寡糖與非特異性免疫

周麗媛 姚幫海

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，長沙；2.四川檀蓉動物營養(yǎng)食品有限公司）

抗生素可提高動物飼料轉化率從而促進生長發(fā)育， 但長期大量使用抗生素類添加劑可導致細菌產(chǎn)生嚴重的耐藥性和抗藥性， 其產(chǎn)品中的藥物殘留問題也引起了消費者的廣泛關注。 歐盟于2006 年提出對抗生素生長促進劑 （antibiotic growth promoters， AGP） 使用的禁令， 現(xiàn)國內(nèi)外各項限制甚至禁止抗生素使用的法律法規(guī)已陸續(xù)開始實施， 新型安全、 無毒、 無副作用的抗生素替代品成為研究熱點。

通過對潛在的諸多可替代AGP 的物質的研究發(fā)現(xiàn)， 寡糖廣泛存在于生命體內(nèi)， 具有重要的理化和生化特性——減少腸道病原體的附著、 增加腸道有益菌增殖和黏膜絨毛高度與隱窩深度比繼而促進對營養(yǎng)物質的消化吸收等， 除此之外，寡糖還能刺激全身和局部（腸道） 免疫， 其中包括動物機體的非特異性免疫。

1 寡糖

寡糖， 又稱低聚糖或寡聚糖， 是由2～10 個單糖單位通過糖苷鍵連接而成的具有直鏈或支鏈的低度聚合糖類的合稱。 根據(jù)寡糖的生物學功能可將其分為功能性寡糖和普通寡糖兩大類， 其中， 普通寡糖的糖苷鍵主要為α-1，4 糖苷鍵， 能被機體直接消化吸收用于供能， 如蔗糖、 乳糖等； 功能性寡糖又被稱為非消化性寡糖（non-digestible oligosaccharide， NDO）， 其結構中由于含有α-1，6、 β-1，2 等糖苷鍵， 所以在很大程度上不能直接被利用而是進入消化道后部被微生物（主要為雙歧桿菌和乳酸菌） 發(fā)酵。 正是由于其特殊的非消化性， 功能性寡糖可以調節(jié)動物機體內(nèi)的菌群平衡， 是腸道內(nèi)益生菌的增殖因子， 在飼料工業(yè)上還被稱為化學益生素（即益生元） 和微生態(tài)促進劑。

目前用作飼料添加劑的寡糖主要有： 甘露寡糖 （mannan-oligosaccharides， MOS）、 殼 寡 糖（chitosan-oligosaccharides， COS）、 果寡糖（fructooligosaccharides， FOS） 、 寡 乳 糖 （ galacto -oligosaccharides， GAS）、 大 豆 寡 糖 （soybeen oligosaccharides， SBOS） 等， 它們結構穩(wěn)定， 儲藏加工中不易失活， 無毒、 無害、 無殘留， 被廣泛應用于疾病診斷與防治、 營養(yǎng)與保健及畜牧養(yǎng)殖等方面。 它們主要來源于真菌細胞壁（酵母菌等）、 植物（小麥、 燕麥、 大豆等）、 水果、 蔬菜、 中草藥、 藻類等。

2 非特異性免疫

在目前的畜牧業(yè)生產(chǎn)中， 提高畜禽機體的免疫功能、 降低畜禽的發(fā)病率以及減少用藥的成本， 是生產(chǎn)效率和經(jīng)濟效益提高的重要前提。 其中， 動物機體免疫包括非特異性免疫和特異性免疫。 非特異性免疫也稱天然性免疫， 當機體受到病原體入侵時， 非特異性免疫系統(tǒng)首先發(fā)揮功能。 它功能主要由巨噬細胞（Mφ）、 單核巨噬細胞、 NK 細胞、 嗜中性粒細胞和嗜酸性、 嗜堿性粒細胞以及一些天然免疫分子——補體C、 干擾素（interferon， IFN）、 天然抗體、 凝集素、 粘液素、 防御素、 溶菌酶等承擔， 構成了機體的第一道防御屏障。

血清中超氧化物歧化酶（SOD）、 過氧化氫酶（CAT）、 溶菌酶（LZM） 的活性以及丙二醛（MDA） 的含量是衡量動物（尤其是魚類） 非特異性免疫的重要指標。 SOD 是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶， 可清除體內(nèi)過高濃度的氧自由基； CAT是機體生物防御體系的關鍵酶之一， 其主要功能是清除體內(nèi)的過氧化氫， 防止機體受損傷； LZM具有抗病毒、 改善和增強巨噬細胞、 白細胞的吞噬消化功能， 可以溶解革蘭氏陽性菌細胞壁的黏多糖， 當LZM 的含量增多時， 說明吞噬細胞正處于較高的活化狀態(tài)， 抗原的遞呈作用有所增強， 進而機體的非特異性免疫功能增強； MDA是生物體內(nèi)脂質過氧化反應的氧化終產(chǎn)物， 脂質過氧化會引起細胞損傷， 因此血液中MDA 的含量可以間接地反映機體內(nèi)細胞的損傷程度。

Toll 樣受體（Toll-like receptors， TLRs） 表達于動物免疫細胞和上皮細胞， 是機體最初感知微生物存在的非特異性免疫識別的受體（細胞跨膜糖蛋白）， 是啟動哺乳動物和家禽腸道非特異性免疫應答的關鍵重要模式識別受體 （pattern recognition receptor， PRR）。 TLRs 通過識別微生物相關分子模式 （microbe-associated molecular patterns， MAMPs） 即辨別G+和G-細菌， 觸發(fā)信號轉導通路從而激活免疫系統(tǒng)， 釋放出一系列免疫效應分子， 主要包括抗菌肽 （β-防御素和cathelicidins）、 細胞因子和趨化因子等； 同時，它也是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁。其中， TLR2、 4 主要在吞噬細胞（巨噬細胞、 樹突狀細胞和中性粒細胞） 中表達。

3 寡糖調控非特異性免疫

動物免疫力的強弱在某種程度上指的就是疾病抵抗力的強弱， 它可以作為衡量某種營養(yǎng)物質對動物體免疫作用效果的綜合指標。 膳食的變化很可能會導致機體腸道免疫功能的失衡， 但一些具有特殊生理功能的物質通過在飼料中的合理應用， 例如寡糖， 就會發(fā)揮顯著的有益作用。 由于功能性寡糖主要在消化道后段被微生物發(fā)酵利用， 推動有益菌的生長， 繼而通過有益菌附殖腸黏膜形成了一道免疫屏障， 因此寡糖的非特異性免疫功能主要就是對腸道黏膜免疫功能的調節(jié)。黏膜免疫和適當?shù)挠幸婢ㄖ彩蔷S持腸道內(nèi)平衡的關鍵， 是對營養(yǎng)物質的消化吸收代謝正常進行的重要保障。 動物非特異性免疫功能的提高主要體現(xiàn)在吞噬細胞吞噬殺菌能力的增強、 抑菌類物質的產(chǎn)生以及殺菌相關酶類活性的提高等方面。

MOS 廣泛存在于魔芋、 豆膠和多種微生物細胞壁內(nèi)， 目前飼料所用的MOS 主要是從酵母細胞壁中通過酶解法提取出來的磷酸化的葡甘露寡聚糖蛋白復合體， 其成分主要為二糖、 三糖和四糖等結構的混合物， 被廣泛應用到飼料行業(yè)， 可以在一定程度上替代抗生素。

MOS 是目前豬營養(yǎng)飼料添加劑的主要來源。MOS 通過促進對細菌抗原的呈遞， 從而對豬的免疫反應起著間接或直接調節(jié)作用， 這可能與位于腸上皮細胞頂端的甘露糖受體激活了局部的免疫防御機制有關。 Che 等試驗結果表明， 通過在仔豬日糧中添加MOS， 大大提高感染了豬繁殖和呼吸綜合征 （porcine reproductive and respiratory syndrome， PRRS） 病毒7 天后仔豬的白細胞、 淋巴細胞和中性粒細胞數(shù)量及生長速度， 改善了機體非特異性免疫反應； 飼糧中添加2g/kg 的MOS可下調豬白細胞中免疫基因的表達， 對感染PRRS 后的過敏反應起到緩解作用。 因此， MOS不僅能增強豬對感染的抵抗力， 同時還可防止免疫系統(tǒng)的過度刺激， 從而使動物更加有效地利用營養(yǎng)進行生長， 更好地發(fā)揮生產(chǎn)潛力。

MOS 的非特異性免疫作用除了對豬健康生產(chǎn)意義重大， 在其他動物中均有廣泛的應用。 在雞方面， 諸多試驗結果顯示通過在肉雞飼糧中添加MOS 可提高肉雞腸道免疫和系統(tǒng)免疫功能， 閻桂玲等試驗結果表明， 日糧添加1.0g/kg 的MOS 可顯著提高AA 肉仔雞公雛淋巴細胞對刀豆蛋白A（Concanavalin A， ConA） 的反應， 添加0.5g/kg和1.0g/kg 的MOS 可顯著提高巨噬細胞的吞噬能力。 邵良平等研究報道， 在海蘭褐殼蛋雛雞的基礎日糧中添加不同水平的MOS， 其中4.0g/kg 的MOS 能極顯著提高其PHA 淋巴細胞轉化率和白細胞吞噬率（P＜0.01）。 在反芻動物方面， 謝明欣等在蒙古綿羊日糧中添加MOS， 可以提高綿羊血清中脂多糖結合蛋白的濃度和超氧化物歧化酶活性， 改善綿羊的血清免疫功能和抗氧化能力。在水生動物方面， 由于魚類屬于低等脊椎動物，特異性免疫機制尚不完善， 再加上引起魚病的因素多為條件性致病菌而非特異性致病菌， 因此，非特異性免疫對于水生動物來說至關重要； S.Torrecillas 等報道了在Dicentrarchus labrax 飼糧中添加0.4%的MOS， 白細胞吞噬率比對照組提高了5.6%； Andrews 等試驗結果表明， 在Labeo rohita 幼魚飼料中添加1%的MOS 后其血液紅細胞數(shù)量比對照組提高了5.30%； 李云蘭的研究結果顯示， 隨著MOS 添加量的增加幼建鯉血液紅細胞數(shù)量和血清溶菌酶活力也呈遞增趨勢； Genc等和Piaget 等分別在Hybrid tilapia 基礎日糧和Paralichthys adspersus 幼魚養(yǎng)殖水體中添加3g/kg和5mg/L 的MOS， 均顯著提高了魚體血清溶菌酶活性。

動物非特異性免疫應答識別受體TLR2 可識別酵母細胞壁MOS， 介導宿主相關免疫效應分子的分泌和天然免疫應答的產(chǎn)生。 熊阿玲通過試驗發(fā)現(xiàn)， MOS 能不同程度地上調肉雞組織非特異性免疫相關基因AvBD9、 TLR2、 TLR4 和Cath-B1的表達， 所以MOS 的作用機制是通過提高肉雞組織TLRs 表達并由TLRs 介導上調β-防御素和cathelicidins 等抗菌肽的表達， 從而提高肉雞非特異性免疫防御功能； 最新研究表明， 飼糧添加0.3～0.9g/kg 的MOS 可不同程度地提高肉雞回腸、盲腸、 肝臟和脾臟中TLR2 和TLR4 mRNA 的表達。 因此， MOS 除了能夠直接在腸道發(fā)揮免疫調節(jié)作用外， 部分MOS 還可調節(jié)機體其他器官尤其是免疫器官細胞中的TLRs 表達， 并由此調節(jié)機體局部和系統(tǒng)免疫功能。

殼聚糖(chitosan， CTS) 是幾丁質（即甲殼素） 在堿性條件或酶的作用下部分脫乙酰后的產(chǎn)物， COS 是CTS 經(jīng)酸解法、 酶解法、 氧化法和物理法所得的低聚物， 其中酶解法具有條件溫和、節(jié)能高效無污染、 降解過程容易控制等優(yōu)點， 被廣泛使用， 它聚合度為2～20， 是目前自然界唯一帶正電荷的堿性氨基寡糖。 COS 無毒、 相對分子質量低、 水溶性較好、 生物活性高、 易被動物吸收利用， 具有調節(jié)免疫、 抗炎、 降血脂和抗腫瘤等多種生物活性。

殼寡糖不僅能夠通過清除羥自由基(·OH)從而提升機體的抗氧化能力， 保護免疫器官、 增強免疫功能； 還可以促進有益菌如雙歧桿菌等的大量增殖， 進而提高機體的抗體水平， 激活巨噬細胞的吞噬活性， 增強機體的非特異性免疫功能。 COS 在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面應用廣泛， 并取得了顯著成果。 劉含亮等、 Lin 等對虹鱒和錦鯉的研究顯示， 當在它們的飼料中分別添加0.2g/kg、 0.4g/kg 和2g/kg COS 時可顯著或極顯著提高血清中的總白細胞數(shù)量、 白細胞吞噬指數(shù)和LZM 活性，并且劉含亮等建議COS 添加量為0.2g/kg； Lin 等最新研究發(fā)現(xiàn)， 連續(xù)喂食8 周含0.2% COS 的混合飼料后， Micropterus salmoides 幼魚體內(nèi)LZM和SOD 活性增強， 白細胞總數(shù)和NO 含量也有所上升， 并且當用嗜水氣單胞菌攻擊Micropterus salmoides 時， COS 喂養(yǎng)組的死亡率顯著低于對照組， 說明COS 增強了Micropterus salmoides 的非特異性免疫應答和抗病性。 在COS 可提高機體抗病力方面， 孫立威等也做了類似的研究， 他們通過添加不同濃度的COS 飼料飼喂吉富羅非魚幼魚10 周， 發(fā)現(xiàn)其中質量分數(shù)為0.30%～0.50%的COS 均能明顯提高幼魚血清中LZM 和SOD 活性以及抗嗜水氣單胞菌感染的能力（P＜0.05）。孫飛等的試驗結果表明， 在異育銀鯽的常規(guī)飼料中添加0.02% COS 后， 血清SOD 活性相比于對照組上升了6.59%， MDA 含量下降了16.94%，大大提高了異育銀鯽的非特異性免疫能力。

通過注射、 灌胃方式——不同于傳統(tǒng)飼喂方式給動物補充COS， 同樣可以顯著提高機體非特異性免疫應答。 張南南等發(fā)現(xiàn)， 小鼠經(jīng)0.8g/kg COS 灌胃6 周后， 其血清中過氧化物酶活性提高了45.08%； 官杰等對S180 荷瘤鼠腹腔注射10天0.3g/kg COS 后， 其肉瘤質量減少了42.03%，顯著增強了NK 細胞活性， 由此可見， COS 具有調節(jié)血清免疫和抗病力的功能。 同樣的， Qian 等[44] 通過試驗發(fā)現(xiàn)， 沙眼衣原體感染生殖道的小鼠經(jīng)連續(xù)皮下注射1 周0.3g/kg COS 后， 其血清白細胞介素水平有所升高， 提示COS 具有增強抗原呈遞細胞（Antigen-presenting cells， APC）的抗原遞呈能力、 NK 細胞活性和吸引中性粒細胞從而引起炎癥介質釋放等功能； 另外， 其脾臟免疫水平和胸腺指數(shù)也均有所提高， 說明COS對小鼠的特異性和非特異性免疫應答均起了積極作用。

果寡糖是一類由蔗糖分子通過β-1， 2 糖苷鍵結合多個D-果糖（n＜8） 而形成的小分子糖的總稱， 其廣泛存在于大麥、 大蒜、 洋蔥、 黑麥等植物中， 尤其以菊芋塊莖中含量最豐富。 研究表明， 果寡糖吸濕性低、 防霉性能好， 還能減少飼料發(fā)霉、 變質， 延長飼料貯存期； 果寡糖還具有改善腸道微生態(tài)環(huán)境、 降低血脂、 抗氧化以及增強動物免疫機能的作用， 其中， 在非特異性免疫功能上， 其能顯著提高白細胞吞噬活性、 血清LZM 活力、 血清SOD 活力和補體含量。 果寡糖作為益生元類飼料添加劑， 被廣泛應用于奶牛、羊、 豬、 雞、 鵪鶉和兔等動物生產(chǎn)上。

球蛋白（GLB） 是機體內(nèi)參與免疫反應的蛋白質， 反應機體免疫水平。 周建民等通過在產(chǎn)蛋后期蛋雞飼糧中添加不同水平的FOS， 發(fā)現(xiàn)血清GLB 含量明顯提高， 這可能是由于果寡糖具有一定的免疫原性， 能增加巨噬細胞活性， 增強機體非特異性免疫。 劉靜波等給每頭斷奶仔豬每天飼喂兩次0.6g 短鏈果寡糖（scFOS）， 試驗結果顯示， 對照組仔豬斷奶2 周后空腸MDA 含量顯著高于scFOS 組， 因此， scFOS 的攝入可提高仔豬在斷奶后2 周的抗氧化能力和非特異性免疫應答， 緩解斷奶仔豬的氧化應激。

研究發(fā)現(xiàn)， LSZ 和堿性磷酸酶（AKP） 的活性與動物機體的免疫機能密不可分， 其活性水平可作為免疫刺激劑影響機體非特異性免疫功能強弱的指標。 LSZ 存在于許多水生動物的體表黏液、 腸道黏液、 血清和巨噬細胞中， 是水生動物非特異性體液免疫因子的重要組成部分； AKP 是一種非特異性磷酸單酯酶， 可改變細菌的表面結構， 增強機體排除異己能力。 研究發(fā)現(xiàn)， 通過在山羊日糧中添加1% FOS 和固始雞飼料中添加7mg/kg FOS 可分別顯著提高動物血清AKP 和LSZ 活性； 宋宏立等試驗結果顯示， 當FOS 的添加量為1.2%時可顯著提高山羊14d 及28d 血清中AKP 含量； AI 等在基礎飼料中添加0.2%和0.4%果寡糖飼喂大黃魚10 周， 試驗組LSZ 活性均顯著高于對照組且溶菌酶在試驗組間均無顯著差異， 這與胡凌豪等試驗結果高度一致。 但是，Guerreiro 等和李富東等在低溫條件下（15～20℃）對大菱鲆和褐牙鲆飼喂一定量的FOS， 試驗組血清LSZ 活性與對照組相比差異均不顯著。 果寡糖對機體非特異性免疫的增強作用可能主要通過促進腸道乳酸菌等有益菌的增殖來實現(xiàn)， 由于低溫條件限制了有益菌的增殖， 從而使FOS 對機體非特異性免疫功能的促進作用不明顯。

牛蒡低聚果糖 （burdock fructooligosaccharide， BFO） 與果寡糖和菊糖具有相似的結構，經(jīng)體內(nèi)試驗（灌胃給藥） 證明250～1000mg/kg/day 的BFO 可以顯著提高小鼠巨噬細胞NO 的產(chǎn)生量及酸性磷酸酶活性， 其中， NO 是一種具有多種生理功能的信息分子及效應分子， 巨噬細胞經(jīng)內(nèi)毒素、 細胞因子或其底物L-精氨酸等激活后可產(chǎn)生大量NO； 而酸性磷酸酶是活化的巨噬細胞產(chǎn)生的一種溶酶體酶， 其活性的提高說明了巨噬細胞吞噬和清除異物顆粒能力的增強； 經(jīng)體外試驗證明100μg/ml 的BFO 能夠極顯著促進雙歧桿菌的生長及小鼠脾細胞的增殖， 提示BFO具有益生素特征， 可作為免疫刺激劑。 BFO 通過增強巨噬細胞活性從而產(chǎn)生顯著的非特異性免疫調節(jié)作用， 在提高機體抗病力和應對免疫缺陷性疾病方面意義重大。

4 小結

功能性寡糖的非消化性使其進入消化道后段被微生物發(fā)酵利用， 可促進益生菌的生長進而調節(jié)腸道菌群平衡， 除此之外， 還對動物機體的非特異性免疫應答起著重要積極作用， 在提高動物免疫力和抗病力方面意義重大。 近幾年， 動物營養(yǎng)學家對寡糖研究逐步深入， 使其作為功能性添加劑和抗生素替代品在各種動物飼養(yǎng)方面作用效果顯著、 應用廣泛。 但是， 動物在不同生長階段、 不同病理狀況下對其的需要量和它的制作工藝、 添加方法等都需要進一步確定和探究。

參考文獻（略）