FOXP4 的表達(dá)及其對(duì)β-catenin 轉(zhuǎn)錄的調(diào)控在結(jié)直腸癌中的作用

張淑蓮，馬軍，齊寶華，范志剛，徐長(zhǎng)福

（1. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部附屬三二〇一醫(yī)院 腫瘤科，陜西 漢中 723000；2. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710061）

結(jié)直腸癌為全球第三大最常見(jiàn)的惡性腫瘤，據(jù)報(bào)道僅2018年全球新增結(jié)直腸癌病例180萬(wàn)，死亡86萬(wàn)例[1]。近10年來(lái)，由于生活和飲食習(xí)慣的變化，結(jié)直腸癌的發(fā)病率迅速上升[2-3]。癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移是目前結(jié)直腸癌致死的主要原因，大約60%的結(jié)直腸癌患者后期會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移[4]。盡管結(jié)直腸癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方法可以使早期結(jié)直腸癌患者的病情有所改善，但對(duì)中晚期結(jié)直腸癌患者療效并不明顯，5年生存率僅為13.9%[5-6]。因此，有必要了解中晚期結(jié)直腸癌進(jìn)展與轉(zhuǎn)移的機(jī)制，希望能找到一種新的可以降低晚期結(jié)直腸患者耐藥的治療靶點(diǎn)。越來(lái)越多的證據(jù)表明轉(zhuǎn)錄因子在對(duì)腫瘤的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，比如FOXP家族（FOXP1、FOXP2、FOXP3和FOXP4）作為其中一類轉(zhuǎn)錄因子，研究發(fā)現(xiàn)其在多種腫瘤的生長(zhǎng)、發(fā)生和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[7-9]。已證實(shí)FOXP1低表達(dá)的結(jié)直腸癌，其腫瘤細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，生存期較差[10]。而FOXP4在結(jié)直腸癌中的調(diào)節(jié)機(jī)制目前尚未報(bào)道，因此本研究通過(guò)收集結(jié)直腸癌患者的臨床標(biāo)本，分析FOXP4在癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平，并通過(guò)細(xì)胞與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析相關(guān)的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

HT-29細(xì)胞、CaCo2細(xì)胞、HT-29和CaCo2耐藥細(xì)胞均購(gòu)自蓋寧生物；DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；XAV-939以及CCK8試劑盒購(gòu)自Selleck公司；psPAX2、pMD2G、plKO.1-NO、pLKO.1-siFOXP4、pLenti-3F以及pLenti-F O X P 4 購(gòu)自生物風(fēng)有限公司；F O X P 4 引物、GAPDH引物購(gòu)自武漢擎科生物有限公司；RNA提取試劑盒購(gòu)自Takara公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit）以及Universal SYBR?qPCR Master Mix試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；一抗GAPDH、β-catenin及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔/鼠二抗購(gòu)自三鷹生物科技有限公司；Western blot試劑盒及BCA蛋白濃度測(cè)量試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；免疫組化試劑盒以及雙熒光素酶試劑盒購(gòu)自Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 239T 細(xì)胞、LOVO 細(xì)胞、CaCo2細(xì)胞、DLD1 細(xì)胞、SW48 細(xì)胞、HCT116 細(xì)胞均培養(yǎng)于含10%FBS-DMEM 中，5% CO2，37 ℃。

1.2.2 組織來(lái)源 于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部附屬三二〇一醫(yī)院收集50 例確診為結(jié)直腸癌的患者臨床信息，取其癌組織和癌旁組織。取出樣本后立即置于液氮中冷凍，然后置于-80 ℃保存。

1.2.3 病毒包裝 收集對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)293T 細(xì)胞，接種于6 cm 培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。 首先將質(zhì)粒以pLent-3F/pLent-FOXP4/plKO.1-NO/pLKO.1-siFOXP4:psPAX2: pMD2G=4:3:1 的比例混合，轉(zhuǎn)染至293T 細(xì)胞，6 h后更換新鮮DMEM 培養(yǎng)基，48 h 收細(xì)胞上清。

1.2.4 病毒感染及穩(wěn)定敲減細(xì)胞系篩選 收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的結(jié)直腸癌細(xì)胞系，待細(xì)胞融合度達(dá)到80% 時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，嚴(yán)格按照Lipofectamine 3000 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行慢病毒感染，24 h 后更換至新鮮培養(yǎng)基。并進(jìn)一步采用嘌呤霉素（2 mg/L）持續(xù)篩選，2 周后，采用Western blot，RT-PCR 檢測(cè)上述細(xì)胞的過(guò)表達(dá)以及敲減的效率。

1.2.5 RT-PCR 檢測(cè) 首先使用TRNA 提取試劑盒提取RNA；進(jìn)一步將RNA 逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。以GAPDH 為內(nèi)參，GAPDH 正向引物為5'-GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG-3'，反向引物為5'-TGC ACC ACC AAC TGT TAG C-3'；FOXP4 正向引物為5'-CGA CAT GAT GGT GGA ATC TG-3'，反向引物為5'-TGT TTG CTG TCA TTG TTC CC-3'，所有基因的相對(duì)表達(dá)水平用2-?CT法計(jì)算。

1.2.6 Western blot 檢測(cè) 加入RIPA 裂解液處理細(xì)胞，待細(xì)胞充分裂解后，4 ℃，離心10 min。取上清，BCA 法測(cè)定蛋白濃度，取等量的蛋白上樣，運(yùn)行SDS-PAGE 電泳。然后采用PDVF 膜轉(zhuǎn)膜，5% 脫脂奶粉封閉，孵育FOXP4、β-catenin、GAPDH 一抗，室溫孵育二抗，曝光顯影。

1.2.7 CCK8 檢測(cè)細(xì)胞活力 將處理好的LOVO細(xì)胞，SW48 細(xì)胞，SW480 細(xì)胞，HCT116 細(xì)胞接種于96 孔板中，接種密度為2.0×103個(gè)。分別于0、12、24、48、72 h 避光加入CCK-8 溶液30 μL；孵育3 h 后，采用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 波長(zhǎng)處的吸光度值。

1.2.8 Transwell 檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力 將處理好 的LOVO 細(xì) 胞，SW48 細(xì) 胞，SW480 細(xì) 胞，HCT116 細(xì)胞培養(yǎng)于Transwell 小室的上層，同時(shí)下層添加500 μL 含有10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h 后，用棉簽去除上室的細(xì)胞，室溫下用0.1% 結(jié)晶紫染色30 min。最后，對(duì)遷移的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并用光學(xué)顯微鏡拍照。每個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次。

1.2.9 免疫組化檢測(cè) 組織切片入放入65 ℃烤箱中烤1.5 h，切片在二甲苯放置10 min，更換二甲苯放置10 min，將切片依次放入100% 乙醇、95%乙醇、80% 乙醇中、純化水各5 min，將切片放入修復(fù)盒中加入抗原修復(fù)液，高壓鍋加熱到自動(dòng)放氣，2 min 后離開(kāi)熱源，自然冷卻。棄去抗原修復(fù)液，將切片用PBS 淋洗，0.5%Triton X-100 室溫通透20 min，將切片移入濕盒中加入新鮮配制的3% 雙氧水，室溫孵育10 min，PBS 充分淋洗，浸洗3 次，每次3 min，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加山羊血清，室溫封閉30 min，每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗（FOXP4 1:300），放入濕盒，4 ℃孵育過(guò)夜，滴加兔二抗工作液，室溫孵育1 h，PBS 充分淋洗，DAB 顯色10 min，PBS 沖洗2 min，蘇木精復(fù)染3 min，鹽酸酒精分化，反藍(lán)，PBS 沖洗1 min 脫水、透明、封片、光學(xué)顯微鏡下拍照。

1.2.10 ChIP 實(shí)驗(yàn)檢測(cè) 取出經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)要求處理的細(xì)胞，加入1% 多聚甲醛，37 ℃孵育10 min，加甘氨酸，混勻后，在室溫下放置5 min。吸盡培養(yǎng)基，用冰冷的PBS 清洗細(xì)胞2 次。細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞于15 mL 離心管中，2 000 r/min，離心 5 min，收集細(xì)胞，加入500 μL SDS 裂解緩沖液，超聲破碎，1 200 r/min，4 ℃，離心10 min。取上清，其中1 管中加入1 μL FOXP4 抗體，另1 管中加對(duì)照IgG，4 ℃顛轉(zhuǎn)過(guò)夜。孵育過(guò)夜后，每管中加入 60 μL ProteinA/G，4 ℃， 孵 育2 h。700 r/min離心1 min，除去上清，每管中加入20 μL NaCl溶液，混勻，65 ℃解交聯(lián)過(guò)夜，每管加入1 μL RNaseA，37 ℃孵育1 h，每管加入10 μL EDTA，20 μL Tris-HCl（pH6.5），2 μL 10 mg/mL 蛋白酶K，回收DNA 片段。

1.2.11 熒光素酶檢測(cè) 將野生型以及突變型的β-catenin 的啟動(dòng)子質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到相應(yīng)的細(xì)胞系中，48 h 后，使用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次，應(yīng)用SPSS 14.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較均采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 FOXP4 在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及作用分析

采用免疫組化和RT-PCR檢測(cè)癌組織和癌旁組織中FOXP4的相對(duì)表達(dá)量（圖1A-B），結(jié)果顯示結(jié)直腸癌患者癌組織中FOXP4的表達(dá)量明顯高于癌旁組織（P＜0.01）。采用GEIPA（http://gepia.cancer-pku.cn）數(shù)據(jù)庫(kù)分析FOXP4在結(jié)直腸癌中的表達(dá)量以及對(duì)結(jié)直腸癌患者的生存期的影響（圖1 C-D），結(jié)果顯示，癌組織中的F O X P 4 表達(dá)量明顯高于正常組織（P ＜0.0 5），且高表達(dá)F O X P 4 的患者其總體生存率明顯較差（P＜0.05）。據(jù)上述結(jié)果推測(cè)FOXP4在結(jié)直腸癌進(jìn)展中可能發(fā)揮一定作用。

比較結(jié)直腸癌組中F O X P 4 表達(dá)與不同病理特征發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXP4的表達(dá)在不同性別、年齡段的患者中無(wú)明顯差異（均P＞0.05），在不同腫瘤大小、分化程度、T分期、N分期及M分期的患者中差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），其在腫瘤大?。? cm、分化程度中低、T3～4期、及高N和M1期的患者中表達(dá)明顯增高（表1）。

2.2 FOXP4 表達(dá)水平對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖的影響

進(jìn)一步探究FOXP4對(duì)結(jié)直腸癌進(jìn)展的影響，首先使用R T-P C R 檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞系L O V O，SW48，SW480，HCT116，CaCo2以及DLD1中FOXP4的表達(dá)量（圖2A），結(jié)果顯示，LOVO，S W 4 8 細(xì)胞F O X P 4 表達(dá)量相對(duì)降低，H C T 1 1 6、S W 4 8 0 細(xì)胞F O X P 4 表達(dá)量相對(duì)較高?；谠摻Y(jié)果，構(gòu)建SW48-空載體、SW48-FOXP4、LOVO-空載體、LOVO-FOXP4細(xì)胞系以及SW480-陰性對(duì)照序列、SW480-siFOXP4、HCT116-陰性對(duì)照序列、HCT116-siFOXP4細(xì)胞系；采用RT-PCR證實(shí)了FOXP4在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的過(guò)表達(dá)及敲減效率（圖2B-C）。進(jìn)一步使用CCK8檢測(cè)FOXP4對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞系增殖能力的影響（圖2D-G），結(jié)果表明，F(xiàn)OXP4過(guò)表達(dá)可明顯增加結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖能力（均P＜0.01）；FOXP4低表達(dá)可明顯降低結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖能力（均P＜0.01）。

圖1 FOXP4 在結(jié)直腸癌中表達(dá)的檢測(cè)與分析 A：免疫組化檢測(cè)結(jié)直腸癌組織與癌旁組織中FOXP4 的表達(dá)（×200）；B：RT-PCR 檢測(cè)結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中FOXP4 的表達(dá)；C：GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)直腸癌患者FOXP4 的表達(dá)； D：GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)直腸癌患者FOXP4 的表達(dá)量與總體生存率的關(guān)系Figure 1 Determination and analysis of FOXP4 expression in colorectal cancer A: Immunohistochemical attaining for FOXP4 expressions in colorectal cancer tissues and adjacent tissues (×200); B: RT-PCR detection of FOXP4 expressions in colorectal cancer tissues and adjacent tissues; C: GEPIA database analysis of the expression level of FOXP4 in patients with rectal cancer; D: GEPIA database analysis of the relationship between the expression level of FOXP4 and overall survival rate in patients with colorectal cancer

表1 FOXP4 表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系[n（%）]Table 1 Relations of FOXP4 expression with the clinicopathologic characteristics of colorectal cancer patients [n (%)]

圖2 FOXP4 表達(dá)量對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力的影響 A：RT-PCR 檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞系中FOXP4 的表達(dá)量；B：RT-PCR檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞系中FOXP4 的過(guò)表達(dá)效率；C：RT-PCR 檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞系中FOXP4 的敲減效率；D：CCK8 檢測(cè)FOXP4 過(guò)表達(dá)對(duì)LOVO 細(xì)胞增殖能力的影響；E：CCK8 檢測(cè)FOXP4 過(guò)表達(dá)對(duì)SW48 細(xì)胞增殖能力的影響；F：CCK8 檢測(cè)FOXP4 敲減對(duì)SW480 細(xì)胞增殖能力的影響；G：CCK8 檢測(cè)FOXP4 敲減對(duì)HCT116 細(xì)胞增殖能力的影響Figure 2 The influence of FOXP4 expression level on the proliferative ability of colorectal cancer cells A: RT-PCR detection of FOXP4 expression levels in different colorectal cancer cell lines; B: RT-PCR detection of FOXP4 overexpression efficiency in colorectal cancer cell lines; C: RT-PCR detection of FOXP4 knockdown efficiency in colorectal cancer cell lines; D: CCK8 detection of the effect of FOXP4 overexpression on the proliferation of LOVO cells; E: CCK8 detection of the effect of FOXP4 overexpression on the proliferation of SW48 cells; F: CCK8 detection of the effect of FOXP4 knockdown on the proliferation of SW480 cells; G: CCK8 detection of the effect of FOXP4 knockdown on the proliferation of SW480 cells

2.3 FOXP4 促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移能力

進(jìn)一步探討FOXP4對(duì)結(jié)直癌細(xì)胞系遷移能力的影響，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)FOXP4后，LOVO細(xì)胞和SW48細(xì)胞的遷移能力明顯增加（均P＜0.01）（圖3A-D）；FOXP4敲減后，SW480和HCT116細(xì)胞的遷移能力明顯下降（均P＜0.01）（圖3E-H）。

2.4 FOXP4 對(duì)β-catenin 轉(zhuǎn)錄水平的影響

上述實(shí)驗(yàn)初步證明了FOXP4可調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移，接下來(lái)，進(jìn)一步探究其涉及到的分子機(jī)制。首先，采用AnimalTFDB 3.0數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)F O X P 4 的靶啟動(dòng)子（圖4 A），結(jié)果發(fā)現(xiàn)FOXP4有可能與β-catenin啟動(dòng)子結(jié)合。進(jìn)一步采用ChIP實(shí)驗(yàn)證明了FOXP4可識(shí)別β-catenin啟動(dòng)子區(qū)域（圖4B）。此外，RT-PCR和Western blot分別從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平驗(yàn)證了FOXP4過(guò)表達(dá)可明顯增加β-catenin的表達(dá)（圖4C-E）。最后，構(gòu)建野生型和突變型的β-catenin熒光素酶報(bào)告基因（圖4D），結(jié)果顯示，F(xiàn)OXP4只能識(shí)別野生型的β-catenin的序列（圖4G-H）。綜合以上結(jié)果，提示FOXP4可識(shí)別調(diào)控β-catenin的轉(zhuǎn)錄水平。

圖4 FOXP4 對(duì)β-catenin 轉(zhuǎn)錄水平的影響 A：AnimalTFDB 3.0 預(yù)測(cè)FOXP4 結(jié)合β-catenin 啟動(dòng)子序列；B：ChIP 驗(yàn)證FOXP4 與β-catenin 的相互作用；C：RT-PCR 檢測(cè)FOXP4 過(guò)表達(dá)對(duì)β-catenin 的mRNA 水平的影響；D：野生型以及突變型的β-catenin 啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建；E-F：Western blot 檢測(cè)FOXP4 過(guò)表達(dá)后對(duì)β-catenin 的蛋白水平的影響；G-H：熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FOXP4 對(duì)野生型以及突變型的β-catenin 轉(zhuǎn)錄活性的影響Figure 4 Effect of FOXP4 on β-catenin transcription level A: AnimalTFDB3.0 predicting the FOXP4 binding to the promoter sequence of β-catenin; B: ChIP verification of the interaction between FOXP4 and β-catenin; C: RT-PCR detection of the effect of FOXP4 overexpression on the mRNA expression level of β-catenin; D: Construction of luciferase reporter plasmids of wild and mutant type of β-catenin promoter; E-F: Western blot analysis of the effect of FOXP4 overexpression on protein expression level of β-catenin; G-H: Luciferase report assay for influence of FOXP4 on transcriptional activities of the wild and mutant type of β-catenin

2.5 結(jié)直腸癌細(xì)胞中β-catenin 與FOXP4 的關(guān)系

為進(jìn)一步確定β-c a t e n i n 是否參與介導(dǎo)了FOXP4所引起的結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖遷移能力的變化，使用β-catenin抑制劑XAV-939處理過(guò)表達(dá)F O X P 4 的結(jié)直腸癌細(xì)胞，結(jié)果顯示，F(xiàn) O X P 4 過(guò)表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖與遷移能力的增強(qiáng)作用均被取消（均P＜0.05）（圖5）。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明β-catenin介導(dǎo)了FOXP4對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的調(diào)控 作用。

圖5 結(jié)直腸癌細(xì)胞中β-catenin 與FOXP4 的關(guān)系 A：CCK8 檢測(cè)β-catenin 抑制劑對(duì)SW48 細(xì)胞增殖能力的影響； B：CCK8 檢測(cè)β-catenin 抑制劑對(duì)LOVO 細(xì)胞增殖能力的影響；C-D：Transwell 檢測(cè)β-catenin 抑制劑對(duì)SW48 細(xì)胞遷移能力的影響；E-F：Transwell 檢測(cè)β-catenin 抑制劑對(duì)LOVO 細(xì)胞遷移能力的影響Figure 5 Relationship between β-catenin and FOXP4 in colorectal cancer cells A: CCK8 assay for the effect of β-catenin inhibitor on the proliferation of SW48 cells; B: CCK8 assay for the proliferation of LOVO cells; C-D: Transwell assay for the effect of β-catenin inhibitor on migration ability of SW48 cells; E-F: Transwell assay for the effect of β-catenin inhibitor on migration ability of LOVO cells

3 討 論

中晚期結(jié)直腸癌的惡性增殖以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致結(jié)直腸癌患者死亡的主要原因，約有15%～25% 的結(jié)直腸癌患者出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移[11-12]。目前肝轉(zhuǎn)移灶的切除只可以提高部分患者（25%～40%）的5年生存率[13-14]，所以目前急需探索可影響結(jié)直癌增殖、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的因素。

FOXP轉(zhuǎn)錄因子家族可通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化影響腫瘤的細(xì)胞生物學(xué)表型。比如FOXP1可調(diào)控趨化因子CXCL的表達(dá)來(lái)控制乳腺癌細(xì)胞對(duì)淋巴結(jié)的侵潤(rùn)[15-16]；同樣在三陰性乳腺癌中，F(xiàn)OXP2可通過(guò)靶向GRP78增加腫瘤細(xì)胞的增殖與遷移能力[17]；FOXP3特異性表達(dá)于T調(diào)節(jié)細(xì)胞中，參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的免疫耐受能力，最近也有文章報(bào)道FOXP3可通過(guò)抑制COX2的轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)直腸癌干細(xì)胞的自我更新[18-21]；FOXP4可通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子Snail的活性來(lái)增強(qiáng)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)分子的表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[22]，而在肝細(xì)胞癌中的FOXP4可激活Slug的轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移能力[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，與癌旁正常組織相比，F(xiàn)OXP4在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)顯著上調(diào)，F(xiàn)OXP4高表達(dá)與患者不同臨床特征具有顯著性差異，同時(shí)高表達(dá)FOXP4的患者總體生存率可能降低。細(xì)胞層面發(fā)現(xiàn)FOXP4過(guò)表達(dá)可促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和遷移，而敲低FOXP4可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖及遷移，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明FOXP4可能在結(jié)直腸腫瘤的進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。

在80%的結(jié)直腸癌患者中β-catenin處于過(guò)度激活狀態(tài)[24-25]，β-catenin是Wnt通路的靶向分子，其激活被認(rèn)為是腫瘤形成過(guò)程的核心。另外還發(fā)現(xiàn)β-catenin/TCF信號(hào)在90%以上的結(jié)直腸癌中呈現(xiàn)高表達(dá)，而這與結(jié)直腸癌的不良預(yù)后息息相關(guān)[26-30]。然而目前關(guān)于轉(zhuǎn)錄因子FOXP4是如何影響結(jié)直腸癌進(jìn)展的機(jī)制仍不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)FOXP4可以識(shí)別β-catenin啟動(dòng)子區(qū)域，提示FOXP4可能通過(guò)調(diào)控β-catenin發(fā)揮促結(jié)直腸癌增殖和遷移的作用。進(jìn)一步驗(yàn)證試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)FOXP4可增加β-catenin基因及蛋白的表達(dá)，其僅可識(shí)別野生型β-catenin的序列。使用β-catenin抑制劑抑制其活性后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn) O X P 4 過(guò)表達(dá)所促進(jìn)的結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和遷移能力下降，表明FOXP4可能通過(guò)調(diào)控β-catenin活性促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和遷移。

盡管本研究首次揭示FOXP4在結(jié)直腸癌中的可能作用，但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果仍需在動(dòng)物層面進(jìn)一步驗(yàn)證，同時(shí)FOXP4是如何調(diào)控β-catenin活性，其具體調(diào)控機(jī)制尚不清晰，這將是今后進(jìn)一步研究的方向。

總之，本文證明了FOXP4可促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移，在分子機(jī)制上，明確了FOXP4可能通過(guò)促進(jìn)β-catenin的轉(zhuǎn)錄活性，增加結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移能力，這為未來(lái)結(jié)直腸癌患者的治療提供新的思路。