脂肪干細胞和血管內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)復合脫細胞基質(zhì)材料修復兔尿道缺損的實驗研究

石志康 張勝利 趙敏利 杜昆峰 李瀘平 張 謙 范應中

先天性尿道下裂、尿道損傷、尿道狹窄等是泌尿外科常見病，其有效解決辦法仍然依賴于外科手術治療，而尿道成形及重建術是其主要的治療方式。然而，對于長段尿道缺損、尿道狹窄及復雜型尿道損傷的患兒而言，術后出現(xiàn)尿瘺、尿道狹窄等并發(fā)癥的情況仍然較多[1]。隨著組織工程技術的發(fā)展，近年來，脂肪干細胞(adipose derived stem cell,ADSCs)和血管內(nèi)皮細胞(vascular endothelial cell,VEC)分別單獨或聯(lián)合支架材料用來修復尿道的研究報道逐漸增多，并取得了一定效果。本實驗擬構建ADSCs聯(lián)合VEC共培養(yǎng)復合支架材料，初步探討其在組織工程尿道重建中的應用，以期為今后尿道成形及重建術提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、實驗動物

收集新西蘭成年雄性大白兔50只，體重2.5～3.0 kg。由河南省動物實驗中心提供。

二、儀器與試劑

10%水合氯醛(鄭州大學第一附屬醫(yī)院試劑科)、優(yōu)質(zhì)胎牛血清、DMEM低糖培養(yǎng)基/MEM高糖培養(yǎng)基、PBS緩沖液、F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶、EDTA(Gibco公司，USA)、青霉素、鏈霉素(華北制藥集團有限公司)、硫酸慶大霉素(安陽九州藥業(yè)有限責任公司)、膠原酶Ⅰ(Sigma USA)、98%無水乙醇(上海化學試劑廠)、血管內(nèi)皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)鼠抗兔單抗、平滑肌肌動蛋白(a-SMA)鼠抗兔單克隆抗體(北京博奧森試劑公司)、超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)、一次性細胞培養(yǎng)瓶(Hyclone公司)、CO2細胞培養(yǎng)箱(SANYO,日本)、倒置顯微鏡(LEICA德國)、微量移液槍(Gilson,USA)、人真皮脫細胞基質(zhì)材料(清源偉業(yè)生物科技有限公司)。

三、方法

(一)細胞的分離培養(yǎng)

1. 脂肪干細胞(ADSCs)的分離培養(yǎng)：取1只雄性成年新西蘭白兔，右側腹股溝區(qū)備皮，10%水合氯醛(1 mL/kg)經(jīng)兔耳緣靜脈緩慢推注麻醉白兔，應用絡合碘及75%乙醇消毒右側腹股溝區(qū)。在無菌條件下取兔右側腹股溝區(qū)約1.5 cm×2.0 cm大小的皮膚，立即放入4℃低糖DMEM培養(yǎng)基中以作備用。嚴格縫合創(chuàng)面，每日給予2次青霉素針25萬單位肌肉注射，連續(xù)注射4 d。將取得的脂肪組織在超凈工作臺上經(jīng)過處理后，加入含有Ⅳ型膠原酶的DMEM，在37℃的條件下，通過震蕩消化45 min。然后采用等量含有10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液用來中和膠原酶組織，200目濾網(wǎng)過濾后，按照2 200 r/min離心15～20 min。將離心管底部細胞團接種到10%的低糖DMEM培養(yǎng)基的透氣培養(yǎng)瓶中。選擇37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。每2～3 d進行換液。倒置顯微鏡下觀察細胞情況，當原代細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底80%時進行細胞傳代培養(yǎng)至第三代。

2. 血管內(nèi)皮細胞的提取、培養(yǎng)及鑒定：取1只雄性成年新西蘭白兔無菌環(huán)境下獲取兔胸主動脈，將動脈管腔內(nèi)外用PBS緩沖液反復沖洗，目的是將附壁血細胞完全去除，筋膜和多余脂肪剪除后再將血管置入不含血清DMEM培養(yǎng)基器皿中，血管組織經(jīng)剪刀充分剪碎至約1 mm3大小，將其轉移至24孔細胞培養(yǎng)板中，放置于37℃培養(yǎng)箱，約4 h后，見組織塊充分緊貼于培養(yǎng)板，再加入含15%胎牛血清的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基于培養(yǎng)板中，然后將培養(yǎng)板放置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。24 h后將培養(yǎng)基完全更換，清除未貼壁的細胞及雜質(zhì)，以后每3 d將一半培養(yǎng)基更換為新鮮培養(yǎng)基。約10～14 d后，觀察細胞情況，鋪滿約90%培養(yǎng)瓶底后，用0.25%胰酶-0.02% EDTA 消化，按1 ∶2傳代培養(yǎng)，依次傳代培養(yǎng)4周。

3. ADSCs和VEC體外共培養(yǎng)：取第3代ADSCs，濃度2.5×104個/mL和培養(yǎng)4周VECs，濃度2.5×104個/mL，將ADSCs與VECs均勻混合后，按1 ∶1比例置入6孔板中進行接觸式共培養(yǎng)，每孔加入10%FBS的L-DMEM1.5 mL，每隔1天換液，置于37℃、5%CO2級飽和濕度培養(yǎng)箱中共同培養(yǎng)。倒置顯微鏡下分別于7 d、14 d觀察聯(lián)合細胞的形態(tài)變化。

(二)細胞與材料的復合

1. 材料的處理：ADSCs和VEC及二者共培養(yǎng)細胞接種前72 h，在無血清培養(yǎng)的6孔版中浸泡基質(zhì)材料，更換培養(yǎng)液時間為隔天1次。用移液槍在細胞種植前24 h將6孔板內(nèi)的培養(yǎng)液吸干，另外再將50 μL血清在材料兩側涂抹均勻后以作備用。

2. 細胞接種：將ADSCs及VEC二者共培養(yǎng)細胞用0.02%乙二胺四乙酸+0.25%胰蛋白酶常規(guī)消化后，經(jīng)過1 000 r/min離心5 min，加1 mL完全培養(yǎng)基制成細胞混懸液。在2 cm×2 cm基質(zhì)材料的黏膜一面均勻滴加制備好的細胞懸液100 μL，將其保存在37℃細胞培養(yǎng)箱4 h。對照組采取同樣的方法進行處理。

(三)建立實驗動物模型及分組

1. 建立實驗動物模型：將剩余48只實驗兔固定后于耳緣靜脈注入10%水合氯醛(/kg)進行麻醉。麻醉完成后，取平臥位，會陰區(qū)備皮后，常規(guī)消毒、鋪巾。經(jīng)尿道外口留置6號雙腔導尿管進行導尿，陰莖頭處縫牽引線固定尿管(圖1A)，配制慶大霉素鹽水經(jīng)尿管外口進行膀胱沖洗。尿管可作為兔子尿道支撐，用尖刀片沿陰莖腹側中段切開一長約3.0 cm切口，依次切開各層組織，將實驗所需局部尿道組織充分游離暴露，眼科剪剪除長約2.0 cm尿道，完成缺損尿道模型的制作(圖1B)。

2. 對實驗動物進行分組：采用隨機數(shù)字表法將上述48只體重2.0～2.5 kg新西蘭成年雄性兔分為4組，每組12只。無細胞對照組為單采用真皮脫細胞基質(zhì)材料修復組； ADSCs組為復合有ADSCs的脫細胞基質(zhì)材料修復組；VEC組為復合有VEC的脫細胞基質(zhì)材料修復組；ADSCs與VEC共培養(yǎng)組為復合有ADSCs和VEC二者共培養(yǎng)細胞的脫細胞基質(zhì)材料修復組。

圖1 動物模型制作及尿道手術 A：術前固定尿管； B：術前尿道缺損動物模型的制作； C：術后成形尿道外觀

Fig.1 Animal modeling and urethral operative pictures

(四)尿道修復的手術操作與術后管理

1. 尿道修復的手術方法：無細胞對照組將備用的脫細胞基質(zhì)材料包裹在尿管外表面，修剪邊緣使其呈管狀結構，然后用6-0可吸收縫線縫合材料邊緣。將人為形成的尿道缺損端與制成的管狀結構進行端端吻合并用6-0可吸收縫線進行縫合(圖1C)。檢查手術區(qū)未見明顯活動性出血后，將陰莖腹側皮下、皮膚組織依次間斷縫合。距尿道外口約1.0 cm處將尿管剪斷并用縫線將其固定于尿道外口處。為預防傷口感染，手術區(qū)域傷口用慶大霉素鹽水進行沖洗。ADSCs組將載有ADSCs的基質(zhì)材料與缺損尿道進行斷端吻合后用6-0可吸收縫線做縫合，其余手術步驟同無細胞對照組。VEC組將載有VEC的基質(zhì)材料與缺損尿道進行斷端吻合后用6-0可吸收縫線做縫合，其余手術步驟同無細胞對照組。ADSCs與VEC共培養(yǎng)組將載有ADSCs和VEC二者共培養(yǎng)細胞的基質(zhì)材料與缺損尿道進行斷端吻合后用6-0可吸收縫線做縫合，其余手術步驟同無細胞對照組。

2. 實驗動物的術后管理：術后每天給實驗動物肌肉注射2次50萬單位青霉素鈉針，手術傷口區(qū)域每日給予絡合碘進行局部消毒清洗，連續(xù)給予慶大霉素沖洗傷口，第14天時觀察尿管支撐管情況，并將其拔出。為避免局部傷口污染情況，需要及時清理動物的糞便及周圍其余雜物。

(五)術后主要觀察項目

1. 種子細胞及支架材料觀察：ADCSs、VEC及共培養(yǎng)細胞三者各自的形態(tài)學及其在培養(yǎng)過程中的生長特征情況。

2. 新生尿道標本的觀察：術后2、4、8周時對各組重建尿道進行觀察，分別從每組中取2只實驗動物切取其尿道標本后觀察尿道腔面情況。通過尿道標本截面的HE染色觀察尿道黏膜上皮再生情況，通過FⅧ、a-SMA免疫組化觀察血管內(nèi)皮細胞及尿道平滑肌細胞再生情況。各組平均血管數(shù)目/視野、平均平滑肌數(shù)目/視野可于術后8周時在顯微鏡下觀察，并比較各組間有無差別。

3. 術后相關并發(fā)癥的情況：對各組動物在術后8周時觀察實驗動物排尿情況。使用外力作用于動物下腹部促使其排尿，觀察有無尿瘺、尿道狹窄等并發(fā)癥發(fā)生。

四、統(tǒng)計學處理

本研究采用SPSS18.0進行統(tǒng)計學處理與分析，對于各組間并發(fā)癥發(fā)生率的比較采用χ2檢驗；對于各組尿道經(jīng)過VEGF及a-SMA免疫組化染色陽性指標數(shù)目等計量資料采用中位數(shù)和四分位數(shù)間距[M(P25～P75)]表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、ADSCs的形態(tài)及生長特征

ADSCs的原代細胞在培養(yǎng)時開始貼壁的時間較早，培養(yǎng)2.5 h時即開始貼壁；第2天可見貼壁細胞數(shù)量較多，以多角形或小梭形細胞居多，另外還有一些血細胞夾雜在兩者之間；第3天時進行換液，未貼壁的細胞被清除后，可見ADSCs存在許多呈多角形或長梭形的突起，其中一些區(qū)域可見簇狀生長；第4天細胞增殖較迅速，第6～7天時培養(yǎng)瓶底部幾乎被細胞鋪滿，需要進行傳代。經(jīng)傳代后脂肪干細胞增殖速度更快，80%培養(yǎng)瓶底面積在3～5 d時間內(nèi)即可被細胞鋪滿，細胞密度達到一定程度時，可見其呈現(xiàn)出漩渦狀、放射狀或平行狀，并且排列比較紊亂的情況很少見。第3代ADSCs可見均勻一致，類似于成纖維細胞樣形態(tài)。

二、VEC的形態(tài)及生長特征

原代內(nèi)皮細胞大約16 h開始貼壁，細胞最初分離時形態(tài)多為圓形或橢圓形，有著較強的立體感和折光性，呈小團聚集；7 d時可見細胞長滿單層，細胞排列較緊密，多角形特別顯著。

三、共培養(yǎng)細胞的形態(tài)及生長特征

ADSCs與VEC按1 ∶1進行共培養(yǎng)第1天時，細胞數(shù)量之間無明顯區(qū)別。第2天時，VEC細胞增長速度明顯增加，于1～3 d時細胞數(shù)量呈對數(shù)增長期，3 d后達到平臺期。ADSCs在1～5 d時增長速度較明顯，5 d時達到平臺期。ADSCs長梭形未發(fā)生明顯變化，且其體積較大；而VEC體積則較小，細胞性狀呈鵝卵石狀，細胞間生長相互影響，且未見明顯細胞排斥及吞噬情況的發(fā)生。共培養(yǎng)7 d時部分細胞仍保留原有的梭形，另外一部分細胞形態(tài)不同于前者，可呈多角形、巢樣分布(圖2A)，14 d時可見細胞間存在許多相互連接的突觸，并且部分細胞可融合成團塊狀(圖2B)。

圖2 共培養(yǎng)細胞鏡下觀 A：共培養(yǎng)7 d時細胞鏡下觀(200×)； B共培養(yǎng)14 d時細胞鏡下觀(400×)

Fig.2 Microscopic observation of cell co-culturing

四、尿道標本的大體觀及組織學觀察

術后1周：各實驗組尿道修復區(qū)域未完全愈合，無明顯傷口感染及切口處縫線脫落情況，尿道修復區(qū)域與周圍正常皮膚間的界限仍較明顯。術后4周：各實驗組尿道修復區(qū)域已基本愈合，局部縫線可見脫落，尿道修復區(qū)域與周圍正常皮膚趨向一致。術后4周、8周分別對各組兔子尿道行免疫組織化學染色分析(圖3,圖4)，可見ADSCs與VEC共培養(yǎng)組上皮血管內(nèi)皮細胞因子(VEGF)、平滑肌肌動蛋白(a-SMA)明顯多于無細胞對照組、ADSCs組、VEC組(表1)。

圖3 術后第4周尿道組織VEGF和a-SMA染色圖 A：術后第4周ADSCs組再造尿道VEGF因子免疫組化檢查(200×)； B：術后第4周VEC組再造尿道VEGF因子免疫組化檢查(200×)； C：術后第4周ADSCs與VEC共培養(yǎng)組再造尿道VEGF因子免疫組化檢查(200×)； D：術后第4周ADSCs組再造尿道a-SMA免疫組化檢查(200×)； E：術后第4周VEC組再造尿道a-SMA免疫組化檢查(200×)； F：術后第4周ADSCs與VEC共培養(yǎng)組再造尿道a-SMA免疫組化檢查(200×)

Fig.3 VEGF and a-SMA staining of urethral tissue at 4 weeks post-operation

圖4 術后第8周尿道組織VEGF和a-SMA染色圖 A：術后第8周ADSCs組再造尿道VEGF因子免疫組化檢查(200×)； B：術后第8周VEC組再造尿道VEGF因子免疫組化檢查(200×)； C：術后第8周ADSCs與VEC共培養(yǎng)組再造尿道VEGF因子免疫組化檢查(200×)； D：術后第8周ADSCs組再造尿道a-SMA免疫組化檢查(200×)； E：術后第8周VEC組再造尿道a-SMA免疫組化檢查(200×)； F：術后第8周ADSCs與VEC共培養(yǎng)組再造尿道a-SMA免疫組化檢查(200×)

Fig.4 VEGF and a-SMA staining of urethral tissue at 8 weeks post-operation

表1 術后第8周各組尿道經(jīng)過VEGF及a-SMA免疫組化染色陽性指標數(shù)目(個/HPE)[M,(P25,P75)]Table 1 Number of VEGF and a-SMA immunohistochemical staining positive indicators in urethra of each group at 8 weeks post-operation[M,(P25,P75)]分組VEGFa-SMA無細胞對照組9.00(7.25～11.75)10.50(8.00～13.00)ADSCs組12.00(10.25～13.75)15.00(13.00～17.75)VEC組16.50(14.25～18.00)18.00(16.25～19.00)ADSCs與VEC共培養(yǎng)組18.50(17.25～19.75)19.50(17.25～21.75)χ2值36.431.3P值<0.001<0.001 注 各組VEGF相比后發(fā)現(xiàn),無細胞對照組與VEC組、無細胞對照組與ADSCs與VEC共培養(yǎng)組、ADSCs組與ADSCs與VEC共培養(yǎng)組之間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.0083),無細胞對照組與AD-SCs組、ADSCs組與VEC組、VEC組與ADSCs與VEC共培養(yǎng)組之間比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.0083)。各組a-SMA相比后發(fā)現(xiàn),無細胞對照組與ADSCs組、無細胞對照組與VEC組、無細胞對照組與ADSCs與VEC共培養(yǎng)組、ADSCs組與ADSCs與VEC共培養(yǎng)組之間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.0083),ADSCs組與VEC組、VEC組與ADSCs與VEC共培養(yǎng)組之間比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.0083)

五、術后實驗動物的排尿情況

術后第8周通過人為使用外力作用于動物下腹部促使其排尿，評估尿道狹窄和尿瘺發(fā)生率情況。無細胞對照組動物出現(xiàn)并發(fā)癥9只(其中尿瘺6只，尿道狹窄3只)。ADSCs組、VEC組和ADSCs與VEC共培養(yǎng)組出現(xiàn)并發(fā)癥數(shù)量分別為5只(其中尿瘺3只，尿道狹窄2只)、4只(其中尿瘺3只，尿道狹窄1只)、2只(其中尿瘺2只)。并發(fā)癥的發(fā)生率ADSCs組41.7%(5/12)，VEC組33.3%(4/12)，ADSCs與VEC共培養(yǎng)組16.7%(2/12)，明顯低于無細胞對照組的75%(9/12)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=8.914，P<0.05)。進一步兩兩比較，無細胞對照組與ADSCs與VEC共培養(yǎng)組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.0083)。無細胞對照組與ADSCs組、無細胞對照組與VEC組、ADSCs組與VEC組、ADSCs組與ADSCs與VEC共培養(yǎng)組及VEC組與ADSCs與VEC共培養(yǎng)組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.0083),見表2。

表2 各組術后并發(fā)癥發(fā)生率比較[n(%)]Table 2 Comparing the incidence of postoperative complications in all groups[n(%)]分組有并發(fā)癥無并發(fā)癥χ2值P值無細胞對照組ADSCs組VEC組ADSCs與VEC共培養(yǎng)組9(75.0)5(41.7)4(33.3)2(16.7)3(25.0)7(58.3)8(66.7)10(83.3)8.9140.03

討 論

尿道下裂的發(fā)生隨著環(huán)境的變化及污染情況的加重而呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，其發(fā)病率在男性新生兒中可達到3/1 000，且重度尿道下裂所占比例較大[2]。由相關報道可知，在美國每年需要行尿道手術的患兒可達50 000余例[3]。對于復雜尿道損傷和尿道缺損較長的病例，獲得足夠的組織來進行尿道重建是該類手術成功的關鍵因素，這成為泌尿外科的難題之一[4]。為解決這一難題，目前采用較多的方法是將自體干細胞種植到脫細胞基質(zhì)上制成人工尿道，然后再進行尿道修復。到目前為止，研究者把可用的自身組織材料都做了嘗試，包括輸尿管、動靜脈、闌尾等管腔樣組織和包皮、頰黏膜、陰囊皮膚、口腔黏膜等上皮樣組織[5，6]。然而，此類方法存在缺點，其進行尿道重建是以損害自體其他部位組織為代價。

組織工程學的出現(xiàn)為尿道修復材料來源的難題提供了一種全新的解決思路[7]。組織工程的研究方法多種多樣，但其基本要素是不變的，包括： ①培養(yǎng)種子細胞； ②制備所需的支架材料； ③細胞與支架材料之間相互作用和構建功能性組織[8]。脂肪干細胞來源較廣泛、取材方便，并且給病人帶來的痛苦比較少。有研究發(fā)現(xiàn)在尿道修復時采用接種有種子細胞的基質(zhì)材料可以產(chǎn)生較為理想的效果，能夠降低尿瘺、尿道狹窄等并發(fā)癥的發(fā)生率[9]。脂肪干細胞來源較廣泛,取材方便,再生能力較強。隨著研究的不斷深入，ADSCs成功應用于尿道缺損修復,為組織工程在尿道修復重建中的應用積累了一定經(jīng)驗[10]。血管內(nèi)皮細胞是一種多功能細胞，位于血管內(nèi)壁。大量動物實驗及臨床資料表明，VEC在改善機體缺血部位和損傷部位的血供方面有著得天獨厚的優(yōu)勢[11]。另有研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長因子在促進內(nèi)皮細胞增殖和新生血管的增生方面發(fā)揮著重要作用，若其缺乏則有可能導致嚴重的血管畸形和缺失[12]。

共培養(yǎng)體系技術是將兩種細胞共同培養(yǎng)，其細胞可來源于不同組織，也可來源于同一組織，組織工程化尿道成功與否取決于新生組織血供情況，而血管內(nèi)皮細胞在這個過程中所起的作用比較關鍵。Peichev等[13]將間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSC)和內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)后觀察，發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細胞平滑肌肌動蛋白表達的高低程度與內(nèi)皮細胞之間有著緊密的聯(lián)系，與之接觸的內(nèi)皮細胞能促進其增加。脂肪干細胞和血管內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)首先在組織工程骨的研究中取得一定成功，并且積累了一定的經(jīng)驗。研究表明，血管內(nèi)皮細胞聯(lián)合培養(yǎng)除了使血管化速度提高之外，還能夠促進間充質(zhì)干細胞分化、增殖[14]。

尿道上皮細胞和平滑肌細胞作為一種成熟細胞，二者的再生能力均欠佳，所以一旦出現(xiàn)缺失的情況，尿道自身很難再自行修復[15]。本研究中，我們將脂肪干細胞和血管內(nèi)皮細胞采用接觸式共培養(yǎng)方式進行培養(yǎng)，7 d時觀察部分細胞仍保留原有的梭形，另外一部分細胞形態(tài)可呈多角形、巢樣分布，14 d時觀察細胞間可見許多相互連接的突觸，部分細胞可融合成團塊狀。術后4周時對經(jīng)過修復的尿道行組織學檢查，鏡下可見2～3層上皮細胞紊亂地排列在基質(zhì)表面，平滑肌組織可見位于上皮細胞下。術后8周時可見明顯增多的上皮細胞層均勻排列在基質(zhì)表面，黏膜上皮下可見增多的新生小血管、平滑肌及纖維組織。免疫組化結果顯示共培養(yǎng)細胞組在新生小血管和平滑肌細胞再生方面與對照組相比有著明顯的優(yōu)勢，并且術后重建尿道組織血管化及上皮化程度、血管數(shù)目及平滑肌數(shù)逐漸增多并且逐漸規(guī)則化，形成的尿道組織與正常尿道組織比較接近。此外，共培養(yǎng)細胞組新生的血管數(shù)目較單純脂肪干細胞組和血管內(nèi)皮細胞組增多。術后排尿結果提示共培養(yǎng)組的術后并發(fā)癥發(fā)生率明顯低于單純支架組和單一細胞復合支架組。本研究說明應用脂肪干細胞和血管內(nèi)皮細胞體外共培養(yǎng)聯(lián)合脫細胞基質(zhì)材料構建組織工程尿道是可行的。

目前共培養(yǎng)細胞的研究已取得了一定的成就，并且有著廣泛的應用前景。但是，共培養(yǎng)細胞之間相關作用的機制以及種植到機體后細胞的存活遷移情況尚未清楚。相信經(jīng)過科研工作者的不懈努力，細胞共培養(yǎng)技術將會日趨成熟完善，其在組織工程中的應用將會更加廣泛。