景虎通脈方對急性腦缺血大鼠模型的腦保護作用研究

劉曉敏　解歡瓊　陶相宜　袁滔　蘇玉杰

摘要：目的?探討景虎通脈方對急性腦缺血的治療作用及機制。方法?健康成年雄性Wistar大鼠80只，隨機分為假手術(shù)對照組、模型對照組、尼莫地平組、景虎通脈方高劑量組、景虎通脈方中劑量組、景虎通脈方低劑量組。每組10只。除去假手術(shù)對照組，余各組大鼠采用線栓法制作急性腦缺血動物模型。造模前預(yù)防給藥7次，造模后給藥3次，每天1次。檢測大鼠腦組織勻漿中MDA、NOS的含量及SOD的活力。結(jié)果?與模型組相比，景虎通脈方高、中、低劑量組腦組織勻漿中SOD水平分別為（544.76±40.19）U·mL-1、（537.76±38.80）U·mL-1、（524.43±61.18）U·mL-1，景虎通脈方高、中劑量組腦組織勻漿中NOS水平為（37.83±4.36）U·mL-1、（36.94±2.18）U·mL-1，景虎通脈方中劑量組腦組織勻漿中MDA水平為（3.36±1.55）U·mL-1，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論?景虎通脈方對大鼠急性腦缺血有一定的治療作用，其機制可能與抗氧自由基及抗氧化途徑有關(guān)。

關(guān)鍵詞：景虎通脈方;急性腦缺血;?MDA;?NOS;?SOD

中圖分類號：R285.5?文獻標(biāo)志碼：A?文章編號：1007-2349（2020）03-0065-04

Study?on?the?Protective?Effect?of?Jinghu?Tongmai?Recipeon?Acute?Cerebral?Ischemia?Rat?Model

LIU?Xiao-min1，?XIE?Huan-qiong1，?TAO?Xiang-yi1，?YUAN?Tao2，?SU?Yu-jie2

（1.?Yunnan?Provincial?Hospital?of?Traditional?Chinese?Medicine，?Kunming?650021，?China;2.?Yunnan?University?of?Traditional?Chinese?Medicine?and?Materia?Medica，?Kunming?650500，?China）

【Abstract】Objective：?To?explore?the?therapeutic?effect?and?mechanism?of?Jinghu?Tongmai?Recipe?on?acute?cerebral?ischemia.?Methods：?80?healthy?adult?male?Wistar?rats?were?randomly?divided?into?a?sham?operation?control?group，?a?model?control?group，?a?nimodipine?group，?and?Jinghu?Tongmai?Recipe?groups?with?high，?medium?and?low?dose，?10?rats?per?group.?Except?the?rats?in?the?sham?operation?control?group，?the?rats?in?the?other?groups?were?made?into?animal?models?of?acute?cerebral?ischemia?by?suture?method.?Preventive?administration?was?given?7?times?before?modeling?and?3?times?after?modeling，?once?a?day.?The?contents?of?MDA?and?NOS?and?the?activity?of?SOD?in?rat?brain?tissue?homogenate?were?detected.?Results：?Compared?with?that?of?the?model?group，?the?levels?of?SOD?in?brain?tissue?homogenates?of?Jinghu?Tongmai?Recipe?groups?with?high，?medium?and?low?dose?were?（544.76±40.19）U·mL-1，?（537.76±38.80）U·mL-1?and?（524.43±61.18）U·mL-1，?respectively.?The?NOS?levels?in?brain?tissue?homogenates?of?the?high?and?medium?dose?groups?were?（37.83±4.36）U·mL-1and?（36.94±2.18）U·mL-1，?The?MDA?level?in?the?brain?tissue?homogenate?of?the?medium?dose?group?was?（3.36±1.55）U·mL-1.?The?results?were?statistically?significant.?Conclusion：?Jinghu?Tongmai?Recipe?has?a?certain?therapeutic?effect?on?acute?cerebral?ischemia?in?rats，?and?its?mechanism?may?be?related?to?antioxidant?free?radicals?and?antioxidant?pathways.

【Key?words】Jinghu?Tongmai?Recipe，?acute?cerebral?ischemia，?MDA，?NOS，?SOD

急性腦缺血病屬中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”的范疇，具有高致病率、高致殘率、高致死率的特點[1]，景虎通脈方是第3～5批全國老中醫(yī)藥專家學(xué)術(shù)經(jīng)驗繼承工作指導(dǎo)老師趙淳教授用于治療急性缺血性腦血管疾病的經(jīng)驗方，在臨床上運用多年，取得了良好的療效。本研究在成功復(fù)制急性腦缺血大鼠模型基礎(chǔ)上，觀察景虎通脈方對大鼠腦組織總超氧化物岐化酶（SOD）、一氧化氮合成酶（NOS）、丙二醛（MDA）的影響，以期探討其作用機制?，F(xiàn)報道如下。

1?材料與方法

1.1?實驗藥物及分組?Wistar大鼠80只，雄性，體質(zhì)量200～220?g，購自成都達碩實驗動物有限公司。動物生產(chǎn)許可證號：SYXK（滇）K2013-007。大鼠飼養(yǎng)于SPF級動物實驗室，溫度20～25℃（日溫差≤3℃）;濕度40%～70%;照明12?h：12?h明暗交替，照度150～300?lx;噪音≤60?dB。隨機分為六組：假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組、景虎通脈方高劑量組（以下稱高劑量組）、景虎通脈方中劑量組（以下稱中劑量組）、景虎通脈方低劑量組（以下稱低劑量組）。

1.2?藥物與制備方法?景虎通脈方：紅景天10?g（購自云南福林堂藥業(yè)有限公司），虎杖15?g，三七15?g，茯苓15?g，白首烏15?g（購自云南省中醫(yī)醫(yī)院中藥房）。菲牛蛭凍干粉0.6?g（云南海瑞迪生物公司，批號C05-14111101，溫水兌入）制備方法：經(jīng)水煎，制備流浸膏，按大鼠給藥劑量10?mg/kg算，稱取浸膏4.68?g，充分研磨后配置10?mL設(shè)置為中劑量，高劑量為此劑量的2倍，低劑量為此劑量的1/2。尼莫地平片[國藥準字H14022821]，每片20?mg，由亞寶藥業(yè)集團股份有限公司生產(chǎn)，批號1705546。用時將藥片碾碎加入蒸餾水制成?20%混懸液，即?100?mL蒸餾水中加入1片尼莫地平片。

1.3?試劑與儀器?總超氧化物岐化酶（SOD）測定試劑盒（批號A001-1），一氧化氮合成酶（NOS）（A014-2），丙二醛（MDA）測試盒（A003-1）、NOS檢測試劑盒，均由南京建成生物工程研究所提供。RF-5000型熒光分光光度計（日本島津）提供，恒溫水浴箱型號DK-S24?上海森信提供?臺式離心機?型號H1750R由湘儀公司提供。

1.4?實驗方法

1.4.1?急性腦缺血動物模型制備?按文獻方法造大鼠大腦中動脈缺血模型[2]用大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉（35mg/100?g體重），仰臥于手術(shù)臺上，沿頸正中切開，分離右側(cè)頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA、，頸內(nèi)動脈（ICA）、沿ICA向下分離翼顎動脈，在ECA遠心端、近心端分別穿線，遠心端系緊，近心端打一松結(jié)（備線），用微血管夾暫時夾閉CCA、ICA和翼顎動脈。在ECA的兩線間剪一小口，將制備好的一端加熱成球型的1.5號尼龍栓線（直徑0.20?mm）經(jīng)小口插入ECA，將ECA近心端的備線系緊，移去ICA處的血管夾，栓線經(jīng)CCA分叉進入ICA并繼續(xù)入顱至大腦前動脈ACA近端，此時可感覺到輕微阻力，根據(jù)大鼠體重，尼龍線插入深度為1.9～2.3?cm移去，CCA翼顎動脈處血管夾，皮膚縫合，即制成右側(cè)大腦中動脈局灶性腦缺血（MCAO）模型假手術(shù)組同樣進行麻醉，皮膚切開，血管分離后，不夾閉血管及插入栓線直接縫合皮膚。

1.4.2?大鼠MCAO模型鑒定及?動物清醒后按照?Longa的?5分法評分。0分：無神經(jīng)缺損癥狀。1分：左前肢不能完全伸直。2分：向左旋轉(zhuǎn)。3分：向左側(cè)傾倒。4分：不能自己行走或昏迷。1～4分為有效模型。

1.5?檢測指標(biāo)?檢測方法：造模給藥完成后，處死大鼠，取大腦組織，采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活力，稱取適量組織，加入9倍預(yù)冷PBS（磷酸緩沖液），超聲破碎儀冰浴處理組織后，5000?rpm/min，離心20?min，取上清待測;按照南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的檢測試劑盒說明書方法檢測，預(yù)實驗摸索合適取樣量及合適濃度勻漿樣本檢測;根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果選取0.25%濃度5ul樣本檢測;按公式計算總SOD活力=（對照孔OD值-測定孔OD值）/對照孔OD值/50%*166（根據(jù)本實驗確定并計算出）/待測樣本蛋白濃度，相同步驟用比色法根據(jù)吸光度的大小可計算出NOS活力，采用TBA法測定MDA活性。

1.6?統(tǒng)計方法?應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（x±s）表示，對計量資料進行t檢驗和方差分析，計數(shù)資料進行χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2?結(jié)果

2.1?景虎通脈方對急性腦缺血模型大鼠腦組織勻漿SOD水平的影響?模型組大鼠腦組織勻漿SOD水平較正常對照組降低，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與模型組對比，尼莫地平組及景虎通脈方高、中、低劑量組腦組織勻漿SOD水平升高，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與尼莫地平組對比，景虎通脈方中劑量組SOD水平較尼莫地平組升高，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見表1。

2.2?景虎通脈方對急性腦缺血模型大鼠腦組織勻漿NOS水平的影響?模型組大鼠腦組織勻漿中NOS含量低于假手術(shù)組，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），與模型組對比，尼莫地平組、景虎通脈方高、中劑量大鼠組腦組織勻漿NOS活性均高于于模型組，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表2。

2.3?景虎通脈方對急性腦缺血模型大鼠腦組織勻漿MDA水平的影響?與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織勻漿MDA顯著增高（P<0.01），與模型對照組對比，景虎通脈方中劑量組大鼠組腦組織勻漿MDA含量低于模型組，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）

3?討論

趙淳教授認為，急性缺血性腦血管病屬于中醫(yī)“中風(fēng)病”范疇，本病多由過食肥甘、脾虛失運，水谷精微不歸正化，生成脂濁痰濕。水谷精微由清化濁，變生痰濁，留滯血脈之中，凝聚成塊[3]，如《醫(yī)學(xué)正傳》云：“津液稠黏，為痰為飲，積久滲入脈中，血為之濁。”痰借血體，血借痰凝，痰瘀互結(jié)，凝于血脈，日久膠結(jié)不解，如《血證論》中云：“血積既久，亦能化為痰水?！弊罱K成瘀，閉阻腦絡(luò)，“毒邪”內(nèi)生而發(fā)病。本病病機為血瘀腦絡(luò)、升降逆亂、腑氣不通，治療應(yīng)通腑泄?jié)?，使絡(luò)通瘀化、調(diào)暢氣機為法。

急性腦缺血疾病發(fā)病過程中，腦缺血的損傷機制較復(fù)雜。目前已知的缺血性腦損害的機制主要有鈣超載及興奮性氮基酸的神經(jīng)毒性、自由基與再灌注損傷、以及脂類介質(zhì)的毒性作用，缺血性腦水腫等方面[4]，在急性腦缺血的發(fā)展過重中，自由基與生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生過氧化脂質(zhì)與丙二醛（MDA），致使各種生物膜結(jié)構(gòu)與功能出現(xiàn)交替損傷，血管內(nèi)皮細胞損傷，血管通透性增強，致使血管源性腦水腫加重，同時腦缺血后，一氧化氮（NO）的含量明顯升高，過量產(chǎn)生的NO可以與超氧自由基作用形成過氧亞硝酸鹽或者氧化產(chǎn)生亞硝酸陰離子，它們都有細胞毒性作用，可加重缺血損傷。一氧化氮合酶（NOS）是合成一氧化氮的酶。前神經(jīng)保護機制主要包括抗氧化、調(diào)節(jié)NO合成、保護線粒體功能、抑制神經(jīng)細胞凋亡、抗炎、抑制興奮性神經(jīng)毒性、抑制鈣離子超載等方面[5]。

景虎通脈方中君藥紅景天味甘、澀，歸肺經(jīng)，功能補氣清肺，益智養(yǎng)心，收澀止血，散瘀消腫。虎杖清熱解毒、活血散瘀、祛濕瀉濁，菲牛蛭具有破血通經(jīng)，逐瘀消癥之功，《神農(nóng)本草經(jīng)》：“主逐惡血，瘀血，月閉，破血逐瘀，無子，利水道?！比呱鲋寡?，消腫定痛，《本草綱目》云：“三七止血，散血，定痛。”《玉揪藥解》云：“三七和營止血，通脈行瘀，行瘀血而斂新血?！比幑矠槌妓?。茯苓健脾利濕化痰。白首烏補肝腎，益精血，止心痛。全方共奏活血化瘀、益氣通脈、解毒豁痰之效，其通補兼施，標(biāo)本兼顧，痰、瘀、毒、虛同治。

方中紅景天其藥理成份紅景天苷，可改善急性腦梗死患者脂質(zhì)過氧化作用，促進氧化自由基分解，降低體內(nèi)炎性反應(yīng)[6]，其藥理成分黃酮類物質(zhì)[7～8]能多方面改善細胞組織與臟器的代謝和功能，通過抑制細胞內(nèi)鈣超載，減少神經(jīng)細胞的凋亡，能促進神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元方向分化，起到保護神經(jīng)細胞作用，對腦梗塞后遺癥的治療有著很大的作用。劉建明[9]研究認為紅景天苷對大鼠腦缺血/再灌注損傷具有顯著的保護作用?；⒄鹊乃幚沓煞諿10]能改善膠原酶Ⅶ誘導(dǎo)的腦出血大鼠的神經(jīng)功能缺損、減輕腦水腫，提高腦出血大鼠腦組織中超氧化物歧化酶活力、降低丙二醛水平。保護海馬區(qū)提示虎杖昔可過通鈣拈抗作用，三七主要成分為三七總皂苷，有研究[11]認為三七有效成分抑制了中性粒細胞的黏附、聚集，降低了中性粒細胞的趨化運動，減弱了中性粒細胞在缺血腦組織的浸潤和活化，減輕了腦組織的損害，在急性腦缺血過程中，可提高腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織的抗氧化活性。減輕大腦局灶性缺血性損傷的程度，可顯著抑制由缺血再灌注誘導(dǎo)的腦神經(jīng)細胞凋亡，從而起到一定程度的神經(jīng)保護作用[12～13]。菲牛蛭俗稱金邊螞蟥，其抗凝血作用、抗血栓作用優(yōu)于其他水蛭，可抑制動脈粥樣硬化斑塊形成，增加斑塊內(nèi)膠原，增加動脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性[14～15]。白首烏可通過抗氧化作用減輕腦缺血再灌注損傷，并顯著提高小鼠的耐缺氧能力。且明顯的降低腦勻漿中MDA和NO的含量，提高SOD的活性。

本研究結(jié)果顯示，景虎通脈方可調(diào)節(jié)急性腦缺血大鼠腦勻漿中MDA和NOS含量，提高急性腦缺血大鼠腦勻漿中SOD活性，可認為景虎通脈方可通過抗氧自由基及抗氧化途徑，對急性腦缺血疾病起到治療作用。中醫(yī)藥治療在治療急性腦缺血疾病治療過程中具有多成分、多靶點、多環(huán)節(jié)的特性，這一途徑可能只是景虎通脈方治療急性腦缺血作用機制的一部分，是否還存在其他的作用環(huán)節(jié)和保護機制值得進一步深入研究。

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（收稿日期：2019-10-21）