血清mir-210、HIF-1α水平與動脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血后遲發(fā)性腦缺血的關(guān)系

王 娜， 卞玉杰， 田繼新

動脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血(aneurysmal subarachnoid hemorrhage，aSAH)是一種非常嚴(yán)重的腦血管疾病，其病情兇險(xiǎn)，易并發(fā)遲發(fā)性腦缺血(delayed cerebral ischemia，DCI)，嚴(yán)重影響患者神經(jīng)功能恢復(fù)。近年來，aSAH后DCI發(fā)病率越來越高，是導(dǎo)致aSAH患者殘疾、死亡的主要原因[1]。因此，早期預(yù)測aSAH后DCI發(fā)生顯得至關(guān)重要。

研究發(fā)現(xiàn)微小RNA(microRNA，miRNA)參與調(diào)節(jié)腦卒中的各個(gè)環(huán)節(jié)，在其發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用[2]。微小RNA-210(microRNA-210，mir-210)是miRNA中重要一員，能夠促進(jìn)血管新生，其水平變化與頸動脈狹窄程度相關(guān)[3]。而缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)是機(jī)體缺氧時(shí)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，其能通過調(diào)控mir-210表達(dá)促進(jìn)疾病發(fā)展[4]。

為探討血清mir-210、HIF-1α水平在aSAH后DCI發(fā)生中的作用，本研究通過測定260例aSAH患者血清mir-210、HIF-1α水平，用于評估兩者與aSAH后DCI發(fā)生可能關(guān)系，并探討血清mir-210、HIF-1α水平對aSAH后DCI發(fā)生的預(yù)測價(jià)值。結(jié)果如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年10月-2019年10月在本院神經(jīng)外科診治的260例aSAH患者作為研究對象，其中男性114例，女性146例；年齡30～70歲，平均年齡(55.27±12.81)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)均符合aSAH相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；(2)臨床資料齊全；(3)均為初次發(fā)??；(4)發(fā)病至入院時(shí)間<24 h。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)非動脈瘤破裂所致蛛網(wǎng)膜下腔出血者；(2)入院7 d內(nèi)死亡；(3)伴有嚴(yán)重肝、腎功能不全者；(4)伴有顱內(nèi)感染或血液系統(tǒng)疾病者。本研究符合本院倫理委員會要求，且患者或家屬簽署《知情同意書》。

1.2 方 法

1.2.1 DCI診斷標(biāo)準(zhǔn)及分組 DCI診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]：(1)發(fā)病4 d后出現(xiàn)肢體癱瘓、意識下降、失語等神經(jīng)功能缺損體征；(2)經(jīng)電子計(jì)算機(jī)斷層掃描(computed tomography，CT)排除顱內(nèi)再出血、腦水腫、腦積水等因素；(3)經(jīng)復(fù)查頭部CT可見新的梗死灶；(4)上述癥狀至少持續(xù)1 h。根據(jù)aSAH后DCI發(fā)生情況將260例患者分為未發(fā)生DCI組(n=181)、發(fā)生DCI組(n=79)。

1.2.2 臨床資料收集 護(hù)理人員收集兩組患者性別、年齡、發(fā)病至入院時(shí)間、高血壓、吸煙(吸煙≥1支/d，且至少持續(xù)1 y者，即為吸煙)、飲酒(乙醇攝入量≥50 g/d，且至少持續(xù)1 y者，即為飲酒)、動脈瘤大小、動脈瘤位置(前循環(huán)或后循環(huán))、Hunt-Hess分級(分為1級、2級、3級、4級、5級)、Fisher分級(分為1級、2級、3級、4級)及治療方式(手術(shù)夾閉或血管內(nèi)栓塞)等資料。

1.2.3 血清mir-210、HIF-1α水平測定 收集患者入院時(shí)肘靜脈血3 ml，3000 r/min離心10 min，抽取血清保存于-70 ℃低溫冰箱中。血清mir-210水平使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)進(jìn)行測定。按照TRIzol試劑盒(貨號：15596018，購自武漢純度生物科技有限公司)說明書從血清中提取總RNA，以紫外分光光度計(jì)檢測其濃度及純度，并依據(jù)PrimeScriptTMRT試劑盒(貨號：RR055A，購自北京冬歌博業(yè)生物科技有限公司)說明書合成cDNA鏈。以U6為對照進(jìn)行擴(kuò)增，引物均是根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫提供的核酸序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，mir-210引物為：上游5’-GTGCAGGGTCCGAGGTCGGC-3’，下游5’-CTGTGCGTGTGACAGCGGCTGA-3’；U6引物為：上游5’-CTCGCTTCGGCACCACAAAT-3’，下游5’-AACGCTTCACGAATTTGCGTCAT-3’。反應(yīng)條件為：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，72 ℃、20 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本均重復(fù)3次，并用2-△△Ct法計(jì)算血清mir-210表達(dá)量。血清HIF-1α水平使用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)進(jìn)行測定，測定方法按試劑盒(貨號：X-EL-H1277c，購自上海江萊生物科技有限公司)說明書進(jìn)行。

采用Pearson檢驗(yàn)分析aSAH患者血清mir-210水平與HIF-1α水平的相關(guān)性；采用多因素Logistic回歸分析影響aSAH后DCI發(fā)生的危險(xiǎn)因素；并使用ROC曲線分析血清mir-210、HIF-1α水平對aSAH后DCI發(fā)生的預(yù)測價(jià)值。均以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者臨床資料比較 兩組患者性別、年齡、發(fā)病至入院時(shí)間、高血壓、吸煙、飲酒、動脈瘤大小及治療方式相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；兩組患者動脈瘤位置、Hunt-Hess分級及Fisher分級情況相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表1)。

2.2 兩組患者血清mir-210、HIF-1α水平比較 發(fā)生DCI組患者血清mir-210、HIF-1α水平均明顯高于未發(fā)生DCI組患者(P<0.05)(見表2)。

2.3 aSAH患者血清mir-210水平與HIF-1α水平相關(guān)性 aSAH患者血清mir-210水平與HIF-1α水平呈正相關(guān)(r=0.693，P<0.05)(見圖1)。

2.4 影響aSAH后DCI發(fā)生的危險(xiǎn)因素分析 以aSAH后是否發(fā)生DCI為因變量，以動脈瘤位置、Hunt-Hess分級≥3級、Fisher分級≥3級及血清mir-210、HIF-1α高水平為自變量進(jìn)行Logistic回歸分析，變量賦值(見表3)。結(jié)果顯示Hunt-Hess分級≥3級、Fisher分級≥3級及血清mir-210、HIF-1α水平是影響aSAH后DCI發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)(見表4)。

2.5 血清mir-210、HIF-1α水平對aSAH后DCI發(fā)生的預(yù)測價(jià)值 血清mir-210水平聯(lián)合HIF-1α水平預(yù)測aSAH后DCI發(fā)生的曲線下面積高于血清mir-210水平(Z=2.018，P=0.044)、HIF-1α水平(Z=3.338，P=0.001)單獨(dú)預(yù)測，其預(yù)測敏感度為83.33%，特異度高達(dá)94.44%(見表5、圖2)。

表1 兩組患者臨床資料比較

與未發(fā)生DCI組患者相比*P<0.05

表2 兩組患者血清mir-210、HIF-1α水平比較

與未發(fā)生DCI組患者相比*P<0.05.

表3 變量賦值

表4 影響aSAH后DCI發(fā)生的危險(xiǎn)因素分析

表5 血清mir-210、HIF-1α水平對aSAH后DCI發(fā)生的預(yù)測價(jià)值

圖1 aSAH患者血清mir-210水平與HIF-1α水平相關(guān)性

圖2 血清mir-210、HIF-1α水平預(yù)測aSAH后DCI發(fā)生的ROC曲線

3 討 論

DCI是aSAH最主要的并發(fā)癥，易導(dǎo)致患者局部腦組織缺血或壞死，發(fā)生不可逆缺血性神經(jīng)功能損害，對患者身心健康造成嚴(yán)重影響。相關(guān)研究證實(shí)[7]，DCI具有較高的致殘率和病死率，且其發(fā)生與aSAH患者病情恢復(fù)有關(guān)。因此，尋找可靠有效的血清標(biāo)記物早期預(yù)測aSAH后DCI發(fā)生情況具有一定臨床價(jià)值，以期為早期防治aSAH后DCI提供有力依據(jù)。

miRNA是一類單鏈非編碼小RNA，大多數(shù)miRNA可能通過調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子而參與大腦缺血、缺氧過程[8]。mir-210是在缺氧環(huán)境下表達(dá)水平較穩(wěn)定的miRNA之一，位于人染色體11p15.5，其在促進(jìn)腦缺血后血管新生過程中發(fā)揮重要作用[9]。Wang等[10]研究發(fā)現(xiàn)，急性腦梗死患者血清mir-210表達(dá)水平明顯高于正常對照組，且血清mir-210表達(dá)水平可作為診斷急性腦梗死的有效指標(biāo)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)生DCI組患者血清mir-210水平遠(yuǎn)高于未發(fā)生DCI組患者，與Wang等[10]研究結(jié)果類似，提示血清mir-210水平升高可能與aSAH后DCI發(fā)生有關(guān)。且相關(guān)研究報(bào)道[11]，miRNA可作為HIF-1α的調(diào)節(jié)因子，在轉(zhuǎn)錄后水平HIF-1α的表達(dá)中具有重要調(diào)節(jié)作用。而HIF-1α位于人14號染色體q21-24區(qū)，通常在低氧環(huán)境中存在，其下游靶基因血管內(nèi)皮生長因子參與血管生成、細(xì)胞能量代謝等多個(gè)生理、病理過程[12]。研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α異常表達(dá)參與缺血、缺氧性疾病的發(fā)展過程[13]。陳錦艷等[14]研究報(bào)道，腦出血組大鼠血清HIF-1α水平遠(yuǎn)高于正常組大鼠。此外，郭異之等[15]研究發(fā)現(xiàn)，重型顱腦損傷預(yù)后不良患者血清HIF-1α水平明顯高于預(yù)后良好組患者，其水平變化可作為近期預(yù)后的早期預(yù)測指標(biāo)。本研究中，與未發(fā)生DCI組患者相比，發(fā)生DCI組患者血清HIF-1α水平明顯升高，與郭異之等[15]研究相似，提示血清HIF-1α水平升高可能參與aSAH后DCI發(fā)生。

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，aSAH患者動脈瘤位置、Hunt-Hess分級及Fisher分級情況均可能與DCI發(fā)生有關(guān)。Pearson檢驗(yàn)分析顯示，aSAH患者血清mir-210水平與HIF-1α水平呈正相關(guān)，提示血清mir-210、HIF-1α水平可能共同參與aSAH發(fā)生、發(fā)展，并可能在DCI發(fā)生中發(fā)揮重要作用。多因素Logistic回歸分析顯示，Hunt-Hess分級≥3級、Fisher分級≥3級及血清mir-210、HIF-1α高水平均是影響aSAH后DCI發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示除Hunt-Hess分級≥3級、Fisher分級≥3級因素外，臨床測定血清mir-210、HIF-1α水平可能有利于預(yù)測aSAH后DCI發(fā)生情況，對早期防治aSAH后DCI具有積極作用。此外，本研究ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清mir-210、HIF-1α水平預(yù)測aSAH后DCI發(fā)生的曲線下面積分別為0.879、0.822，提示兩者均可作為預(yù)測aSAH后DCI發(fā)生的指標(biāo)，但預(yù)測敏感度均較低，且特異度也不高，臨床單獨(dú)預(yù)測具有一定局限性。因此，本研究進(jìn)一步使用血清mir-210水平聯(lián)合HIF-1α水平預(yù)測aSAH后DCI發(fā)生情況，結(jié)果顯示曲線下面積為0.940，均高于兩者單獨(dú)預(yù)測，且特異度高達(dá)94.44%，提示血清mir-210、HIF-1α水平聯(lián)合預(yù)測aSAH后DCI發(fā)生的應(yīng)用價(jià)值高于兩者單獨(dú)使用。

綜上所述，本研究血清mir-210、HIF-1α水平升高可能與aSAH后DCI發(fā)生有關(guān)，檢測血清mir-210、HIF-1α水平有望作為評估aSAH后DCI發(fā)生的重要指標(biāo)，尤其是兩者聯(lián)合可能價(jià)值更高，臨床應(yīng)密切關(guān)注aSAH患者血清mir-210、HIF-1α水平變化，以期為早期防治DCI提供幫助。臨床上影響aSAH后DCI發(fā)生的因素較多，可能會影響本研究結(jié)果準(zhǔn)確性，應(yīng)擴(kuò)大樣本量繼續(xù)研究。