桔梗乙醇提取物的抑菌活性研究

周蘭華，張海悅（長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130012）

桔梗乙醇提取物的抑菌活性研究

周蘭華，張海悅*
（長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130012）

摘要：對(duì)桔梗95%乙醇提取物做體外抑菌試驗(yàn)，測(cè)試該提取物對(duì)受試菌的最低抑菌濃度，考察溫度、pH、紫外照射時(shí)間對(duì)抑菌活性的影響，運(yùn)用系統(tǒng)預(yù)試驗(yàn)分析醇提物的化學(xué)成分。在7種受試菌中，桔梗醇提物對(duì)變形桿菌的抑制作用最強(qiáng)，大腸桿菌次之，兩者的最低抑菌濃度均為125 mg/mL。桔梗乙醇提取物對(duì)細(xì)菌的抑菌作用要強(qiáng)于真菌，而對(duì)革蘭氏陰性菌的抑菌效果強(qiáng)于革蘭氏陽性菌。醇提物對(duì)溫度和紫外光具有良好的穩(wěn)定性，pH在4～6時(shí)，有良好的抑菌作用。預(yù)試驗(yàn)表明桔梗醇提物的活性成分可能有皂苷、三萜類、多酚、黃酮等。

關(guān)鍵詞：桔梗；乙醇提取物；抑菌活性

桔梗Platycodon grandiflorus（Jacq.）A.DC.為桔梗科（Campanuaceae）桔梗屬（Platycodon）植物，廣泛生長(zhǎng)于中國、朝鮮半島、日本和西伯利亞東部，是我國藥食同源的植物之一。桔梗性平味苦、辛，歸肺經(jīng)，具有化痰止咳、宣暢肺氣、祛痰排膿之功效，可用于治療外感咳嗽、咽喉腫痛、肺癰吐痰等癥[1]。大量研究表明，桔梗富含皂苷、多糖、黃酮、多酚、甾體、萜類等成分，并含有十多種氨基酸及鎂、鐵、鋅等多種微量元素[2]?，F(xiàn)代藥理研究顯示，桔梗具有保肝、抗炎、抗腫瘤、抗氧化、降血脂、降血糖、調(diào)節(jié)免疫等功效[3]。

近年來，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)桔?；瘜W(xué)成分、藥理作用等方面做了大量的研究，尤其在對(duì)桔梗皂苷和桔梗多糖方面的研究[4-7]，取得了很大成就。但是對(duì)桔梗提取物抑菌活性方面的研究卻鮮有報(bào)道。李娜證明了桔梗多糖抑制真菌的能力強(qiáng)于抑制細(xì)菌的能力[8]。

目前，使用于食品工業(yè)中的防腐劑大多數(shù)是化學(xué)防腐劑，其安全性、穩(wěn)定性備受消費(fèi)者質(zhì)疑，因此開發(fā)安全、高效的植物天然防腐劑是食品防腐研究的熱點(diǎn)。本研究用桔梗95%乙醇提取物對(duì)食品中常見腐敗菌的抑菌活性進(jìn)行探討，研究了提取物抑菌活性的穩(wěn)定性，旨在為新型天然防腐劑的開發(fā)以及桔梗植物資源的綜合利用提供理論參考。

1　材料與儀器

1.1材料

1.1.1原料

桔梗：吉林長(zhǎng)春。由東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院鑒定為桔梗（Platycodon grandiflorus）的干燥根莖。

1.1.2供試菌種

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、變形桿菌（Proteusbacillus vulgaris）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）、青霉（Penicillium）、黑曲霉菌（Aspergillus niger）：由長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2儀器

DZKW-S-8電熱恒溫水浴鍋：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；RE52-98旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；AL204電子天平：梅特勒-托利儀器（上海）有限公司；pHS-3C型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)：上海偉業(yè)儀器廠；BCN-1360型生物潔凈工作臺(tái)：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；SANYO MLS-3750型高壓滅菌鍋：SANYO Electric Co.，Ltd.；HPX-9082數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司。

1.3試劑

乙醇、氯化鈉、瓊脂、葡萄糖均為分析純；牛肉膏、蛋白胨均為生物試劑：購自于北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

2　方法

2.1培養(yǎng)基[9]

2.1.1牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的制備

牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂15 g～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4，121℃高壓滅菌30 min。

2.1.2馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基的制備

馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g～20 g，蒸餾水1 000mL，自然pH，121℃高壓滅菌30 min。

在配制液體培養(yǎng)基時(shí)，采用以上培養(yǎng)基配方，不加瓊脂即可。

2.2菌懸液的制備

將供試菌經(jīng)斜面活化后，用接種環(huán)挑取1環(huán)～3環(huán)于滅菌后裝有25 mL液體培養(yǎng)基的三角瓶里，置生化培養(yǎng)箱里，細(xì)菌37℃培養(yǎng)18 h～24 h，真菌28℃培養(yǎng)48 h～72 h后，制成含菌數(shù)約108cfu/mL菌懸液。

2.3桔梗乙醇提取物的制備

稱取20 g桔梗粉末，加入500 mL乙醇（95%），在60℃恒溫水浴鍋中回流提取3 h，過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至無醇味后，加入蒸餾水定容至20 mL，則桔梗醇提物濃度為1.0 g/mL，即每毫升提取物中含有原料桔梗1.0 g。本文中涉及的桔梗醇提物濃度均按此定義。

2.4抑菌試驗(yàn)——濾紙片法

取固體培養(yǎng)基25 mL加入到滅過菌的培養(yǎng)基內(nèi)，待固體培養(yǎng)基凝固之后加入1.0 mL供試菌液均勻涂布。將桔梗醇提物溶液用0.22 μm微孔濾膜過濾，把滅菌后的濾紙片（直徑為9 mm）放在其中浸泡30 min，取出濾紙片在無菌條件下自然風(fēng)干，取經(jīng)上述處理的濾紙片貼于培養(yǎng)皿表面，每個(gè)培養(yǎng)皿放4片濾紙。其中，3張為浸過提取液的濾紙，其余一張濾紙為浸過無菌蒸餾水的空白對(duì)照。細(xì)菌于37℃培養(yǎng)24 h、真菌于28℃培養(yǎng)48 h后，觀察并測(cè)定抑菌圈直徑大小，做3次平行試驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

2.5最低抑菌濃度（MIC）——試管稀釋法

用無菌蒸餾水按兩倍稀釋法配制500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.63 mg/mL 6個(gè)不同濃度提取液系列。將配制好的液體培養(yǎng)基按每試管4.0 mL分裝，121℃濕熱滅菌30 min，待冷卻后，準(zhǔn)確吸取1.0 mL上述6個(gè)系列試液，加入到液體培養(yǎng)基試管中，即得到6個(gè)不同濃度的提取液系列培養(yǎng)基。每一系列培養(yǎng)基接種一種菌，菌液體積為1.0 mL，每個(gè)濃度做3次平行實(shí)驗(yàn)，另取一列以1.0 mL無菌蒸餾水代替菌液做空白對(duì)照，置于37℃下恒溫培養(yǎng)，每隔兩小時(shí)觀察生長(zhǎng)情況。將提取液的接種系列和不接種任何試驗(yàn)菌的空白系列相對(duì)照，兩者透明度相同的最低濃度即為提取液的最低抑菌濃度（MIC）[10]。

2.6醇提物抑菌活性的穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.6.1溫度對(duì)桔梗醇提物抑菌活性的影響

將直徑為9 mm的濾紙片放在小三角瓶中經(jīng)121℃30 min濕熱滅菌，分別移取10 mL醇提物于6個(gè)上述處理過的小三角瓶中，在20、40、60、80、100、121℃條件下各處理30 min。以變形桿菌和大腸桿菌為指示菌，用濾紙片法測(cè)定各組抑菌圈的直徑，結(jié)果取平均值，重復(fù)該操作1次。

2.6.2pH對(duì)桔梗醇提物抑菌活性的影響

分別移取10 mL醇提物于6個(gè)滅菌后的小三角瓶中，用1.0 mol/L的HCl和NaOH配制成pH為4、5、6、7、8、9的系列溶液，放入直徑為9 mm經(jīng)121℃30 min濕熱滅菌后的濾紙片，浸泡30 min。以變形桿菌和大腸桿菌為指示菌，用濾紙片法測(cè)定各組抑菌圈的直徑，結(jié)果取平均值，重復(fù)該操作1次。

2.6.3紫外照射時(shí)間對(duì)桔梗醇提物抑菌活性的影響

分別移取10 mL醇提物于5個(gè)含有濾紙片并滅菌后的小三角瓶中，放置在無菌超凈臺(tái)中，紫外燈分別照射15、30、45、60 min，以不經(jīng)紫外照射（即照射時(shí)間為0 min）為對(duì)照組。以變形桿菌和大腸桿菌為指示菌，用濾紙片法測(cè)定各組抑菌圈的直徑，結(jié)果取平均值，重復(fù)該操作1次。

2.7桔梗乙醇提取物抑菌活性成分的初步分析

通過對(duì)醇提物進(jìn)行化學(xué)成分系統(tǒng)預(yù)試驗(yàn)，對(duì)具有抑菌效果的桔梗醇提物中可能含有的有效成分進(jìn)行測(cè)定。

3　結(jié)果

3.1抑菌試驗(yàn)結(jié)果

抑菌試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 桔梗醇提物的抑菌活性Table 1　The antibacterial activity of ethanol extract from Platycodon grandiflorum

通過比較抑菌圈直徑的大小可以看出，當(dāng)桔梗醇提物的濃度為1.0 g/mL時(shí)，桔梗醇提物對(duì)青霉和黑曲霉無明顯抑菌作用，而對(duì)其余5種受試細(xì)菌表現(xiàn)出良好的抑菌作用，尤其是對(duì)變形桿菌的抑菌作用最強(qiáng)，大腸桿菌次之。此外，醇提物對(duì)革蘭氏陰性菌的抑菌效果要強(qiáng)于其對(duì)革蘭氏陽性菌的抑菌效果。

3.2最低抑菌濃度（MIC）

試管稀釋法測(cè)定桔梗醇提物最低抑菌濃度的結(jié)果如表2所示。

表2　桔梗乙醇提取物的最低抑菌濃度Table 2　The minimum inhibitory concentration of ethanol extract from Platycodon grandiflorum

將各樣品試管與對(duì)照試管相比較，以試管內(nèi)液體培養(yǎng)基的渾濁度一致來判定是否長(zhǎng)菌。表2結(jié)果表明：隨著桔梗醇提物濃度的增加，對(duì)細(xì)菌的抑菌能力增加。桔梗醇提物對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、嗜熱鏈球菌的最低抑菌濃度均為250 mg/mL；對(duì)變形桿菌和大腸桿菌的最低抑菌濃度均為125 mg/mL。

3.3溫度對(duì)桔梗醇提物抑菌活性的影響

溫度對(duì)桔梗醇提物抑菌活性的影響如圖1所示。

圖1　溫度對(duì)桔梗醇提物抑菌活性的影響Fig.1　The effect of temperature on antibacterial activity of ethanol extract from Platycodon grandiflorum

從圖1可以看出，在121℃范圍內(nèi)，溫度對(duì)桔梗醇提物抑菌效果無影響，桔梗醇提物經(jīng)不同溫度處理后仍然能保持原有的抑菌活性。說明該抑菌物質(zhì)的結(jié)構(gòu)未遭到破壞，即該抑菌物質(zhì)對(duì)溫度的抵抗性較高，具有很好的熱穩(wěn)定性。

3.4pH對(duì)桔梗醇提物抑菌活性的影響

pH對(duì)桔梗醇提物抑菌活性的影響如圖2所示。

圖2　pH對(duì)桔梗醇提物抑菌活性的影響Fig.2　The effect of pH on antibacterial activity of ethanol extract from Platycodon grandiflorum

由圖2可知，pH對(duì)桔梗醇提物的抑菌能力影響很大。在pH為4～6之間時(shí)，酸堿度對(duì)抑菌活性的影響不大，但當(dāng)pH偏中性或堿性時(shí)，抑菌效果顯著下降甚至沒有效果。原因可能是醇提物經(jīng)NaOH溶液處理之后，其中的抑菌成分被破壞而失去抑菌活性。

3.5紫外照射時(shí)間對(duì)桔梗醇提物抑菌活性的影響

紫外照射時(shí)間對(duì)桔梗醇提物抑菌活性的影響如圖3所示。

圖3　紫外照射時(shí)間對(duì)桔梗醇提物抑菌活性的影響Fig.3　The effect of UV irradiation time on antibacterial activity of ethanol extract from Platycodon grandiflorum

從圖3可知，紫外照射一個(gè)小時(shí)之內(nèi)，照射時(shí)間對(duì)醇提物的抑菌活性無明顯影響，說明該抑菌物質(zhì)對(duì)紫外光具有很好的穩(wěn)定性。

3.6桔梗乙醇提取物抑菌活性成分的初步分析

桔梗醇提物抑菌活性成分的初步分析結(jié)果見表3。

表3　桔梗乙醇提取物系統(tǒng)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3　The results of pre-experiments of ethanol extract from Platycodon grandiflorum

根據(jù)系統(tǒng)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果可知，醇提物中可能含有皂苷、三萜類、多酚、甾體、黃酮、油脂以及有機(jī)酸。

4　結(jié)論

本試驗(yàn)證明了桔梗95%乙醇提取物具有較好的抑菌作用，且對(duì)細(xì)菌的抑菌能力要強(qiáng)于真菌，抑菌活性的穩(wěn)定性良好，具備開發(fā)成天然防腐劑的優(yōu)勢(shì)。預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果可以指導(dǎo)桔?；瘜W(xué)成分的深入分析，然而，對(duì)桔梗醇提物抑菌活性成分的分離、結(jié)構(gòu)鑒定、抑菌活性的機(jī)理等更多相關(guān)的內(nèi)容還需要進(jìn)一步研究。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.23.009

收稿日期：2014-03-15

作者簡(jiǎn)介：周蘭華（1990—），女（漢），在讀碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物提取。

*通信作者：張海悅（1967—），女（漢），教授，博士，研究方向：食品及農(nóng)副產(chǎn)品深加工。

Antibacterial Activity of Ethanol Extract from Platycodon grandiflorum

ZHOU Lan-hua，ZHANG Hai-yue*
（School of Chemistry and Life Science，Changchun University of Technology，Changchun 130012，Jilin，China）

Abstract：It was studied on the in vitro antibacterial activity of 95%ethanol extract from Platycodon grandiflorum，and determined the minimum inhibitory concentration against the bacteria tested.At the same time，the effect of temperature，pH，UV irradiation time on antibacterial activity were tested，the chemical composition of alcohol extract was analyzed by pre-experiments as well.Among the seven bacteria tested，Bacillus proteus was the most inhibitive one，then Escherichia coli.The minimum inhibitory concentrations of both were 125 mg/mL.Platycodon grandiflorum ethanol extract had better antibacterial activity on bacteria than on fungus，and the antimicrobial effect on Gram negative bacteria was better than on Gram positive bacteria.The ethanol extract had good stability to temperature and ultraviolet light.When pH was between 4 and 6，the antimicrobial effect showed good.Pre-experiments showed that the active component of Platycodon grandiflorum might be triterpenoid，polyphenols，flavonoids.

Key words：Platycodon grandiflorus；ethanol extract；antibacterial activity