一測多評法同時測定艾納香油中5 種成分

秦晉穎，謝曉林，趙 元，張新鳳，吳 倩，王昌勝，劉志剛?

（1.貴陽學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，貴州 貴陽 550005；2.貴州黃果樹立爽藥業(yè)有限公司，貴州 貴陽 550004）

艾納香油為菊科植物艾納香Blumea balsamifera（L.）DC.葉中分離而得的油，是我國西南少數(shù)民族習(xí)用藥物［1］。L-龍腦為艾納香油中主要活性成分，此外還含有β-石竹烯、樟腦、β-蒎烯和芳樟醇等成分［2-3］，具有鎮(zhèn)痛、抗菌和消炎的藥理活性，是多種貴州民族藥成方制劑的組方藥物［4-10］。艾納香藥材來源較復(fù)雜，偽品較多，目前艾納香油的壓榨工藝并不統(tǒng)一，現(xiàn)有地方標(biāo)準(zhǔn)采用恒溫GC外標(biāo)法對龍腦含有量進(jìn)行定量測定，色譜分離效果差，且樟腦和β-蒎烯等有效成分的含有量沒有得到控制，單一成分含有量測定已難以全面反映艾納香油的質(zhì)量，多指標(biāo)定量測定已成為中藥質(zhì)量控制的發(fā)展趨勢［11］。傳統(tǒng)的多指標(biāo)定量測定存在著對照品消耗量大、操作復(fù)雜和容易導(dǎo)致誤差等缺陷，一測多評法已被用于中藥化學(xué)成分的含有量測定［12-18］，2015 年版《中國藥典》 一部收載黃連藥材中巴馬汀、小檗堿、表小檗堿和黃連堿4 種主要成分的含有量采用一測多評法測定。本研究建立一測多評法測定艾納香油中的5 種成分含有量，并與傳統(tǒng)內(nèi)標(biāo)法測定結(jié)果比較，以期為全面提升艾納香油的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)，并為相關(guān)制劑的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

島津GC-2014 型氣相色譜儀（配Aoc-20i+s 自動進(jìn)樣器）、LAB Solution 色譜工作站（日本島津公司）；KQ5200DB 型數(shù)控超聲波清洗器（江蘇昆山市超聲儀器有限公司）；FA124 型電子分析天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）。

β-蒎烯（批號111827-201508）、樟腦（批號110747-201609）、龍腦（批號110881-201311）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院，純度均大于98.0%；β-石竹烯（批號181020）和α-石竹烯（批號180926）對照品購自北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司，純度均大于96.0%。高純氮?dú)?、氫氣和干燥空氣體積分?jǐn)?shù)均為99.999%（貴州特建氣體有限公司）；其他試劑均為分析純。

實(shí)驗(yàn)用8 批艾納香藥材于2017 年10 月采自貴州省羅甸縣，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院周漢華教授鑒定為菊科植物艾納香Blumea balsamifera（L.）DC.的葉，其粗升華物經(jīng)過壓榨分離而得到艾納香油樣品。

2 方法與結(jié)果

2.1 一測多評法建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱采用PEG-20 M 交聯(lián)毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm，1.0 μm）；載氣采用氮?dú)?；分流進(jìn)樣模式；分流比10∶1；程序升溫（起始溫度70 ℃，維持2 min，以5 ℃/min 速率升溫至150 ℃，維持2 min）；進(jìn)樣口溫度240 ℃；采用FID 檢測器，溫度240 ℃；進(jìn)樣量1.0 μL。色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.1.2 對照品貯備液制備 分別取β-蒎烯、β-石竹烯、樟腦、α-石竹烯和龍腦對照品適量，精密稱定，用乙酸乙酯溶解，制成每1 mL 分別含上述5種成分0.372、0.556、1.62、0.912、4.10 mg 對照品貯備液。

2.1.3 內(nèi)標(biāo)溶液制備 取適量水楊酸甲酯，精密稱定，置于100 mL 量瓶中，加乙酸乙酯稀釋至刻度，配成質(zhì)量濃度為15.0 mg/mL 的內(nèi)標(biāo)溶液，用0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.1.4 混合對照品溶液制備 精密量取β-蒎烯、β-石竹烯、樟腦、α-石竹烯和龍腦對照品貯備液各2.0 mL 至10 mL 量瓶中，加乙酸乙酯配制成質(zhì)量濃度分別為β-蒎 烯0.074 4 mg/mL、β-石竹烯0.111 mg/mL、樟腦 0.324 mg/mL、α-石竹烯0.182 mg/mL 和龍腦0.820 mg/mL 的混合對照品溶液，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.1.5 供試品溶液制備 取艾納香油樣品約0.2 g，精密稱定，置于100 mL 量瓶中，精密加入前述內(nèi)標(biāo)液1.0 mL，加乙酸乙酯定容至刻線，搖勻，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.1.6 線性關(guān)系考察 精密量取“2.1.4”項(xiàng)下混合對照品溶液0.2、1.0、2.0、5.0、8.0 mL 分別置于10 mL 量瓶中，加入內(nèi)標(biāo)溶液1.0 mL，加乙酸乙酯稀釋至刻度，組成系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液。分別精密吸取各混合對照品溶液1.0 μL，在“2.1.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣。以對照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），對照品與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，表明β-蒎烯、β-石竹烯、樟腦、α-石竹烯和龍腦在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.1.7 相對校正因子測定 精密吸取上述不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液1.0 μL，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，記錄不同質(zhì)量濃度對照品與內(nèi)標(biāo)物峰面積，以龍腦為內(nèi)參物，計(jì)算β-蒎烯、β-石竹烯、樟腦、α-石竹烯的相對較正因子，測得β-蒎烯、β-石竹烯、樟腦、α-石竹烯的相對較正因子分別為0.513、0.592、0.401、0.639，RSD 分別為1.1%、1.5%、0.9%、1.6%。

2.1.8 精密度試驗(yàn) 取“2.1.4”項(xiàng)下混合對照品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算各化合物峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值的RSD 值，測得β-蒎烯、β-石竹烯、樟腦、α-石竹烯和龍腦峰面積比值的RSD 分別為0.8%、0.9%、0.2%、0.7%、0.2%，表明該方法精密度良好。

2.1.9 重復(fù)性試驗(yàn) 分別稱取同一批艾納香油樣品6 份（1 號樣品），精密稱定，按“2.1.5”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測定峰面積，測得β-蒎烯、β-石竹烯、樟腦、α-石竹烯和龍腦的含有量分別為13.1、16.6、71.5、26.9、232 mg/g，RSD 分別為1.3%、1.6%、0.9%、1.7%和1.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.10 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取1 號艾納香油樣品，按“2.1.5”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下，分別于室溫放置的0、2、4、8、12 h 進(jìn)樣，測定峰面積，并與內(nèi)標(biāo)物的峰面積作比較，測得β-蒎烯、β-石竹烯、樟腦、α-石竹烯和龍腦峰面積比值的RSD 分別為1.4%、1.1%、0.7%，1.3%、0.8%，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.11 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取各成分含有量已知的艾納香油樣品6 份（1 號樣品），每份樣品分別精密加入4.0 mL 混合對照品溶液（β-蒎烯、β-石竹烯、樟腦、α-石竹烯和龍腦質(zhì)量濃度分別為0.344、0.429、1.83、0.695、5.27 mg/mL），按“2.1.5”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

2.2 一測多評法的耐用性

2.2.1 重復(fù)性考察 精密吸取上述5 種成分混合對照品系列對照品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，記錄各對照品與內(nèi)參物峰面積，計(jì)算各成分的相對較正因子，測得β-蒎烯、β-石竹烯、樟腦、α-石竹烯 的相對較正因子分別為0.519、0.586、0.409、0.627，RSD 分別為2.6%、3.1%、2.9%、4.1%，表明相對校正因子的重復(fù)性良好。

2.2.2 不同儀器對相對校正因子的影響 采用PEG-20M（30 m×0.32 mm，1.0 μm）石英毛細(xì)管柱，分別考察了島津GC-2014C 氣相色譜議和Agilent 6890 N 氣相色譜系統(tǒng)對艾納香油中幾種成分相對校正因子的影響。測得β-蒎烯、β-石竹烯、樟腦和α-石竹烯相對較正因子RSD 分別為3.3%、3.8%、4.7%、3.8%，表明不同氣相色譜系統(tǒng)對各成分相對校正因子無顯著影響。

表2 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

2.2.3 不同色譜柱對相對校正因子的影響 采用島津GC-2014C 氣相色譜系統(tǒng)，分別考察了KBWax氣相色譜毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm，1.0 μm）、中科院蘭州物化所PEG-20 M（30 m×0.32 mm，1.0 μm）、大連中匯達(dá)PEG-20M（30 m×0.32 mm，1.0 μm）3 種不同色譜柱對相對校正因子的影響，測得β-蒎烯、β-石竹烯、樟腦和α-石竹烯相對較正因子的RSD 分別為3.1%、2.6%、3.3%、2.9%，表明色譜柱對各成分相對校正因子無顯著影響。

2.2.4 色譜峰定位 為了能夠確認(rèn)β-蒎烯、β-石竹烯、樟腦和α-石竹烯色譜峰的位置，通過相對校正因子計(jì)算含有量，從而達(dá)到一測多評的目的。本實(shí)驗(yàn)分別考察了采用不同儀器和色譜柱時，4 種成分相對于內(nèi)參物龍腦色譜峰的相對保留時間。結(jié)果表明，各成分相對保留時間在不同儀器和色譜柱條件下變化較小，結(jié)果見表3。

2.3 一測多評法與內(nèi)標(biāo)法結(jié)果比較 采用一測多評法對6 批艾納香油中β-蒎烯、β-石竹烯、樟腦和α-石竹烯4 種成分進(jìn)行含有量測定，結(jié)果見表4，采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件對內(nèi)標(biāo)法與一測多評法的2 組檢測結(jié)果進(jìn)行成組t檢驗(yàn)，結(jié)果2 種方法測定結(jié)果無顯著性差異，表明一測多評法可用于艾納香油中5 種成分的含有量測定。

3 討論

一測多評法是在多指標(biāo)質(zhì)量評價時，選擇藥材中某一廉價、易得和有效組分為內(nèi)標(biāo)，建立該組分與其他組分之間的相對校正因子，以計(jì)算其他組分含有量。艾納香油中龍腦含有量最高，可獲得性較好，價格適中，且穩(wěn)定性較好，故選擇龍腦作為內(nèi)參照物，建立其與β-蒎烯、β-石竹烯、樟腦和α-石竹烯的相對校正因子，采用一測多評法同時檢測艾納香油中5 種活性成分含有量，實(shí)現(xiàn)了低成本對多種成分的同步測定。方法學(xué)考察結(jié)果表明，方法的重復(fù)性和準(zhǔn)確度良好，在對照品缺乏的前提下，一測多評法可以作為一種快捷、準(zhǔn)確的方法應(yīng)用于艾納香油的質(zhì)量控制。

表3 不同儀器和色譜柱上保留時間Tab.3 Retention time on different instruments and columns

表4 各成分含有量測定結(jié)果（mg/g）Tab.4 Results of content determination of various constituents（mg/g）

在一測多評法建立的過程中，有多種因素會影響相對校正因子，本研究中考察了不同型號氣相色譜儀及不同色譜柱對相對校正因子的影響，測得β-蒎烯、β-石竹烯、樟腦和α-石竹烯在各色譜條件下相對校正因子的RSD 均小于5%，并且5 種成分出峰順序均不受色譜系統(tǒng)的影響，符合一測多評法建立的技術(shù)指南中的要求［10］，不同色譜儀及色譜柱對相對校正因子無顯著影響。在色譜峰定位時，采用相對保留時間作為色譜峰定位參數(shù)。在不同色譜條件下，相對保留時間的重現(xiàn)性良好，其RSD 均小于5%，從而驗(yàn)證了一測多評法在艾納香油質(zhì)量控制中的可行性與技術(shù)適應(yīng)性。