食品級(jí)高產(chǎn)亮氨酸氨肽酶重組Bacillus subtilis的構(gòu)建和發(fā)酵優(yōu)化

張大偉，劉德華，黃欽欽，田亞平

(江南大學(xué)，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫， 214122)

氨肽酶(EC 3.4.11)是一種重要的外切蛋白酶，可以高效催化蛋白質(zhì)N端的肽鍵，使N端氨基酸游離出來[1]。其中亮氨酸氨肽酶(leucine aminopeptidase)屬于氨肽酶家族中重要成員，它可以高效水解蛋白質(zhì)N端多種疏水性氨基酸例如亮氨酸、精氨酸，賴氨酸等[2]，在改善蛋白水解液風(fēng)味和提高蛋白水解度等食品加工方面有極大的應(yīng)用價(jià)值[1]。目前，來源于Pseudomonas[3],Aspergillus[4],Bacilluslicheniformis[1],Streptomyces[5],Lacticacidbacteria[6],Bacillussubtilis[7]的氨肽酶基因均有報(bào)道，其中一些氨肽酶基因已經(jīng)在E.coli[8],B.subtilis[9]和Pichiapastoris[2]中異源表達(dá)。

B.subtilis屬于一般安全(generally recognized as safe，GRAS)微生物，為非致病菌[10]。因此B.subtilis常被用作食品加工用酶的宿主菌。目前α-淀粉酶[11]、β-淀粉酶[12]、堿性木聚糖酶[13]、果膠酶[14]、氨肽酶[9]等多種食品加工用酶都已在B.subtilis中高效表達(dá)，但是所構(gòu)建的重組B.subtilis需要添加抗生素以維持質(zhì)粒穩(wěn)定性，這為B.subtilis成為食品工業(yè)宿主菌帶來了巨大阻礙。為解決這一問題，XIA等[15]將目的基因整合到基因組上，阻止目的基因丟失，但這種方法會(huì)降低目的基因的拷貝數(shù)，減少蛋白產(chǎn)量。YANG等[16]采用EndoA和EndoB的毒性蛋白和解毒蛋白的方法來增加質(zhì)粒分離穩(wěn)定性，但是構(gòu)建方法復(fù)雜并且EndoA和EndoB蛋白表達(dá)不易控制。與上述方法相比，構(gòu)建營(yíng)養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)菌株阻止質(zhì)粒丟失是一種更為有效的方法[17]。

本研究通過Cre/lox系統(tǒng)[18]敲除B.subtilis168中的dal以及遺留的博來霉系抗性基因(BleR)，LAP基因插入質(zhì)粒pMA5中，并用dal替換質(zhì)粒中的卡那霉素抗性基因(KanR)，繼而將pMA5質(zhì)粒中E.coli的Ori和氨芐霉素抗性基因(AmpR)刪除。經(jīng)過基因敲除的缺陷型菌只能在添加D-丙氨酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，而在普通培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)。質(zhì)粒中含有的dal可以和缺陷菌形成互補(bǔ)，從而產(chǎn)生篩選壓力，阻止質(zhì)粒丟失現(xiàn)象。為提高所構(gòu)建缺陷型菌株的氨肽酶發(fā)酵產(chǎn)量，在前面研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步對(duì)該菌株進(jìn)行發(fā)酵過程優(yōu)化，為工業(yè)化生產(chǎn)LAP奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

底物L(fēng)-亮氨酸-4-硝基苯胺，Alfa Aesar公司；蛋白胨、酵母粉，OXID；博來霉素，北京索萊寶公司；基因組提取、質(zhì)粒提取、膠回收、產(chǎn)物純化試劑盒，上海生工生物工程公司。核酸內(nèi)切酶、T4連接酶、磷酸化酶以及l(fā)igation solutionⅠ、DNA marker，大連Takara公司；高斯組裝試劑盒，南京諾唯贊公司；其他未注明試劑均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

核酸電泳儀和PCR儀，Bio-rad 公司；凝膠成像儀，北京賽智公司；5 L發(fā)酵罐，上海迪必爾生物工程有限公司；UH5300雙光束紫外分光光度計(jì)、高速低溫離心機(jī)，日本日立HITACH集團(tuán)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種、質(zhì)粒、以及培養(yǎng)條件

本研究所用的菌種和質(zhì)粒，實(shí)驗(yàn)室保藏及本研究構(gòu)建。

種子液在LB培養(yǎng)基(蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L)中37 ℃，220 r/min培養(yǎng)。LB培養(yǎng)基中額外添加氨芐霉素(Amp)100 μg/mL，卡那霉素(Kan)100 μg/mL，博來霉素(Ble)30 μg/mL和200 μg/mL 的D-丙氨酸。工程菌在Super Rich培養(yǎng)基(蛋白胨25 g/L，酵母提取物20 g/L，K2HPO4·3H2O 3.9 g/L培養(yǎng)基中發(fā)酵，葡萄糖30 g/L)中pH 7.0、37 ℃、220 r/min中發(fā)酵33 h。

1.3.2 引物及PCR擴(kuò)增

本研究所有引物由SnapGene軟件設(shè)計(jì)，上海生工生物工程公司合成。

1.3.3 基因操作方法及試劑

基因組提取，質(zhì)粒提取，膠回收，產(chǎn)物純化，高斯組裝均按照試劑盒說明書操作。1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證PCR產(chǎn)物，Spizizen法[19]轉(zhuǎn)化B.subtilis感受態(tài)。

1.3.4 宿主菌構(gòu)建

通過Cre/lox系統(tǒng)敲除B.subtilis168基因組中dal(GenBank no. CAB12271.1)。首先以質(zhì)粒p7Z6為模板擴(kuò)增lox71-BleR-lox66，B.subtilis168基因組為模板分別擴(kuò)增dal上下游同源臂，以lox71-BleR-lox66和上下游同源臂為模板，通過融合PCR獲得敲除片段，即上游同源+lox71-BleR-lox66+下游同源臂。其次直接將純化好的敲除片段轉(zhuǎn)化進(jìn)B.subtilis感受態(tài)中，在含有Ble和D-丙氨酸的LB平板37 ℃過夜培養(yǎng)，PCR驗(yàn)證正確的即為缺陷型菌株BS168 (dal-,BleR)。最后將溫度敏感型質(zhì)粒pDG148轉(zhuǎn)化至BS168 (dal-,BleR)感受態(tài)中，在含有Kan和D-丙氨酸的LB平板上過夜培養(yǎng)，挑取轉(zhuǎn)化子至僅添加D-丙氨酸的LB平板上51 ℃培養(yǎng)12 h除去質(zhì)粒pDG148，得到無抗性基因且不含pDG148質(zhì)粒的敲除菌BS168 (dal)-。

1.3.5 質(zhì)粒的構(gòu)建

首先以pET-28a-lap為模板擴(kuò)增LAP基因，通過Ned Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切，T4酶連接插入至pMA5質(zhì)粒中得到質(zhì)粒pMA5-lap。其次以pMA5-lap為模板，通過高斯組裝[20]的方法將質(zhì)粒中KanR替換為dal構(gòu)建缺陷互補(bǔ)型表達(dá)載體pMA5-lap-dal。最后，為保證食品級(jí)表達(dá)載體基因來源的安全性，本研究采用定點(diǎn)突變?cè)噭┖械姆椒▌h除pMA5中原有的AmpR和E.coli的Ori。具體方法如下：以pMA5-lap-dal質(zhì)粒為模板，通過反向PCR的方法得到不含AmpR和Ori (E.coli)的線性質(zhì)粒 pMA5-lap-dal(AmpR, Ori)-；線性質(zhì)粒骨架依次通過磷酸化處理，ligation solution環(huán)化，Dpn Ⅰ消化；將環(huán)化質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至缺陷型菌株BS168 (dal)-感受態(tài)中，得到食品級(jí)工程菌BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal(AmpR, Ori)-。

1.3.6 重組質(zhì)粒的分離穩(wěn)定性

參照HUANG等[21]方法，考察食品級(jí)工程菌BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal(AmpR, Ori)-質(zhì)粒分離穩(wěn)定性。具體操作如下：挑取食品級(jí)工程菌于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h作為種子液；將種子液分別轉(zhuǎn)接至含有D-丙氨酸的LB和普通LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，吸取菌液稀釋105后分別涂布于含有D-丙氨酸的LB平板中過夜培養(yǎng);從中分別挑取100個(gè)菌落轉(zhuǎn)接至含有D-丙氨酸和普通LB平板中，統(tǒng)計(jì)兩平板菌落數(shù)作為傳代20代的質(zhì)粒穩(wěn)定性。以此類推，傳代至第100代。用CC/CD來表示質(zhì)粒分離穩(wěn)定性。其中CC代表重組菌在普通LB培養(yǎng)基中的菌落數(shù)，CD代表重組菌在LB+D-丙氨酸培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的菌落數(shù)。

1.3.7 酶活測(cè)定方法

按照WANG等[22]的方法測(cè)定亮氨酸氨肽酶酶活，如公式(1)所示：

(1)

式中：X，樣品的酶活，U/mL；N，于405 nm處測(cè)得吸光度值；Y，酶液稀釋的倍數(shù)。

氨肽酶酶活定義為在以上分析測(cè)定的基礎(chǔ)上，定義一個(gè)酶活單位(U)為在特定條件下(50 ℃，pH 8.5)，每分鐘催化分解L-亮氨酸-硝基苯胺產(chǎn)生1 μmol的對(duì)硝基苯胺所需要的酶量。

1.3.8 5 L發(fā)酵罐優(yōu)化

探究不同轉(zhuǎn)速、溫度、pH對(duì)發(fā)酵的產(chǎn)酶的影響，5 L發(fā)酵罐初始轉(zhuǎn)速設(shè)置為200、300、400、500 r/min，溫度設(shè)置為30、33、36、39 ℃，pH設(shè)置為7.0、7.5和不控制。此外使用搖床優(yōu)化培養(yǎng)基(蛋白胨15 g/L，酵母提取物30 g/L，葡萄糖25 g/L，K2HPO4·3H2O 3.9 g/L，L-谷氨酸鈉5 g/L)發(fā)酵。初始pH為7.0，發(fā)酵過程中使用30%的H3PO4和適當(dāng)濃度的氨水控制pH，使用20%有機(jī)硅消除泡沫。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.5軟件作圖，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 缺陷型宿主菌的構(gòu)建

在B.subtilis生長(zhǎng)代謝中，D-丙氨酸是參與其細(xì)胞壁合成的重要物質(zhì)。然而在普通培養(yǎng)基中，丙氨酸多為L(zhǎng)型，需要D-丙氨酸消旋酶將L-丙氨酸酶催化為D-丙氨酸才能保證菌株的正常生長(zhǎng)[23]。如若刪除B.subtilis基因組中的dal，則B.subtilis會(huì)因?yàn)槿笔-丙氨酸而無法生長(zhǎng)。

在敲除過程中，由于敲除片段與B.subtilis168基因組dal區(qū)域同源性極高，會(huì)和dal區(qū)域發(fā)生雙交叉互換。而在含有Ble和D-丙氨酸的平板中，只有發(fā)生雙交叉互換的菌株才可以正常生長(zhǎng)。為保證食品級(jí)表達(dá)宿主菌基因組不含有抗性基因，需要質(zhì)粒pDG148進(jìn)一步刪除BS168 (dal-,BleR)基因組中遺留的BleR。pDG148質(zhì)粒含有Cre重組酶編碼基因cre，Cre重組酶可以特異性識(shí)別loxP位點(diǎn)并催化lox71和lox66位點(diǎn)使之發(fā)生特異性重組[18]，從而刪除位于lox71和lox66之間的BleR。此外，雖然B.subtilisWB600和B.subtilisWB800刪除了部分的蛋白酶基因，更有利于蛋白質(zhì)的異源表達(dá)。但是它們?cè)跇?gòu)建過程引入了其他抗性基因，不符合GRAS菌的要求，因此B.subtilis168更適合做食品級(jí)用酶的宿主菌。

2.2 質(zhì)粒的構(gòu)建

質(zhì)粒圖譜如圖1所示，首先構(gòu)建質(zhì)粒pMA5-lap-dal，質(zhì)粒含有D-丙氨酸消旋酶的完整基因及其啟動(dòng)子，從而保證含有質(zhì)粒pMA5-lap-dal的缺陷菌BS168 (dal)-可以在普通培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)。為保證基因來源的安全性，在質(zhì)粒pMA5-lap-dal的基礎(chǔ)上刪除E.coli的Ori和AmpR，進(jìn)一步構(gòu)建食品級(jí)質(zhì)粒pMA5-lap-dal(AmpR, Ori)-。

圖1 質(zhì)粒pMA5-lap、pMA5-lap-dal、pMA5-lap-dal (AmpR, Ori)-圖譜Fig.1 Construction of the plasmid pMA5-lap, pMA5-lap-dal, pMA5-lap-dal (AmpR, Ori)-

與傳統(tǒng)的抗生素依賴性工程菌相比，食品級(jí)工程菌是靠自身對(duì)D-丙氨酸的營(yíng)養(yǎng)缺陷形成篩選壓力的。自身的dal代替了原來質(zhì)粒上的抗性基因，在發(fā)酵過程中不需要額外添加抗生素維持質(zhì)粒穩(wěn)定性。在源頭上杜絕了抗生素的添加，省略了產(chǎn)物提取過程中去除抗生素這一步驟，即節(jié)省了發(fā)酵生成本，也提高了產(chǎn)物安全性。此外，缺陷型菌株BS168 (dal)-和質(zhì)粒pMA5-lap-dal(AmpR, Ori)-的構(gòu)建原理和方法也可以為其他食品用酶表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建提供新思路。

2.3 重組菌的發(fā)酵分析

將BS168/pMA5-lap、BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal、BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal(AmpR, Ori)-3株重組菌在Super Rich培養(yǎng)基中發(fā)酵33 h。如圖2所示，在發(fā)酵時(shí)間達(dá)到30 h時(shí)，3株菌OD600均達(dá)到最大。其中BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal和BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal(AmpR, Ori)-的OD600曲線相似，最大值分別為9.23和9.58，稍高于BS168/pMA5-lap的最大值。比較3株菌產(chǎn)酶情況可以發(fā)現(xiàn)，菌株BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal、BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal(AmpR, Ori)-產(chǎn)酶曲線相似，酶活最高達(dá)到60 U/mL，是BS168/pMA5-lap最高酶活的2倍。以上結(jié)果表明，BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal、BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal(AmpR, Ori)-在生長(zhǎng)、產(chǎn)酶水平方面優(yōu)于BS168/pMA5-lap。

這可能是由于BS168/pMA5-lap的篩選壓力是由卡那霉素提供的，卡那霉素是通過結(jié)合核糖體抑制蛋白質(zhì)合成。雖然KanR在質(zhì)粒中表達(dá)的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶可以水解卡那霉素以阻止這種結(jié)合[24]，但會(huì)在一定程度上影響細(xì)胞生長(zhǎng)。對(duì)于BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal、BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal(AmpR, Ori)-，篩選壓力是基于菌株自身dal的缺失造成的，篩選標(biāo)記基因來源于宿主菌自身，菌株的生長(zhǎng)負(fù)荷小，更有利于食品用酶的表達(dá)[16]。最后，為保證重組菌達(dá)到GRAS菌株標(biāo)準(zhǔn)，本研究選取BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal(AmpR, Ori)-做為最終產(chǎn)LAP的工程菌。

a-LAP酶活；b-OD600圖2 菌株BS168/pMA5-lap, BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal, BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal (AmpR, Ori)-發(fā)酵曲線Fig.2 The fermentation curve of BS168 /pMA5-lap,BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal, BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal (AmpR, Ori)-

2.4 重組質(zhì)粒分離穩(wěn)定性

如果質(zhì)粒分離穩(wěn)定性較差，會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的質(zhì)粒丟失現(xiàn)象，導(dǎo)致發(fā)酵后期質(zhì)粒丟失的菌株成為優(yōu)勢(shì)菌種，從而嚴(yán)重影響目的蛋白表達(dá)量[21]。由表1可知，BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal(AmpR, Ori)-在LB+D-丙氨酸培養(yǎng)基中，第60代以前質(zhì)粒基本可以保證正常的傳代，然而到80代時(shí)質(zhì)粒出現(xiàn)嚴(yán)重的丟失現(xiàn)象，傳代至100代，質(zhì)粒保持率僅為57%。而在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，傳代100代，質(zhì)粒仍保持良好。這可能是由于普通LB培養(yǎng)基中對(duì)BS168 (dal)-存在著強(qiáng)有力的篩選壓力，質(zhì)粒一旦丟失，則菌株無法正常生長(zhǎng)。而在LB+D-丙氨酸的培養(yǎng)基中不存在篩選壓力，無法維持質(zhì)粒長(zhǎng)期分離穩(wěn)定性。

2.5 重組菌5 L發(fā)酵罐不同條件對(duì)產(chǎn)酶及生長(zhǎng)影響

不同的發(fā)酵條件對(duì)菌株的生長(zhǎng)代謝和產(chǎn)酶水平往往會(huì)有重要影響[25-26]，在搖床優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的基礎(chǔ)上進(jìn)行5 L發(fā)酵罐優(yōu)化。

考察不同轉(zhuǎn)速對(duì)BS168(dal)-/pMA5-lap-dal(AmpR, Ori)-產(chǎn)LAP的影響，轉(zhuǎn)速分別設(shè)置為200、300、 400和500 r/min，由圖3可知，隨著轉(zhuǎn)速的增加，菌體OD600和LAP酶活都呈現(xiàn)出先增加后減小的趨勢(shì)。轉(zhuǎn)速為300 r/min時(shí)，OD600和酶活均處于較高水平。

表1 質(zhì)粒pMA5-lap-dal (AmpR, Ori)-分離穩(wěn)定性Table 1 Separationstabilities of the plasmid pMA5-lap-dal (AmpR, Ori)-

a-LAP酶活；b-OD600圖3 不同轉(zhuǎn)速對(duì)BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal (AmpR, Ori)-發(fā)酵的影響Fig.3 The effects of different stirring speeds on the fermentation of BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal (AmpR, Ori)-

考察不同溫度對(duì)BS168(dal)-/pMA5-lap-dal(AmpR, Ori)-產(chǎn)LAP的影響，溫度分別設(shè)置為30、 33、 36和39 ℃。如圖4所示，隨著溫度的升高，菌株的產(chǎn)酶周期縮短，最高酶活力減少。在溫度為33 ℃時(shí)酶活達(dá)最高為206 U/mL。

a-LAP酶活；b-OD600圖4 不同溫度對(duì)BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal (AmpR, Ori)-發(fā)酵的影響Fig.4 The effects of different temperature on the fermentation of BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal (AmpR, Ori)-

a-LAP酶活；b-OD600圖5 不同pH對(duì)BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal (AmpR, Ori)-發(fā)酵的影響Fig.5 The effects of different pH on the fermentition of BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal (AmpR, Ori)-

pH可以影響物質(zhì)分子狀態(tài)和細(xì)胞原生質(zhì)體所帶的電荷，繼而使得細(xì)胞的代謝通路和細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變，從而影響發(fā)酵產(chǎn)率[27]。考察不同pH對(duì)食品級(jí)重組菌產(chǎn)LAP的影響，pH分別設(shè)置為7.0、7.5、不控制。由圖5可知，當(dāng)pH為7.0時(shí)，重組菌在36 h酶活達(dá)到最大為220 U/mL；在pH為7.0和pH為7.5的條件下，菌體OD600較為接近，但低于pH不控制條件下的OD600。為使菌體更利于產(chǎn)酶，因此選用恒定pH為7.0的條件進(jìn)行后續(xù)發(fā)酵。

圖6 分批補(bǔ)料條件下，BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal (AmpR, Ori)-發(fā)酵過程曲線Fig.6 Time courses of LAP production by the food-grade recombinant B. subtilis under fed-batch conditions

發(fā)酵后期葡萄糖消耗大，殘?zhí)菨舛鹊?，?huì)影響后期菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶。合理的補(bǔ)料可以進(jìn)一步提高產(chǎn)酶[28]。在轉(zhuǎn)速，溫度，pH 三條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，采用分批流加補(bǔ)料，結(jié)果如圖6 所示。在發(fā)酵33～61 h，每隔6 h向發(fā)酵罐中補(bǔ)充葡萄糖，補(bǔ)料4次。重組菌在發(fā)酵至54 h時(shí)LAP酶活和OD600均達(dá)到最大。發(fā)酵周期雖然延長(zhǎng)至54 h，但最高酶活達(dá)302 U/mL，相較于未補(bǔ)料時(shí)最高酶活220 U/mL，酶活提高37%。

3 結(jié)論

本研究基于D-丙氨酸消旋酶缺陷互補(bǔ)，構(gòu)建了1株不含抗性基因的高產(chǎn)亮氨酸氨肽酶食品級(jí)工程菌，解決了B.subtilis在發(fā)酵過程中需要添加抗生素這一問題。在本研究中，發(fā)現(xiàn)食品級(jí)工程菌BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal(AmpR, Ori)-相較于抗生素依賴型工程菌，更適合LAP的表達(dá)。對(duì)BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal(AmpR, Ori)-進(jìn)行5 L發(fā)酵罐優(yōu)化，在轉(zhuǎn)速300 r/min, 溫度33 ℃，pH 7.0，31～61 h、4次分批補(bǔ)料條件下，酶活最高達(dá)到302 U/mL，高于目前汪曉東等[29]報(bào)道的138 U/mL，XI等[2]報(bào)道的28.5 U/mL，孔峰等[30]報(bào)道的232.5 U/mL。結(jié)果表明，食品級(jí)重組菌BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal(AmpR, Ori)-具有較好的工業(yè)應(yīng)用前景，且該研究也為其他食品加工用酶的菌株構(gòu)建提供了一定的借鑒和理論指導(dǎo)。