圓錐角膜的遺傳學(xué)研究進(jìn)展

徐麗妍，楊凱麗，任勝衛(wèi)

圓錐角膜是一種以角膜擴(kuò)張、中央?yún)^(qū)角膜基質(zhì)變薄、呈圓錐形突起及高度不規(guī)則近視散光為特征的角膜擴(kuò)張性疾病。前期經(jīng)家系研究、雙生子研究等多種方法證實(shí)，該病的發(fā)生有明顯的遺傳傾向。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，圓錐角膜的遺傳學(xué)研究也逐漸增多，主要包含核基因組、線粒體基因組及表觀遺傳學(xué)相關(guān)研究，本文就圓錐角膜相關(guān)遺傳學(xué)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

0 引言

圓錐角膜(keratoconus，KC)是一種以角膜擴(kuò)張、中央?yún)^(qū)角膜基質(zhì)變薄、呈圓錐狀突起為特征的角膜病變[1]，該病通常于青春期發(fā)病，病變呈進(jìn)行性發(fā)展，晚期視力嚴(yán)重下降，需行角膜移植手術(shù)進(jìn)行治療[2]。目前的研究表明，圓錐角膜的發(fā)生有明顯的遺傳傾向，6%～10%的圓錐角膜患者有陽性家族史，患者一級(jí)親屬的發(fā)病率顯著高于一般人群發(fā)病率[3]。此外，Tuft等[4]在18對(duì)雙生子圓錐角膜遺傳一致性的研究中發(fā)現(xiàn)，同卵雙胞胎較異卵雙胞胎有更高的遺傳一致性，Kriszt等[5]通過家系共分離分析表明圓錐角膜是一種復(fù)雜的非孟德爾遺傳病，上述研究均表明圓錐角膜的發(fā)生與遺傳因素密切相關(guān)。

近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的研究集中于疾病發(fā)生的分子遺傳機(jī)制。目前，圓錐角膜相關(guān)的分子遺傳學(xué)研究逐漸成為了國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，該病的遺傳學(xué)研究主要集中于核基因組相關(guān)研究，而線粒體基因組及表觀遺傳相關(guān)研究也相繼被報(bào)道。本文就圓錐角膜相關(guān)的核基因組、線粒體基因組及表觀遺傳研究進(jìn)行綜述，以期深入了解圓錐角膜的遺傳學(xué)基礎(chǔ)及發(fā)病機(jī)制，為進(jìn)一步制定有效的預(yù)防措施及治療方案提供新的思路。

1 核基因組相關(guān)研究

核基因組包含了基因組絕大多數(shù)的遺傳信息，其序列變異對(duì)疾病的發(fā)生有重要影響。研究表明圓錐角膜的發(fā)生有明顯的遺傳異質(zhì)性，多種基因?qū)υ摬〉陌l(fā)生均有重要作用。目前，圓錐角膜核基因組相關(guān)的遺傳研究方法主要有全基因組關(guān)聯(lián)分析、連鎖分析及候選基因分析三種，篩查該病發(fā)生的遺傳易感基因及位點(diǎn)可為探討該病發(fā)生的遺傳分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1.1全基因組關(guān)聯(lián)分析 全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome wide association study，GWAS)是指在全基因組層面上，以基因組中數(shù)以百萬計(jì)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)為分子遺傳標(biāo)記，尋找與疾病相關(guān)的遺傳因素的研究方法。該方法在多種疾病的遺傳研究中普遍應(yīng)用，目前有關(guān)圓錐角膜的GWAS研究已經(jīng)確定了RAB3-GTP酶激動(dòng)蛋白基因(RAB3 GTPase activating protein catalytic subunit 1，RAB3GAP1)、肝細(xì)胞生長因子基因(hepatocyte growth factor，HGF)、賴氨酸氧化酶基因(lysyl oxidase，LOX)與圓錐角膜的發(fā)生密切相關(guān)。

Li等[6]通過對(duì)高加索人群的研究發(fā)現(xiàn)RAB3GAP1基因rs4954218位點(diǎn)與圓錐角膜的發(fā)生密切相關(guān)，提示RAB3GAP1基因參與了該病的發(fā)生過程。RAB3GAP1基因編碼RAB3-GTP酶激活蛋白催化亞基，RAB3-GTP酶是Ca2+介導(dǎo)激素和神經(jīng)遞質(zhì)胞外分泌的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶。隨后，許多研究者試圖驗(yàn)證該位點(diǎn)與圓錐角膜發(fā)生之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)在不同人群中其結(jié)果也不盡相同。在捷克人群中，RAB3GAP1基因rs4954218位點(diǎn)與圓錐角膜的發(fā)生明顯相關(guān)[7]，而在中國漢族人群中無明顯相關(guān)性[8]，不同澳大利亞人群中的研究結(jié)果也不一致[9-10]。

表1 連鎖分析定位的圓錐角膜相關(guān)基因座

染色體定位研究人群基因1p36.23,8q13.1～q21.11澳大利亞人2p24歐洲人、阿拉伯人、非洲人2q13～q14.3,20p13～p12.2厄瓜多爾人3p14～q13意大利人3p西班牙人4q歐美、西班牙、亞洲人等5q14.3～q21.1高加索人CAST5q21.2意大利人5q31歐美、西班牙、亞洲人等5q31.1～q35.3厄瓜多爾人5q32～33意大利人5p歐美、西班牙、亞洲人等9q21.13意大利人9q22.2意大利人9p西班牙人9q34歐美、西班牙、亞洲人等11p歐美、西班牙、亞洲人等12p歐美、西班牙、亞洲人等13q32厄瓜多爾人DOCK914q歐美、西班牙、亞洲人等14q11.2意大利人14q24.3多種族人群15q15.1意大利人15q22.32～24.2北愛爾蘭人miR-18416q22.3～q23.1芬蘭人16q23.1意大利人17p13巴基斯坦人17q西班牙人18p11.31意大利人20q12澳大利亞人

Burdon等[11]對(duì)澳大利亞及美國人群進(jìn)行了多階段的GWAS研究，結(jié)合tag SNPs位點(diǎn)的基因分型分析及Meta分析發(fā)現(xiàn)，HGF基因rs3735520(P=9.9×10-7)及rs17501108(P=9.9×10-5)位點(diǎn)與該人群中圓錐角膜發(fā)生的關(guān)聯(lián)度最高。HGF是由間葉細(xì)胞產(chǎn)生和分泌的一種抗纖維化因子，在維持角膜上皮細(xì)胞正常功能過程中發(fā)揮著重要作用。Dudakova等[12]在捷克人群的研究中證實(shí)了rs3735520位點(diǎn)與圓錐角膜發(fā)生的相關(guān)性，而在中國人群及澳大利亞另一人群的研究中并未發(fā)現(xiàn)其相關(guān)性[8-9]。

Bykhovskaya等[13]通過對(duì)高加索人群的GWAS研究發(fā)現(xiàn)，LOX基因第四內(nèi)含子區(qū)的rs10519694及rs2956540位點(diǎn)與圓錐角膜的發(fā)生有較強(qiáng)的相關(guān)性，進(jìn)一步對(duì)該基因外顯子區(qū)域檢測發(fā)現(xiàn)rs1800449及rs2288393位點(diǎn)與圓錐角膜的發(fā)生具有相關(guān)性。LOX是一種銅依賴的胺氧化酶，參與介導(dǎo)角膜基質(zhì)中的膠原纖維和彈性纖維形成共價(jià)鍵，對(duì)維持角膜生物力學(xué)特性有重要作用。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，rs2956540位點(diǎn)是歐洲人群及中國漢族人群圓錐角膜發(fā)生的遺傳風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)[12，14]，rs1800449位點(diǎn)A等位基因是伊朗人群圓錐角膜發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)等位基因[15]。

1.2連鎖分析 連鎖分析是利用連鎖不平衡的原理探討致病基因與某些遺傳標(biāo)記關(guān)系的一種研究方法，該方法通常在單基因疾病的遺傳研究中廣泛應(yīng)用，復(fù)雜疾病的研究中也有部分應(yīng)用。目前，圓錐角膜的遺傳方式并不明確，盡管大多數(shù)圓錐角膜表現(xiàn)為散發(fā)，也有研究報(bào)道家族性遺傳在圓錐角膜發(fā)病過程中有一定作用。家族性的圓錐角膜多數(shù)表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳，少部分屬于常染色體隱性遺傳。連鎖分析在圓錐角膜發(fā)病機(jī)制的研究中也有應(yīng)用，并且已經(jīng)定位了許多與該病發(fā)生相關(guān)的基因及位點(diǎn)(表1[16-17])。

Tang等[18]通過全基因組連鎖分析把1個(gè)圓錐角膜家系的致病基因位點(diǎn)定位于5q14.3～q21.1。Li等[19]通過連鎖分析發(fā)現(xiàn)定位于該區(qū)域的鈣蛋白酶抑制蛋白基因(calpastatin，CAST)rs4434401位點(diǎn)與圓錐角膜的發(fā)生密切相關(guān)。CAST是一種內(nèi)源性的鈣蛋白酶抑制劑，其與鈣蛋白酶、鈣蛋白酶激活蛋白構(gòu)成的鈣蛋白酶系統(tǒng)在維持人體多個(gè)組織正常功能過程中有重要作用，研究表明鈣蛋白酶系統(tǒng)對(duì)維持角膜上皮細(xì)胞更新及創(chuàng)傷愈合過程具有重要作用[20]。圓錐角膜患者的角膜上皮發(fā)生了改變，CAST可能通過修復(fù)損傷的角膜上皮從而參與圓錐角膜的發(fā)生發(fā)展過程。

Gajecka等[21]通過對(duì)18個(gè)厄瓜多爾家系多位點(diǎn)的連鎖分析及單倍型分析將圓錐角膜發(fā)生的致病基因位點(diǎn)定位于13q32，深入探究發(fā)現(xiàn)定位于該區(qū)域DOCK9(dedicator of cytokinesis 9)基因的c.2262 A>C突變可能是其中一家系圓錐角膜發(fā)生的突變基因位點(diǎn)[22]。DOCK9蛋白可特異性激活細(xì)胞周期分裂蛋白42，參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)DOCK9基因c.2262 A>C突變會(huì)引起該蛋白剪接異常，導(dǎo)致蛋白翻譯提前終止，使得DOCK9蛋白的功能域受損，從而改變了其生物學(xué)特性，影響圓錐角膜的發(fā)生過程[23]。

Hughes等[24]通過全基因組連鎖分析對(duì)1個(gè)患有嚴(yán)重圓錐角膜和早發(fā)性前極性白內(nèi)障家系進(jìn)行了調(diào)查研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該家系的致病位點(diǎn)定位于15q22～q25，進(jìn)一步探究發(fā)現(xiàn)miR-184基因c.57 C>U突變是該家系的致病突變位點(diǎn)。Bykhovskaya等[25]在對(duì)1個(gè)患有先天性白內(nèi)障和早發(fā)型重度圓錐角膜的家系調(diào)查研究中發(fā)現(xiàn)miR-184基因c.57 C>U突變在此家系中同樣存在。miRNA-184是一個(gè)長為22nt的內(nèi)源性非編碼RNA，在角膜及晶狀體中呈特異性高表達(dá)。研究表明miR-184種子區(qū)c.57 C>U突變與家族性圓錐角膜的發(fā)生密切相關(guān)，而該突變在散發(fā)性圓錐角膜患者中未見報(bào)道，這提示該突變與合并其他眼部異常的圓錐角膜病例更為相關(guān)。

1.3候選基因分析 候選基因分析是指根據(jù)對(duì)某種疾病或性狀已有的了解，直接從已知或潛在的基因中挑選出可能對(duì)該疾病或性狀有影響的候選基因，進(jìn)而對(duì)其進(jìn)行分析的一種研究策略，通常采用病例-對(duì)照設(shè)計(jì)的研究方法進(jìn)行。目前，圓錐角膜的發(fā)病機(jī)制尚不明確，候選基因分析為其病因?qū)W研究提供了新的思路。圓錐角膜的候選基因主要包含視覺系統(tǒng)同源框1基因(visual system homebox 1，VSX1)、鋅指蛋白469基因(zinc finger protein 469，ZNF469)、膠原相關(guān)基因、氧化應(yīng)激相關(guān)基因及炎癥相關(guān)基因等。

VSX1基因是一個(gè)調(diào)節(jié)細(xì)胞正常分化及發(fā)育的主控基因，在視網(wǎng)膜視錐雙極細(xì)胞的分化及正常功能的維持中具有重要作用，研究發(fā)現(xiàn)該基因存在多種突變與圓錐角膜的發(fā)生密切相關(guān)[26]。De Silva等[27]在巴西人群中發(fā)現(xiàn)VSX1基因上L68H、R131S、D105E三個(gè)非同義突變位點(diǎn)，Guan等[28]對(duì)中國散發(fā)圓錐角膜患者的研究發(fā)現(xiàn)了VSX1基因R131P雜合性突變，Bardak等[29]在土耳其人群中發(fā)現(xiàn)了VSX1基因上D144N、D295Y兩個(gè)錯(cuò)義突變位點(diǎn)，Saee-Rad等[30]通過對(duì)伊朗人群的研究發(fā)現(xiàn)VSX1基因R166W及H244R突變可能是該人群的致病突變位點(diǎn)，De Bonis等[31]在意大利人群中的突變篩查發(fā)現(xiàn)VSX1基因G239R 突變與該人群圓錐角膜的發(fā)生具有相關(guān)性，Paliwal等[32]在印度人群中發(fā)現(xiàn)VSX1基因上Q175H突變位點(diǎn)影響了圓錐角膜的發(fā)生，Mok等[33]對(duì)韓國人群的研究發(fā)現(xiàn)了VSX1基因N151S、G160V兩個(gè)突變位點(diǎn)。此外，一些研究也表明VSX1基因突變與圓錐角膜的發(fā)生無相關(guān)性[8，34]，這可能是由于突變在不同種族人群中的分布不同所造成的，需要進(jìn)一步探討。

ZNF469基因編碼一種鋅指蛋白，該蛋白與體內(nèi)某些膠原有低度同源性，在膠原纖維形成過程中發(fā)揮作用。Vincent等[35]在新西蘭人群中的研究發(fā)現(xiàn)ZNF469基因突變可能參與該人群圓錐角膜發(fā)生的病理形成過程。Yildiz等[36]通過對(duì)土耳其人群的突變篩查研究發(fā)現(xiàn)，ZNF469基因編碼區(qū)的P873T、Q2188H突變可能與該病的發(fā)生密切相關(guān)。Yu等[37]在中國漢族人群散發(fā)圓錐角膜患者中發(fā)現(xiàn)了ZNF469基因上的7個(gè)突變位點(diǎn)，表明該基因參與了中國漢族人群圓錐角膜的發(fā)生過程。Zhang等[38]研究發(fā)現(xiàn)ZNF469基因的突變篩查可能對(duì)預(yù)防交聯(lián)術(shù)后并發(fā)癥有一定的指導(dǎo)意義。

圓錐角膜的一個(gè)主要病理改變是角膜基質(zhì)變薄，其可能的原因是膠原數(shù)量減少或膠原纖維的結(jié)構(gòu)異常造成角膜機(jī)械抵抗力降低，從而導(dǎo)致角膜前凸變薄，因此，膠原相關(guān)基因被認(rèn)為可能與圓錐角膜的發(fā)生具有相關(guān)性。Saravani等[39]在伊朗人群中探討了COL4A3基因多態(tài)性與圓錐角膜發(fā)生的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rs55703767位點(diǎn)與該人群圓錐角膜的發(fā)病密切相關(guān)。Sargazi等[40]通過對(duì)伊朗人群COL4A4基因多態(tài)性的研究發(fā)現(xiàn)，rs2228557位點(diǎn)是該人群圓錐角膜發(fā)生的遺傳風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)。而在其他人群的研究中并未發(fā)現(xiàn)COL4A3、COL4A4基因與圓錐角膜發(fā)生的相關(guān)性[41-42]。研究表明，COL5A1基因改變與中央角膜厚度密切相關(guān)，Li等[43]研究表明COL5A1基因rs1536482、 rs7044529位點(diǎn)可能通過影響圓錐角膜患者的中央角膜厚度，從而參與了該病的發(fā)生過程。目前的研究尚未發(fā)現(xiàn)COL4A1、COL4A2、COL8A1及COL8A2基因與圓錐角膜發(fā)生相關(guān)[44-45]。

研究表明，圓錐角膜患者中存在較高水平的氧化應(yīng)激損傷，超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1，SOD1)是一種抗氧化酶，可參與角膜組織的氧化應(yīng)激損傷修復(fù)過程。Udar等[46]研究表明SOD1基因是圓錐角膜發(fā)生的一個(gè)候選基因，測序分析發(fā)現(xiàn)圓錐角膜患者中存在SOD1基因第二內(nèi)含子區(qū)7bp的缺失，進(jìn)一步探究發(fā)現(xiàn)該缺失可降低患者體內(nèi)SOD1的表達(dá)水平及活性，使得抵御氧化應(yīng)激的能力減弱，從而導(dǎo)致圓錐角膜的發(fā)生。然而，有關(guān)SOD1基因與圓錐角膜發(fā)生關(guān)系的其它研究中并未發(fā)現(xiàn)與該病相關(guān)的突變或位點(diǎn)[30-31，47]。

目前的研究表明，炎癥可能參與了圓錐角膜的病理形成過程[48]。Kim等[49]通過病例對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞介素1β基因(interleukin 1 beta，IL1B)啟動(dòng)子區(qū)rs1143627、rs16944位點(diǎn)與韓國人圓錐角膜的發(fā)生密切相關(guān)，Milami等[50]發(fā)現(xiàn)rs1143627、rs16944位點(diǎn)與日本人圓錐角膜發(fā)生具有相關(guān)性。Wang等[51]在中國漢族人群中的研究發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素1α基因(interleukin 1 alpha，IL1A)rs2071376位點(diǎn)、IL1B基因rs1143627、rs16944位點(diǎn)與該人群圓錐角膜的發(fā)生密切相關(guān)。Arbab等[52]通過對(duì)巴基斯坦人群的研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α基因啟動(dòng)子區(qū)rs1800629位點(diǎn)A等位基因增加了該人群圓錐角膜的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

2 線粒體基因組相關(guān)研究

線粒體是存在于真核生物細(xì)胞內(nèi)的一種半自主細(xì)胞器，處于新陳代謝和生物能量轉(zhuǎn)換的中心地位。線粒體DNA屬母系遺傳，其序列突變率極高，研究發(fā)現(xiàn)線粒體DNA突變對(duì)圓錐角膜的發(fā)生也有影響[53]。Pathak等[54]通過對(duì)印度人群線粒體復(fù)合體Ⅰ相關(guān)基因的突變篩查發(fā)現(xiàn)，圓錐角膜患者中存在較多的基因序列變異，增多的序列變異與活性氧(reactive oxygen species，ROS)的增加密切相關(guān)，ROS的增加引起了較多的氧化應(yīng)激損傷，從而導(dǎo)致圓錐角膜的發(fā)生。Abu-Amero等[55]在對(duì)沙特阿拉伯人線粒體基因組的測序分析中發(fā)現(xiàn)了10個(gè)線粒體突變位點(diǎn)，其中m.4218 T>A、m.11393 C>T、m.12504 G>A、m.14000 T>A突變位于線粒體復(fù)合體Ⅰ相關(guān)基因上，m.4381 A>G、m.5567 T>C、m.5664 A>G、m.12178 C>T、m.12308 A>G、m.12310 insA突變位于tRNA相關(guān)基因上，同時(shí)，該研究小組發(fā)現(xiàn)線粒體單倍群H及R增加了沙特阿拉伯人圓錐角膜的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[56]。Hao等[57]研究發(fā)現(xiàn)線粒體單倍群與中國漢族人群圓錐角膜的發(fā)生沒有相關(guān)性，而線粒體DNA的拷貝數(shù)與中國漢族人群圓錐角膜的發(fā)生密切相關(guān)。

3 表觀遺傳相關(guān)研究

表觀遺傳學(xué)是指在基因組DNA序列不發(fā)生改變的情況下，基因的表達(dá)發(fā)生了可遺傳的改變。其主要通過DNA甲基化、非編碼RNA調(diào)控、組蛋白修飾及染色質(zhì)重塑等形式調(diào)控基因的表達(dá)，從而影響疾病的發(fā)生發(fā)展過程。為了探討DNA甲基化在圓錐角膜發(fā)生中的作用，Kabza等[58]通過重亞硫酸氫鹽測序的方法對(duì)角膜組織樣本進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)許多圓錐角膜連鎖的位點(diǎn)均發(fā)生了甲基化水平的改變，進(jìn)一步探究發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因甲基化程度的改變可能影響了基因的表達(dá)，從而影響了圓錐角膜的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。Wang等[59]采用miRNA芯片對(duì)27例圓錐角膜上皮組織及26例對(duì)照進(jìn)行了測序分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-151a-3p、miR-138-5p、miR-146b-5p、miR-194-5p、miR-28-5p、miR-181a-2-3p在圓錐角膜上皮組織中表達(dá)下調(diào)。Khaled等[60]通過對(duì)10例圓錐角膜組織及8例對(duì)照的RNA測序分析發(fā)現(xiàn)，lnc-WNT4-2∶1、lnc-SCP2-2∶1、lnc-ALDH3A2-2∶1在圓錐角膜組織中表達(dá)上調(diào)，lnc-BLID-5∶1、MEG3在圓錐角膜組織中表達(dá)下調(diào)。然而，這些差異表達(dá)的非編碼RNA影響該病發(fā)生的具體機(jī)制尚不清楚，仍需深入探究。

4 小結(jié)

綜上所述，圓錐角膜是一種復(fù)雜的遺傳異質(zhì)性疾病，探討其發(fā)生的分子遺傳學(xué)機(jī)制可為研究該病的發(fā)病機(jī)制、診斷、治療及預(yù)后提供一定的幫助。目前，研究者通過全基因組關(guān)聯(lián)分析、全基因組連鎖分析、候選基因分析等方法已經(jīng)定位了核基因組中的一些與圓錐角膜發(fā)生相關(guān)的易感基因及位點(diǎn)，而線粒體基因組及表觀遺傳也發(fā)生了改變，但這些位點(diǎn)及改變影響疾病發(fā)生的病理機(jī)制尚不明確。因此，篩查圓錐角膜發(fā)生的分子遺傳學(xué)改變，深入探討其致病性病理機(jī)制可為該病的診斷及治療提供理論依據(jù)。