fù)雜、自身熒光較強(qiáng)導(dǎo)致的。然而經(jīng)過測(cè)試，滴加了新制銀膠溶液的鹿茸樣品，則出現(xiàn)了多個(gè)吸收峰，選取多個(gè)樣品點(diǎn)，驗(yàn)證得出了SERS 圖，該圖非常穩(wěn)定，特征拉曼吸收峰的位置固定，因此可用來鑒別鹿茸的真?zhèn)巍?/p>
圖1 鹿茸粉末樣品SERS 圖
2.1.2 結(jié)果 掃描后運(yùn)用Origin8.0 軟件得正品和偽品鹿茸2 組樣品面積歸一化后的SERS 光譜，見圖2，選取0～3 500 cm-1的區(qū)間范圍作為研究對(duì)象，鹿茸的生物分子歸屬見表2［14-21］。真、偽鹿茸的平均SERS 光譜的形態(tài)和譜峰大體相 似。主要的 譜峰位 于155、227、723、954、999、1 094、1 322、1 460、1 587、2 918 cm-1位移處，但譜峰強(qiáng)度存在差異（P＜0.05），進(jìn)一步采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較，結(jié)果 顯示在155、227、723、954、999、1 094、1 322、1 460、1 587 cm-1位移處正品鹿茸的SERS強(qiáng)度強(qiáng)于偽品鹿茸（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在2 918 cm-1位移處偽品鹿茸的 SERS 強(qiáng)度強(qiáng)于正品（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。真?zhèn)? 組鹿茸樣品的SERS 光譜強(qiáng)度比較，見表3。
表2 鹿茸SERS 譜峰歸屬
2.1.3 Fisher 識(shí)別函數(shù)建立 分別選取5 個(gè)經(jīng)上述拉曼檢測(cè)已知真?zhèn)蔚穆谷渍芳皞纹窐悠窔w一化的SERS 吸收峰強(qiáng)度值，運(yùn)用SPSS 16.0 建立判別鹿茸樣品真?zhèn)蔚腇isher識(shí)別函數(shù)，通過計(jì)算得出正品及偽品的判別函數(shù)如下，（F1 代表正品鹿茸樣品組，F(xiàn)2 代表偽品鹿茸樣品組，X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7分別為鹿茸155、227、723、959、999、1 094、1 322 cm-1位移所對(duì)應(yīng)的拉曼強(qiáng)度）。
圖2 正品與偽品鹿茸歸一化后平均SERS 光譜
表3 真?zhèn)? 組鹿茸樣品的SERS 光譜強(qiáng)度比較
若F2＞F1，鹿茸為偽品；F2＜F1，鹿茸為正品。
2.1.4Fisher識(shí)別函數(shù)驗(yàn)證 表4 表明，55 個(gè)鹿茸樣品中，20 個(gè)鹿茸樣品有19 個(gè)準(zhǔn)確識(shí)別，準(zhǔn)確率為95%；35個(gè)偽劣鹿茸中有34 個(gè)準(zhǔn)確識(shí)別，準(zhǔn)確率為97%。由此可見Fisher 函數(shù)對(duì)已知真?zhèn)蔚穆谷拙哂泻芎玫淖R(shí)別效果，這一方法可用于未知鹿茸樣品鑒別。
表4 識(shí)別函數(shù)對(duì)已知樣本的識(shí)別效果
2.2 微量元素含有量 將上述53 種來源不同的真、偽鹿茸片進(jìn)行ICP-AES 檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見表5～6。
表5 不同來源正品鹿茸片中11 種微量元素含有量平均值（n＝5，mg/kg）
本研究檢測(cè)了鹿茸樣品中Ba、Ca、Cr、Fe、K、Mg、Mn、Na、P、Sr、Zn 等11 種元素的含有量，見圖3～4，其中Na 元素的含有量在20 例正品鹿茸中的平均含有量1 000≤Na ≤1 500 mg/kg，而偽品鹿茸中含有量為Na ＜1 000 mg/kg；正品鹿茸中K 元素含有量均大于等于500 mg/kg，偽品鹿茸K＜500 mg/kg。通過計(jì)算元素含有量的平均值，見表5～6，發(fā)現(xiàn)正品鹿茸中Ca、Mg、Na、P、Zn 的含有量平均高于偽品鹿茸，而Fe、Sr 的平均含有量偽品鹿茸高于正品鹿茸，但差距不是很大。
圖3 真?zhèn)温谷讟悠分蠳a 元素平均含有量走勢(shì)圖
表6 不同來源偽品鹿茸片中11 種微量元素含有量平均值（mg/kg）
圖4 真?zhèn)温谷讟悠分蠯 元素平均含有量走勢(shì)圖
3 結(jié)論
中藥成分含有量復(fù)雜，各成分含有量比例也不同，因此其光譜也具有差異［22］，本研究利用表面增強(qiáng)SERS 法、微量元素檢測(cè)法對(duì)55 種鹿茸樣品進(jìn)行分析。運(yùn)用SERS 法可以通過155、227、723、954、999、1 094、1 322、1 460、1 587 cm-1位移處正品鹿茸的SERS 強(qiáng)度強(qiáng)于偽品鹿茸（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在2 918 cm-1位移處偽品鹿茸的SERS 強(qiáng)度強(qiáng)于正品（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)行鹿茸的真?zhèn)舞b別且通過SERS 檢測(cè)所得拉曼強(qiáng)度建立的Fisher 識(shí)別函數(shù)，對(duì)已知鹿茸的鑒別正確率達(dá)96%，因此可以通過Fisher 識(shí)別函數(shù)結(jié)合拉曼光譜法實(shí)現(xiàn)對(duì)鹿茸的準(zhǔn)確識(shí)別。
微量元素檢測(cè)法可以通過分析人體必需常量元素Na、K 元素在鹿茸中的含有量對(duì)真?zhèn)温谷走M(jìn)行鑒別，正品鹿茸中Na 元素含有量應(yīng)1 000 ≤Na ≤1 500 mg/kg、K 元素含有量也應(yīng)大于等于500 mg/kg［23］。
因此，表面增強(qiáng)拉曼光譜法聯(lián)合應(yīng)用Fisher 識(shí)別函數(shù)以及微量元素檢測(cè)法更適用于對(duì)鹿茸樣品的鑒別，該方法準(zhǔn)確、有效。根據(jù)研究結(jié)果建立鹿茸真?zhèn)蔚蔫b別方法，利用鹿茸對(duì)照品建立其表面增強(qiáng)拉曼光譜庫(kù)，以期為鹿茸的研究提供依據(jù)。
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