基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的赤芍治療動(dòng)脈粥樣硬化作用機(jī)制研究

王心意，鞠建慶，田園碩，樊懿萱，徐 浩

據(jù)《中國心血管報(bào)告2018》統(tǒng)計(jì)，以冠心病和腦卒中為代表的動(dòng)脈硬化性心血管疾病(ASCVD)死亡人數(shù)占我國居民疾病死亡構(gòu)成的40%以上，居各病因之首，以血管壁功能紊亂和粥樣斑塊為特征的動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是ASCVD的病理基礎(chǔ)[1]。中醫(yī)藥在防治AS中發(fā)揮著重要作用，其中清熱活血中藥赤芍(Paeoniae Rubra Radix)是具有抗AS作用的代表藥物之一。赤芍為毛茛科植物芍藥或川赤芍的干燥根。其味苦，性微寒，歸肝經(jīng)，《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》記載：“化瘀血，赤者較優(yōu)……為其能化毒熱之瘀血不使?jié)⒛撘病盵2]?，F(xiàn)代研究表明，赤芍具有抗凝、抗血栓、抗氧化、抗炎、抗內(nèi)毒素等多種藥理學(xué)作用[3]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，赤芍對家兔實(shí)驗(yàn)性AS病灶具有明顯的消退作用[4]。然而，其抗AS的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制尚不清楚。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是新興的藥物研究模式，從整體角度探索藥物與疾病之間的關(guān)聯(lián)性，強(qiáng)調(diào)從“單靶標(biāo)”向“網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)”研究模式轉(zhuǎn)變[5]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，對赤芍治療AS的活性成分和其信號通路進(jìn)行預(yù)測分析，為進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供思路和依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 赤芍活性化合物及靶標(biāo)蛋白的篩選 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(TCMSP，http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)[6]，以“chishao”為關(guān)鍵詞檢索赤芍中的化學(xué)成分，篩選出赤芍化合物中符合口服生物利用度 (OB)[7]≥30%和生物活性分子的類藥性(DL)[8]≥0.18的化學(xué)成分作為活性成分。同樣基于 TCMSP 平臺，通過檢索獲得赤芍中活性成分所作用的靶標(biāo)。

1.2 疾病靶點(diǎn)的篩選 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫(http://www.genecards.org/)、OMIM數(shù)據(jù)庫 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)，以“atherosclerosis”為關(guān)鍵詞檢索已報(bào)道的與AS相關(guān)的基因，去除重復(fù)基因和假陽性基因。將獲得的基因與赤芍有效成分作用的靶標(biāo)進(jìn)行比對取交集，得到赤芍治療AS的作用靶點(diǎn)用于后續(xù)的研究。

1.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 為了進(jìn)一步了解赤芍靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)在蛋白水平上的作用機(jī)制，以STRING平臺(https://string-db.org)構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)[9-10]，獲取蛋白互作關(guān)系。其中，物種設(shè)為“homo sapiens”(人類)，最低相互作用閾值設(shè)為中等置信度0.4“medium confidence”，其余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置。以網(wǎng)絡(luò)中的各靶基因的“節(jié)點(diǎn)連接度(Degree)”為指標(biāo)，通過 Degree的測算篩選出網(wǎng)絡(luò)中的核心蛋白質(zhì)靶標(biāo)。

1.4 作用靶點(diǎn)類型歸屬 DisGeNET數(shù)據(jù)庫(http://www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu)是包含與人類疾病相關(guān)的基因和變體最完整的數(shù)據(jù)庫之一，可通過輸入基因獲得與該基因相關(guān)的疾病信息[11]。在該數(shù)據(jù)庫中選擇基因進(jìn)行檢索，依次輸入赤芍治療AS的作用靶點(diǎn)，獲取作用靶點(diǎn)類型。

1.5 赤芍-活性成分-抗AS作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將篩選之后赤芍治療AS的有效活性成分和作用靶點(diǎn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入 Cytoscape 3.7.1 軟件，構(gòu)建赤芍-活性成分-抗AS作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。Cytoscape的核心架構(gòu)是網(wǎng)絡(luò)，每個(gè)節(jié)點(diǎn)(node)是基因、蛋白質(zhì)或分子，節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間的連接(edge)代表這些生物分子之間的相互作用，節(jié)點(diǎn)的度值(degree)代表網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)相連的數(shù)目，度值越大，這個(gè)靶點(diǎn)越有可能成為化合物的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。

1.6 基因本體論(gene ontology，GO)和KEGG富集分析 將赤芍治療AS的靶基因?qū)隡etascape數(shù)據(jù)庫(http://metascape.org)進(jìn)行基因富集分析。Metascape是一種有效且高效的工具，旨在提供全面的基因列表注釋和分析資源[12]。以P<0.01作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的篩選條件，設(shè)置min overlap=3，Min Enrichment=1.5，對獲取的靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集分析。

2 結(jié) 果

2.1 赤芍活性成分篩選及候選化合物靶點(diǎn)預(yù)測 經(jīng)過TCMSP平臺檢索，獲得赤芍的化合物119個(gè)。設(shè)定OB≥30% 和 DL≥0.18，篩選出活性化合物29個(gè)，基本信息見表1。將這些活性化合物在TCMSP數(shù)據(jù)庫平臺逐一進(jìn)行比對，得到了這些活性化合物作用的靶點(diǎn)共41個(gè)。

表1 赤芍中29個(gè)活性化合物的基本信息

2.2 AS疾病靶點(diǎn)收集 基于GeneCards與OMIM數(shù)據(jù)庫共收集AS相關(guān)靶點(diǎn)基因，挖掘并刪除重復(fù)靶點(diǎn)，共收集到AS疾病相關(guān)靶點(diǎn)3 812個(gè)。將上述篩選出來的中藥中具有潛在作用的靶點(diǎn)基因和疾病靶點(diǎn)基因進(jìn)行匹配映射并在線繪制韋恩圖，獲得共同靶點(diǎn)基因36個(gè)。詳見圖1。

圖1 赤芍活性成分-抗AS作用靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 赤芍靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 將屬于赤芍的36個(gè)靶點(diǎn)在STRING平臺構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)模型，見圖2。并將得到的交集靶點(diǎn)信息進(jìn)行基因名和Uniprot ID的標(biāo)準(zhǔn)化，具體信息見表2。圖2包含36個(gè)節(jié)點(diǎn)(其中隱藏2個(gè)游離節(jié)點(diǎn))、157條邊，平均Degree為8.72。分別計(jì)算網(wǎng)絡(luò)圖中每個(gè)靶點(diǎn)的Degree，采用R包“ggplot2”繪制了Degree最大的前30個(gè)靶點(diǎn)的柱狀圖，見圖3。得到14個(gè)重要的AS相關(guān)蛋白質(zhì)靶點(diǎn)，分別為IL6、ESR1、VEGFA、FOS、CASP3、AR、RELA、CYCS、PGR、HIF1A、CASP8、CASP9、AHR、CCNB1等基因(Degree≥10)。

圖2 AS與赤芍共有PPI網(wǎng)絡(luò)

表2 赤芍抗AS作用靶點(diǎn)

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)

2.4 作用靶點(diǎn)類型歸屬 將34個(gè)作用靶點(diǎn)依次導(dǎo)入DisGeNET數(shù)據(jù)庫，獲得相應(yīng)的蛋白類型，見表3。結(jié)果表明，赤芍治療AS過程中涉及信號分子、轉(zhuǎn)錄因子、酶(氧化還原酶、水解酶、蛋白酶、激酶、轉(zhuǎn)移酶)、酶調(diào)節(jié)劑、受體等物質(zhì)。

表3 赤芍活性成分治療AS作用靶點(diǎn)分類

2.5 中藥-活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 通過Cytoscape 3.7.1軟件建立赤芍-活性成分-抗AS靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，見圖4。共有50個(gè)節(jié)點(diǎn)(1個(gè)疾病節(jié)點(diǎn)，1個(gè)藥物節(jié)點(diǎn)，12個(gè)化合物節(jié)點(diǎn)、36個(gè)基因節(jié)點(diǎn))和113條邊，其中12個(gè)綠色節(jié)點(diǎn)代表了赤芍的活性成分，36個(gè)藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表了抗AS靶點(diǎn)，113條邊代表了化學(xué)成分與AS靶點(diǎn)的相互作用。該網(wǎng)絡(luò)中，每個(gè)化合物平均與5.42個(gè)靶點(diǎn)相互作用，每個(gè)靶點(diǎn)平均與1.81個(gè)化合物相互作用，因此，赤芍的活性成分中存在1個(gè)化合物與多個(gè)靶點(diǎn)之間的相互作用，同時(shí)也存在不同化合物共同作用于同一個(gè)靶點(diǎn)的現(xiàn)象，這體現(xiàn)了中藥多成分與多靶點(diǎn)之間共同作用的機(jī)制。結(jié)果表明，赤芍的29個(gè)潛在活性成分中，與作用靶點(diǎn)直接相連的成分有12個(gè)，為赤芍治療AS的活性成分。包括黃芩素、β-谷甾醇、鞣花酸、豆甾醇、(+)-兒茶素、Spinasterol、谷甾醇、(2R，3R)-4-methoxyl-distylin、campest-5-en-3beta-ol、油酸乙酯、stigmast-7-en-3-ol、芍藥苷。

圖4 赤芍-活性成分-抗AS靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 GO和KEGG富集分析 Metascape中GO功能富集分析得到 GO 條目146個(gè)(P<0.05)，其中生物過程(biological process，BP)條目73個(gè)，分子功能(cellular component，CC)條目15個(gè)，細(xì)胞組成(molecular function，MF)相關(guān)的條目58個(gè)。詳見圖5。GO富集分析結(jié)果顯示，生物過程主要包括對類固醇激素的反應(yīng)、對有毒物質(zhì)的反應(yīng)、細(xì)胞對脂質(zhì)的反應(yīng)、細(xì)胞對有機(jī)環(huán)狀化合物的反應(yīng)、細(xì)胞對激素刺激的反應(yīng)；細(xì)胞成分主要包括核染色質(zhì)、核染色體部分、核染色體、染色質(zhì)、質(zhì)膜蛋白復(fù)合物、細(xì)胞溶質(zhì)部分突觸前膜、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物等；分子功能主要包括轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ近端啟動(dòng)子序列特異性DNA結(jié)合、近端啟動(dòng)子序列特異性DNA結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ調(diào)節(jié)區(qū)DNA結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活活性，RNA聚合酶Ⅱ特異性、參與凋亡信號通路的半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性等，涉及細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑。KEGG信號通路富集中靶點(diǎn)數(shù)量前20的信號通路主要包括細(xì)胞凋亡、白介素-17(IL-17)信號通路、流體剪切應(yīng)力(FSS)與AS、缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)信號通路、Th17細(xì)胞分化、腫瘤壞死因子(TNF)信號通路、甲狀腺激素信號通路、p53信號通路、Toll樣受體(TLR4)信號通路、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)-Akt信號通路等。詳見圖6。

圖5 赤芍抗AS靶點(diǎn)的GO分析

圖6 赤芍靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析

3 討 論

根據(jù)專家共識，AS的主要證候包括痰瘀互結(jié)證、氣陰兩虛證、氣虛血瘀證和氣滯血瘀證[13]。赤芍具有清熱涼血、散瘀鎮(zhèn)痛之功效，是治療AS有潛力的藥物。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究，有助于系統(tǒng)全面闡釋赤芍治療AS的作用機(jī)制，為臨床治療AS提供新的思路。

本研究通過構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)得到赤芍中12個(gè)活性成分，且部分成分的有效性已被證實(shí)。有研究表明，芍藥苷抑制β抑制蛋白2抗體的表達(dá)，改善G蛋白偶聯(lián)受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的過度脫敏，從而降低炎癥因子水平[14]。黃芩素可以明顯降低組織中丙二醛(MDA)的含量，提高超氧化物歧化酶(SOD)活性，從而降低高脂血癥性脂肪肝大鼠血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)水平[15]。此外，黃芩素可以通過降低氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)對心肌細(xì)胞起到保護(hù)作用[16]。β-谷甾醇可降低高血脂大鼠血清TC、TG，抑制脂質(zhì)過氧化，起到預(yù)防AS的作用[17]。鞣花酸通過對氧磷酸內(nèi)酯酶防止低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)過氧化及抑制高脂飲食大鼠的攝食量，防止AS[18-19]。豆甾醇具有強(qiáng)大的抗氧化、降血脂、抗炎、抗腫瘤、降血糖及甲狀腺抑制等作用[20]。兒茶素可以抗AS，與其降脂、抗氧化有關(guān)[21]。本研究通過匹配中藥靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)，獲得赤芍治療AS的36個(gè)靶點(diǎn)基因。蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析顯示，Degree≥10的節(jié)點(diǎn)包括IL6、ESR1、VEGFA、FOS、CASP3、AR、RELA、CYCS、PGR、HIF1A、CASP8、CASP9、AHR、CCNB1。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，IL6促進(jìn)早期AS病變的發(fā)展[22]。ESR1是雌激素對脈管系統(tǒng)的AS具有保護(hù)作用的重要介質(zhì)。一項(xiàng)回顧性研究提示，ESR1基因變異可能與AS風(fēng)險(xiǎn)增高有關(guān)[23]。有研究發(fā)現(xiàn)，小鼠AS斑塊中血管VEGFA表達(dá)與新血管形成顯著減少有關(guān)，提示VEGFA具有抗AS作用[24]。FOS基因被認(rèn)為是AS進(jìn)展和嚴(yán)重程度的因素之一，且新發(fā)現(xiàn)認(rèn)為其是冠狀動(dòng)脈疾病中煙草發(fā)揮毒性的新途徑[25]。Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9是凋亡蛋白酶，在AS斑塊中表達(dá)[26]。Liu等[27]發(fā)現(xiàn)AR在相對早期AS中占有重要地位，而減少AR的表達(dá)與更廣泛的AS相關(guān)。Akhta等[28]發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)通過觸發(fā)miR-19a介導(dǎo)的CXCL1表達(dá)和單核細(xì)胞黏附促進(jìn)AS，并提出抑制內(nèi)皮HIF-1α/miR-19a途徑可能是抗AS的治療選擇。Wu等[29]研究表明，AHR的激活可以誘導(dǎo)血管炎癥并促進(jìn)Apo-E小鼠AS形成。RELA、CYCS、PGR、CCNB1等與AS的相關(guān)性研究尚少。

富集分析和靶點(diǎn)歸屬分析結(jié)果表明，赤芍抗AS涉及細(xì)胞過程、代謝過程等多個(gè)生物過程，有信號分子、轉(zhuǎn)錄因子、受體、蛋白和酶、酶調(diào)節(jié)劑、受體等多種物質(zhì)參與，過程較復(fù)雜。KEGG分析顯示以上成分作用的靶標(biāo)顯著富集于細(xì)胞凋亡、IL-17信號通路、FSS與AS、HIF-1信號通路、Th17細(xì)胞分化、TNF信號通路、甲狀腺激素信號通路、p53信號通路、TLR4信號通路、PI3K-Akt信號通路等多個(gè)通路。目前有較多證據(jù)表明，細(xì)胞凋亡，尤其是巨噬細(xì)胞凋亡，發(fā)生在AS的各個(gè)階段[30]。有研究證實(shí)，選擇性抑制PI3K-Akt信號通路能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬，減少斑塊巨噬細(xì)胞的浸潤，抑制炎癥反應(yīng)從而穩(wěn)定AS易損斑塊[31]。而PI3K-Akt能直接或間接地影響p53等抑癌基因的表達(dá)從而調(diào)控細(xì)胞存活[32]。Th17由CD4T淋巴細(xì)胞分化而來，主要分泌IL-17。隨著AS方面研究的深入，IL-17和Th17都被發(fā)現(xiàn)與AS的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但二者在疾病發(fā)展和斑塊穩(wěn)定性中作用的結(jié)果尚無一致定論[33-34]。既往認(rèn)為白細(xì)胞介素-17A(IL-17A)會(huì)促AS形成[35]。但近年來有研究得出相反的結(jié)論，認(rèn)為IL-17A表達(dá)缺陷可促進(jìn)粥樣斑塊進(jìn)展[36]。FSS由于其脈動(dòng)的性質(zhì)和血液流動(dòng)，其數(shù)值并不穩(wěn)定。有研究發(fā)現(xiàn)頻率諧波的劇烈變化可促使AS的發(fā)生，表明內(nèi)皮細(xì)胞能夠感知和響應(yīng)FSS的變化[37]。HIF-1是異二聚體蛋白，是低氧環(huán)境中細(xì)胞反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子之一，通過作用于內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的細(xì)胞特異性反應(yīng)在AS的發(fā)展中起關(guān)鍵作用。有研究提出通過HIF-1表達(dá)/活化的信號通路可以對治療AS發(fā)揮巨大作用[38]。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是一種炎癥標(biāo)志物，由單核巨噬細(xì)胞分泌。有研究表明，TNF-α能通過刺激血管平滑肌細(xì)胞的遷移，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附因子、炎癥因子，促進(jìn)AS的發(fā)生與發(fā)展[39-40]。馬淑慧[41]通過分子機(jī)制研究，發(fā)現(xiàn)赤芍主要成分芍藥苷對血管內(nèi)皮細(xì)胞腫瘤壞死因子受體1(TNFR1)的介導(dǎo)信號的抑制作用是赤芍發(fā)揮活血化瘀、抗AS的重要作用機(jī)制之一，這個(gè)發(fā)現(xiàn)與本研究得出的結(jié)果也一致。目前甲狀腺激素與AS相關(guān)性尚未明確，相關(guān)研究提示，促甲狀腺激素可能是AS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[42]。Michelsen等[43]證實(shí)了TLR4的遺傳缺陷與ApoE-/-小鼠的主動(dòng)脈斑塊面積減少有關(guān)，表明TLR4信號傳導(dǎo)與AS有密切聯(lián)系。

4 小 結(jié)

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析赤芍抗AS的作用機(jī)制，赤芍通過調(diào)控相應(yīng)的細(xì)胞凋亡、IL-17信號通路、FSS與AS、HIF-1信號通路等發(fā)揮治療作用。本研究相關(guān)通路的分析與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致，表明活性成分與靶點(diǎn)的可靠性。因此，赤芍中12個(gè)活性成分通過調(diào)控34個(gè)靶點(diǎn)，共同發(fā)揮抗AS的作用，體現(xiàn)了赤芍多成分、多靶點(diǎn)、多途徑治療的特點(diǎn)，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法也體現(xiàn)了中醫(yī)藥的整體觀與系統(tǒng)性，為中醫(yī)藥治療多因素導(dǎo)致的復(fù)雜疾病提供了新的途徑。