一種新的油桐黑斑病病原及其生物學(xué)特性研究

徐紅梅 鄧先珍 杜洋文

摘 要：本文報(bào)道了湖北省武陵山區(qū)一種新的油桐黑斑病病原真菌，并對(duì)其開(kāi)展了生物學(xué)特性和對(duì)農(nóng)藥敏感性研究。從油桐黑斑病發(fā)病葉片中分離到的JF-4菌株生長(zhǎng)迅速，致病力強(qiáng)。菌株培養(yǎng)性狀、產(chǎn)孢特征結(jié)合核糖體rDNA基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）和RNA聚合酶次大亞基基因（RPB2）分析表明該菌為小新殼梭孢Neofusicoccum parvum。該病原菌對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力較強(qiáng)，對(duì)5種供試殺菌劑敏感性不同，43%戊唑醇懸乳劑抑菌率最高。

關(guān)鍵詞：油桐黑斑病;病原鑒定;生物學(xué)特性;毒力測(cè)定

中圖分類號(hào)：S763.1 ??文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ??文章編號(hào)：1004-3020（2020）01-0027-04

Abstract：A newly identified pathogen of Mycosphaerella aleuritidis and its biological characteristics was studied in this paper.Isolated from diseased leaves，the pathogen of JF-4 grew rapidly with strong pathogenicity.Based on cultural character，sporogenous structure，ITS with RPB2 analysis，Neofusicoccum parvum was the newly identified pathogen.The mycelia could grow under different environment with good acclimatization.Toxicity of 5 fungicides to the pathogen was tested in the lab. Different fungicides inhibited the growth of mycelia at different levels，and 43% tebuconazole SE showed best effect.

Key words：Mycosphaerella aleuritidis;pathogen identification;biological characteristics;toxicity test

油桐是大戟科油桐屬植物統(tǒng)稱，是中國(guó)特有的油料樹(shù)種，其種子中含有的桐油不僅是重要的工業(yè)油料，也是生物柴油的主要原料之一。油桐在中國(guó)亞熱帶地區(qū)的丘陵地帶種植范圍較廣。武陵山區(qū)自然條件適于種植油桐，歷史上一直是中國(guó)桐油中心產(chǎn)區(qū)。油桐產(chǎn)業(yè)是該區(qū)重要的特色資源產(chǎn)業(yè)[1]。

良好的撫育管理措施是保證油桐豐產(chǎn)、高產(chǎn)的前提條件，病蟲(chóng)害防治是油桐栽培管理的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2]。油桐黑斑病又稱為角斑病，果實(shí)黑疤病，能引起嚴(yán)重的枯果和落果。在油桐產(chǎn)區(qū)發(fā)生普遍，該病主要發(fā)生在葉片、葉柄和果實(shí)上，病葉初期出現(xiàn)褐色小點(diǎn)，逐漸擴(kuò)大成圓斑或因受葉脈的限制而成多角形的病斑，多數(shù)病斑可以相互聯(lián)合成大塊斑。病害嚴(yán)重者，全株枯死。過(guò)去認(rèn)為，該病主要由油桐尾孢菌Cercospora aleuritidis Miyake.侵染所致[3-4]。

作者對(duì)湖北省武陵山區(qū)油桐病蟲(chóng)害進(jìn)行了調(diào)查，其中油桐黑斑病發(fā)生十分嚴(yán)重。本文對(duì)該地一株新的油桐黑斑病病原進(jìn)行了鑒定和生物學(xué)特性研究，以期為病害發(fā)生規(guī)律及防治研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病原物

黑斑病發(fā)病葉片源自湖北省來(lái)鳳縣百福司鎮(zhèn)沙道灣村油桐林，供試JF-4菌株采用組織分離法分離并純化后保存于4 ℃冰箱備用。

1.2 致病性測(cè)定

采用離體接種法測(cè)試JF-4菌株的致病性。油桐健康葉片源自湖北省林科院九峰油桐示范林。剪取健康葉片，放入保鮮盒中，取長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿的菌絲塊緊貼在葉片表面，對(duì)照加無(wú)菌培養(yǎng)基塊，25 ℃恒溫培養(yǎng)，保持90%相對(duì)濕度。48 h后觀察葉片發(fā)病情況，并記錄發(fā)病癥狀。將發(fā)病葉片進(jìn)行組織分離，獲得再分離菌株，與原接種菌株進(jìn)行對(duì)比。依照柯赫氏法則判定菌株是否為致病菌

1.3 病原菌的培養(yǎng)性狀、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)觀察與分子測(cè)序

將JF-4菌株接種在PDA平板上，25 ℃培養(yǎng)3 d，觀察培養(yǎng)性狀和特征，主要包括生長(zhǎng)速度、菌絲顏色、是否有氣生菌絲、菌落結(jié)構(gòu)及色素產(chǎn)生情況等;觀察病斑組織的解剖特征并將菌株接種在水瓊脂添加無(wú)菌松針（馬尾松）培養(yǎng)基，25 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)25 d左右，近紫外光照射（誘導(dǎo)產(chǎn)孢）。挑取載孢體，在光學(xué)顯微鏡下觀察、記錄產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和孢子形態(tài)特征。

病原物基因組提取采用微波爐裂解法。核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS1-5.8S-ITS2）基因擴(kuò)增采用通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[5]，RNA聚合酶次大亞基基因（RPB2）擴(kuò)增采用引物RPB2bot6F（5′-GGTAGCGACGTCACTCCC-3′）和RPB2

bot7R（5′-GGATGGATCTCGCAATGCG-3′）[6]（PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性1 min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，36次循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。病原物ITS和RPB基因序列進(jìn)行BLAST比對(duì)后獲得多個(gè)匹配的序列記錄，用CLUSTAL X軟件包進(jìn)行多序列比對(duì)。

1.4 病原菌生物學(xué)特性研究

1.4.1 溫度對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

將供試菌株在25 ℃恒溫箱中預(yù)培養(yǎng)3 d，于菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌餅，接種于PDA平板上，分別置于10、15、20、25、30、35、40 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)3次，4 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

1.4.2 pH值對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

用1 mol·L-1 HCL和1 mol·L-1 NaOH調(diào)節(jié)PDA培養(yǎng)基的pH值至4、5、6、7、8、9（酸度計(jì)測(cè)量pH值）。按1.4.1所述方法分別接種菌餅于不同pH值PDA培養(yǎng)基，置于25℃恒溫箱中培養(yǎng)。每個(gè)處理重復(fù)3次，4 d后測(cè)量菌落直徑。

1.4.3 碳源和氮源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

以查彼培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基（硝酸鉀2.0 g，磷酸氫鉀1.0 g，氯化鉀0.5 g，硫酸鎂0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，蒸餾水1 000 mL）。供試碳源為葡萄糖30.0 g，甘露醇27.6 g，可溶性淀粉24.55 g，麥芽糖27.25 g，蔗糖25.9 g（用量以葡萄糖30.0 g含碳量10.9 g為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行換算），滅菌后接種，以無(wú)碳源處理作為對(duì)照。每個(gè)處理重復(fù)3次，置于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，4 d后測(cè)量菌落直徑。

供試氮源為硝酸鉀10.0 g，尿素3.0 g，硫酸銨6.6 g，甘氨酸7.5 g，硝酸銨4.0 g（用量以硝酸鉀10.0 g的含氮量1.4 g為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行換算），滅菌后接種，以無(wú)氮源處理作為對(duì)照。每個(gè)處理重復(fù)3次，置于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，4 d后測(cè)量菌落直徑。

1.4.4 不同殺菌劑對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的毒力測(cè)定

在無(wú)菌操作條件下，將供試殺菌劑分別用無(wú)菌水稀釋成所需濃度10倍于供試濃度的5個(gè)系列濃度梯度的藥液。向培養(yǎng)皿中加入藥液1 mL，再加入9 mL冷卻至50～60 ℃的PDA培養(yǎng)基，充分混勻，最終配制成所需濃度的含藥培養(yǎng)基，以不含藥劑的培養(yǎng)基作為對(duì)照，每個(gè)濃度重復(fù)4次。供試藥劑和使用濃度見(jiàn)表1。

采用生長(zhǎng)速率法對(duì)菌絲生長(zhǎng)進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定[7]：在每個(gè)含藥劑平板中央接入一塊直徑為5 mm的菌餅，25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)4 d后測(cè)量菌落直徑，根據(jù)以下公式計(jì)算各藥劑濃度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率。所得數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，求出各藥劑毒力回歸方程、EC50及相關(guān)系數(shù)。

抑菌率（%）=對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑對(duì)照菌落直徑-菌病直徑×100

2 結(jié)果和分析

2.1 病原物致病性

葉片接種JF-4菌株3 d后出現(xiàn)褐色病斑，病斑形狀不規(guī)則，在25 ℃恒溫和高濕環(huán)境下，病斑擴(kuò)展迅速，15 d后部分供試嫩葉整葉褐化壞死。發(fā)病葉片組織分離后所得再分離菌株與接種菌株特征一致，符合柯赫氏法則。

JF-4菌株引起葉片產(chǎn)生黑斑病，為油桐黑斑病病原真菌。

2.2 病原物的培養(yǎng)性狀、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)觀察及分子鑒定

JF-4菌株在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速，氣生菌絲發(fā)達(dá);生長(zhǎng)初期菌落呈白色，后逐步轉(zhuǎn)為灰色。在野外病株和人工接種病斑組織中觀察不到該菌有性或無(wú)性繁殖結(jié)構(gòu)，而該菌在誘導(dǎo)培養(yǎng)（含無(wú)菌松針的水瓊脂+近紫外照射）條件下可產(chǎn)生子實(shí)體。分生孢子器梨形或球形，分生孢子單胞，近橢圓形。

PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳結(jié)果顯示，ITS和RPB2基因片段大小均在500bp左右。BLAST序列對(duì)比表明這兩個(gè)基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中多個(gè)Neofusicoccum菌株的相似性達(dá)到100%。

結(jié)合JF-4菌株培養(yǎng)性狀、產(chǎn)孢特征以及核糖體rDNA基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）和RNA聚合酶次大亞基基因（RPB2）序列分析[8-10]，將該病原菌鑒定為小新殼梭孢N.parvum，該菌是葡萄座腔菌科Botryosphaeriaceae菌物的無(wú)性型。

2.3 病原菌生物學(xué)特性

2.3.1 溫度對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

該菌在10～40 ℃溫度范圍均能生長(zhǎng)，25～30 ℃菌絲生長(zhǎng)較快，其中25 ℃為最適生長(zhǎng)溫度，培養(yǎng)4 d后菌落平均直徑為85.0 mm。高溫和低溫均不利于菌絲生長(zhǎng)。當(dāng)溫度低于10 ℃或者高于40 ℃時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度緩慢（見(jiàn)圖1）。

2.3.2 pH值對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

該菌在pH值4～9范圍內(nèi)生長(zhǎng)速度均較快，培養(yǎng)4d后菌落平均直徑為54.3～85.0 mm;其中pH值為7是最適生長(zhǎng)pH值，菌落平均直徑為85 mm，pH值8～9時(shí)菌落生長(zhǎng)速度稍微降低，菌落直徑為72.7～80 mm（見(jiàn)圖2）。由此可見(jiàn)，該菌對(duì)環(huán)境酸堿性適應(yīng)性強(qiáng)。

2.3.3 碳源和氮源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

該菌在供試5種碳源培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng)，菌落生長(zhǎng)速度遠(yuǎn)大于缺碳對(duì)照，在葡萄糖培養(yǎng)基上菌落直徑最大，培養(yǎng)4 d后菌落平均直徑為85.0 mm，其次是蔗糖、淀粉和麥芽糖、甘露醇。總體說(shuō)來(lái)，該菌利用環(huán)境中碳源能力很強(qiáng)。不同碳源培養(yǎng)基上菌落培養(yǎng)性狀差異不大，葡萄糖為該菌菌絲生長(zhǎng)的最佳碳源（見(jiàn)圖3）。

從圖4可以看出，該菌在供試5種氮源培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng)，菌落生長(zhǎng)速度遠(yuǎn)大于缺氮對(duì)照，在硫酸銨培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度最快，培養(yǎng)4 d后菌落菌落平均直徑達(dá)到85.0 mm，其次是尿素、硝酸銨、硝酸鉀和甘氨酸?？傮w說(shuō)來(lái)，該菌利用環(huán)境中氮源能力很強(qiáng)。不同氮源培養(yǎng)基上菌落培養(yǎng)性狀差異不大，硫酸銨為該菌菌絲生長(zhǎng)的最佳氮碳源。

2.3.4 不同殺菌劑對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果表明，供試5種殺菌劑對(duì)該病原菌毒力不同，從大到小依次為：43%戊唑醇懸乳劑﹥50%多菌靈超微可濕性粉劑﹥12.5%氟環(huán)唑懸乳劑﹥70%代森錳鋅可濕性粉劑﹥75%百菌清可濕性粉劑。43%戊唑醇懸乳劑對(duì)該病原菌的抑制效果最好，75%百菌清可濕性粉劑效果最差，各殺菌劑對(duì)油桐枯萎病的室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

3 結(jié)論與討論

本文報(bào)道了湖北省武陵山區(qū)一種新的油桐黑斑病病原真菌，并開(kāi)展了病原菌生物學(xué)特性和對(duì)農(nóng)藥敏感性等研究，為研究該病害的發(fā)生規(guī)律和防治提供理論依據(jù)。

從油桐黑斑病發(fā)病材料中分離到的JF-4菌株生長(zhǎng)迅速，致病力強(qiáng)。培養(yǎng)性狀、產(chǎn)孢特征結(jié)合核糖體rDNA基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）和RNA聚合酶次大亞基基因（RPB2）分析表明該菌為小新殼梭孢。

生物學(xué)特性研究表明，該病原菌在10～40 ℃溫度范圍均能生長(zhǎng)，最適生溫度為25～30 ℃;病原菌在pH值4～9范圍內(nèi)生長(zhǎng)速度均較快，表明病原菌對(duì)環(huán)境酸堿度適應(yīng)能力較強(qiáng)，在酸性、中性和堿性土壤條件下均能快速生長(zhǎng)。該病原菌能利用環(huán)境中的多種碳源和氮源，葡萄糖和硫酸銨分別為該菌菌絲生長(zhǎng)的最佳碳源和氮源，在生產(chǎn)管理中應(yīng)注意合理施肥。總體說(shuō)來(lái)，該油桐黑斑病病原菌對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力很強(qiáng)，生長(zhǎng)迅速，該生物學(xué)特性為其快速侵染和傳播奠定了基礎(chǔ)。

室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果表明，供試5種殺菌劑對(duì)該病原菌毒力不同。毒力較強(qiáng)殺菌劑為：43%戊唑醇懸乳劑、50%多菌靈超微可濕性粉劑和12.5%氟環(huán)唑懸乳劑;毒力較差殺菌劑為：75%百菌清可濕性粉劑和70%代森錳鋅可濕性粉劑。生產(chǎn)過(guò)程中可以參考本研究結(jié)果，選擇43%戊唑醇懸乳劑等殺菌劑防治此類油桐黑斑病。

參 考 文 獻(xiàn)

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（責(zé)任編輯：唐 嵐）