苯并芘DNA加合物anti-BPDE-N2-dG四種立體異構(gòu)體的合成及色譜分離

趙旭霞，馮 蕊，郭婭男，鄭速進(jìn)，張加玲，閻小青

(山西醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院 衛(wèi)生檢驗(yàn)教研室，山西 太原 030001)

多環(huán)芳烴(PAHs)是一類廣泛存在于環(huán)境的持久性有機(jī)污染物，主要來(lái)源于煤、石油等有機(jī)化合物的不完全燃燒，也會(huì)產(chǎn)生于燒烤食物以及瀝青、焦油等的生產(chǎn)過(guò)程中。其中，苯并[a]芘(B[a]P)是最為典型的一種多環(huán)芳烴，具有極強(qiáng)的致畸、致癌和致突變性，在進(jìn)入人體后經(jīng)過(guò)一系列代謝活化作用生成鄰二醇環(huán)氧苯并芘(BPDE)[1-3]，此代謝產(chǎn)物有(±)anti-BPDE和(±)syn-BPDE兩對(duì)對(duì)映異構(gòu)體(anti-BPDE與syn-BPDE之間為非對(duì)映異構(gòu)體)。大量的研究表明(±)anti-BPDE比其立體異構(gòu)體(±)syn-BPDE更具誘變性[4-7],(±)anti-BPDE主要與生物體DNA中脫氧鳥(niǎo)苷的N-2位點(diǎn)結(jié)合[1-4]，生成BPDE的脫氧鳥(niǎo)苷加合物(anti-BPDE-N2-dG)。此加合物是化學(xué)物質(zhì)致突變、致癌進(jìn)程中一個(gè)重要的啟動(dòng)因子[8]，既可以作為暴露標(biāo)志物，反映毒物在靶位的實(shí)際暴露劑量，又可以作為效應(yīng)標(biāo)志物，反映DNA受到有毒化學(xué)物質(zhì)損傷的程度，對(duì)研究環(huán)境和職業(yè)B[a]P暴露的早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防有重要意義[9-10]。anti-BPDE-N2-dG含有兩個(gè)手性碳原子，存在對(duì)映異構(gòu)和順?lè)串悩?gòu)現(xiàn)象，主要有trans(-)、trans(+)、cis(+)、cis(-)-anti-BPDE-N2-dG四種立體異構(gòu)(如圖1所示)[11]，其中，trans(-)與trans(+)-anti-BPDE-N2-dG，cis(+)與cis(-)-anti-BPDE-N2-dG為兩對(duì)對(duì)映異構(gòu)體(手性異構(gòu)體)，而trans與cis-anti-BPDE-N2-dG為順?lè)串悩?gòu)體。研究表明這四種立體異構(gòu)體的生物學(xué)活性存在顯著差異[12]。因此，對(duì)anti-BPDE-N2-dG加合物的四種立體異構(gòu)體進(jìn)行準(zhǔn)確地定性和定量分析，對(duì)B[a]P暴露監(jiān)測(cè)及其致癌、致突變的作用機(jī)理研究非常重要。

圖1 anti-BPDE-N2-dG立體異構(gòu)體的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structures of anti-BPDE-N2-dG stereoisomers

環(huán)境中多環(huán)芳烴的暴露水平極低，所以暴露后的生物體內(nèi)相應(yīng)形成的DNA加合物含量更低。大約108～1010個(gè)核苷酸中含有1個(gè)加合物[4]，如何從大量的正常核苷中檢出痕量的特定加合物是當(dāng)今分析技術(shù)面臨的挑戰(zhàn)。目前，關(guān)于苯并芘DNA加合物的檢測(cè)發(fā)展了多種方法[13-14]，包括32P標(biāo)記法、免疫吸附法、核磁共振法、熒光檢測(cè)法，但這些方法均無(wú)法對(duì)加合物的立體異構(gòu)體進(jìn)行表征。相比之下，高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS/MS)不僅擁有可與32P后標(biāo)記法相媲美的靈敏度，而且還可以提供加合物的結(jié)構(gòu)信息，因此受到了更多關(guān)注[15-19]，但在使用該方法定量檢測(cè)BPDE-DNA加合物時(shí)，需合成相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品。目前，文獻(xiàn)報(bào)道了BPDE-DNA加合物的不同合成方法[15-18]，其中，王海林課題組[15]創(chuàng)新性地通過(guò)anti-BPDE與2′-脫氧鳥(niǎo)苷(Deoxyguanosine，dG)直接反應(yīng)后，用固相萃取(SPE)和高效液相色譜(HPLC)對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行提純制得anti-BPDE-N2-dG四種立體異構(gòu)體。該方法與以往的合成方法相比，具有無(wú)需酶解、反應(yīng)時(shí)間短、BPDE用量少等優(yōu)點(diǎn)。但該合成方法利用常規(guī)苯基柱需要85～100 min[15]才可將anti-BPDE-N2-dG四種立體異構(gòu)體實(shí)現(xiàn)色譜分離提純。另外，在利用HPLC-MS/MS對(duì)anti-BPDE-N2-dG四種立體異構(gòu)體進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，雖然質(zhì)譜的選擇性監(jiān)測(cè)可排除副產(chǎn)物四醇-B[a]P的干擾，縮短色譜分離時(shí)間，但仍需45～60 min才能將四種立體異構(gòu)體分離并檢測(cè)[18-19]，且流速快，分流檢測(cè)使得樣品用量大，分離度較小。

五氟苯基柱(PFP)是在硅膠基質(zhì)上鍵合的五氟苯基硅烷鍵合相，由于五氟苯基的存在，化合物可與鍵合相之間產(chǎn)生π-π共軛、偶極-偶極、氫鍵等作用[20]，因此PFP柱的選擇性有別于C18柱和苯基柱。本研究首次將PFP應(yīng)用于anti-BPDE-N2-dG四種立體異構(gòu)體的分離，結(jié)果表明，相對(duì)于常規(guī)C18色譜柱，anti-BPDE-N2-dG 四種立體異構(gòu)體在 PFP色譜柱上的分離效果更好。通過(guò)對(duì)色譜條件的優(yōu)化，可實(shí)現(xiàn)45 min內(nèi)將四種立體異構(gòu)體分離提純。在使用HPLC-MS/MS檢測(cè)時(shí)，30 min內(nèi)即可完成檢測(cè)，極大提高了分離與檢測(cè)效率。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜配二極管陣列(DAD)檢測(cè)器(Thermo scientific U3000，美國(guó)Thermo公司)；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LCMS-8050，日本島津公司)；MOS 450圓二色光譜儀(法國(guó)BioLogic公司)；TU-1901雙光束紫外分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)；SCIENTZ-12N冷凍干燥機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；GI36DS高壓滅菌鍋(廈門致微儀器有限公司)；Mikro 220R高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Hettich公司)；PB-10 pH計(jì)(德國(guó)Sartorius公司)；ME104E電子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；RCT basic加熱磁力攪拌器(德國(guó)IKA集團(tuán))。

(±)anti-BPDE(純度>99%，美國(guó)MRIGlobal Chemical Carcinogen Repository)；2′脫氧鳥(niǎo)苷(純度98%，百靈威科技有限公司)；小牛胸腺DNA(美國(guó)Sigma公司)；脫氧核糖核酸酶Deoxyribonuclease I from bovine pancreas(美國(guó)Sigma公司)；蛇毒磷酸二酯酶Phosphodiesterase I from Crotalus adamanteus venom(美國(guó)Sigma公司)；Tris-base(上海Sangon Biotech)；四氫呋喃、三乙胺、氯化鈉、氯化鈣、乙醚、無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、濃鹽酸(分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)；六水氯化鎂(上海BBI Life Sciences)；甲醇、乙腈(色譜純，美國(guó)Thermo Fisher公司)；甲酸(色譜純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)；超純水(屈臣氏飲用水)。

1.2 anti-BPDE-N2-dG四種立體異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)品的制備

1.2.1 合成反應(yīng)及固相萃取的初步純化(±)anti-BPDE與小牛胸腺DNA反應(yīng)生成BPDE-脫氧鳥(niǎo)苷酸化合物(BPDE adduct of deoxyguanosine monophosphate，BPDE-dGMP)：參照Vouros[21]課題組的方法合成BPDE-dGMP。稱取 0.9 mg(±)anti-BPDE溶于1 mL四氫呋喃；稱取3.6 mg小牛胸腺DNA溶于5 mL 0.05 mol/L Tris-HCl(pH 6.8)；將兩者混勻，50 ℃避光孵育8 h。孵育結(jié)束，加乙酸乙酯-乙醚(5∶2，體積比)7 mL液液萃取，收集下層液體，重復(fù)3次。加入NaCl使其在溶液中的濃度為0.14 mol/L，搖勻，再加入2.5倍體積的無(wú)水乙醇，充分混勻，-22 ℃靜置20～30 min后，-10 ℃ 12 000 r/min離心20 min，移走上清液，室溫下干燥，復(fù)溶于0.05 mol/L含5 mmol/L Ca2+、4 mmol/L Mg2+的Tris-HCl(pH 8.6)緩沖溶液。加入DNA酶 800 U，蛇毒磷酸二酯酶(Snake 酶)0.1 U，37 ℃避光孵育20 h。隨后將消化后的反應(yīng)液進(jìn)行固相萃取凈化富集。

固相萃?。悍Q取100 mg C18固相萃取吸附劑，甲醇活化并裝入固相萃取小柱，5 mL水替換甲醇，取1 mL反應(yīng)液通過(guò)固相萃取小柱，4 mL水溶液淋洗，抽干小柱(不滴水即可)，4 mL 40%甲醇水緩慢洗脫小柱(靠重力流下)，收集洗脫液并濃縮：N2吹干，復(fù)溶于500 μL甲醇，經(jīng)0.45 μm PTFE針頭濾器過(guò)濾后待測(cè)。

(±)anti-BPDE與dG反應(yīng)合成BPDE-脫氧鳥(niǎo)苷加合物(±)anti-BPDE-N2-dG：參照王海林課題組的方法[15]，稱取0.1 mg (±)anti-BPDE溶于100 μL四氫呋喃-三乙胺(19∶1，體積比)溶液中；稱取4.8 mg的2′脫氧鳥(niǎo)苷(dG)溶于1.2 mL 50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)緩沖溶液中，將兩者混勻，避光，室溫反應(yīng)48 h。

固相萃取：稱取100 mg C18固相萃取吸附劑，甲醇活化并裝入固相萃取小柱，5 mL水替換甲醇，將反應(yīng)液通過(guò)固相萃取小柱，再分別用2 mL的超純水、1 mL 10%甲醇水溶液、1 mL 30%甲醇水溶液淋洗，抽干小柱(不滴水即可)后，用2 mL甲醇洗脫小柱(靠重力流下)，收集洗脫液并濃縮(室溫?fù)]發(fā))至1 mL后待測(cè)。

1.2.2 高效液相色譜純化合成的產(chǎn)物經(jīng)固相萃取后不能去除副產(chǎn)物四醇-BaP的干擾，因此，需繼續(xù)濃縮后經(jīng)高效液相色譜儀(DAD檢測(cè)器)進(jìn)一步純化。選用PFP色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸水(22.5∶77.5，體積比)，流速1.2 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)345 nm。反復(fù)多次進(jìn)樣，并分別收集保留時(shí)間為22.887、28.090、30.430 、33.763 min的四種異構(gòu)體流出物，經(jīng)冷凍干燥后，分別復(fù)溶于500 μL的33%甲醇水溶液中，由圓二色譜儀對(duì)四種組分進(jìn)行定性分析，確定四種立體異構(gòu)體出峰順序。將定性后的四種立體異構(gòu)體分別用紫外光譜定量，測(cè)定345 nm處紫外吸光度，根據(jù)ε345 nm=3.43×104L/(mol·cm)算出各物質(zhì)濃度[18]。

1.3 HPLC-MS/MS檢測(cè)anti-BPDE-N2-dG四種立體異構(gòu)體

色譜條件：PFPP色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.1%甲酸水(28∶72)，流速：0.5 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

質(zhì)譜條件：以正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式檢測(cè)，碰撞電壓：12 eV，母離子質(zhì)荷比(m/z)為570.15，子離子m/z為454.10；采用電噴霧離子源(ESI+)；霧化氣：3 L/min，離子源加熱氣:10 L/min，干燥氣:10 L/min，離子源溫度：250 ℃，脫溶劑管溫度：150 ℃；加熱塊溫度：350 ℃；碰撞誘導(dǎo)解離氣：270 kPa；采集時(shí)間(Dwell time)：100 ms。

2 結(jié)果與討論

2.1 anti-BPDE-N2-dG四種立體異構(gòu)體的制備

2.1.1 anti-BPDE-N2-dG合成方法的選擇使用HPLC-MS/MS定量檢測(cè)苯并芘DNA加合物時(shí)，由于無(wú)市售的加合物標(biāo)準(zhǔn)品，需要合成相應(yīng)的純品。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，苯并芘的脫氧鳥(niǎo)苷加合物主要有兩種合成方法，一種是BPDE與小牛胸腺DNA反應(yīng)生成BPDE的脫氧鳥(niǎo)苷酸加合物(BPDE-dGMP)[21]，另一種為(±)anti-BPDE直接與2′脫氧鳥(niǎo)苷(dG)反應(yīng)生成anti-BPDE-N2-dG[15]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)兩種方法進(jìn)行了對(duì)比。第一種(具體步驟見(jiàn)“1.2.1”)中，BPDE與小牛胸腺DNA反應(yīng)后，酶解至單核苷酸，經(jīng)固相萃取純化，質(zhì)譜子離子掃描[21]，驗(yàn)證合成BPDE-dGMP。但此合成過(guò)程中(±)anti-BPDE的用量大，因?yàn)镈NA中除鳥(niǎo)嘌呤外，還有其他堿基會(huì)與BPDE反應(yīng)從而消耗BPDE；合成過(guò)程需酶解，耗時(shí)且酶價(jià)格較昂貴，而繁瑣的反應(yīng)過(guò)程也使得實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性較差。第二種方法選擇(±)anti-BPDE與dG直接反應(yīng)生成(±)anti-BPDE-N2-dG，經(jīng)固相萃取初步純化后，采用質(zhì)譜子離子掃描[15,17]驗(yàn)證合成的anti-BPDE-N2-dG。該方法中(±)anti-BPDE的用量少，從經(jīng)濟(jì)和安全性角度均非常有益，且反應(yīng)無(wú)需酶解，過(guò)程簡(jiǎn)單方便，因此，本實(shí)驗(yàn)選用該方法合成BPDE的DNA加合物標(biāo)準(zhǔn)品。

2.1.2 高效液相色譜純化目前，文獻(xiàn)報(bào)道的純化方法采用苯基柱需85 min[15]才能將anti-BPDE-N2-dG兩對(duì)對(duì)映體實(shí)現(xiàn)色譜分離提純，時(shí)間較長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)采用常規(guī)的C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)對(duì)其進(jìn)行分離，結(jié)果顯示在流動(dòng)相條件為乙腈-水(18.5∶81.5，體積比)，流速0.75 mL/min，需要160 min才可實(shí)現(xiàn)六種物質(zhì)(BPDE-N2-dG四種立體異構(gòu)體和兩種四醇-BaP)的分離，時(shí)間很長(zhǎng)。因此，本實(shí)驗(yàn)嘗試將不同于C18柱和苯基柱作用機(jī)制的五氟苯基柱(PFP柱)應(yīng)用于兩對(duì)對(duì)映體的分離，并與常規(guī)C18色譜柱進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果如圖2所示。圖中星形標(biāo)記的為anti-BPDE-N2-dG立體異構(gòu)體，峰1和峰2為副產(chǎn)物四醇-BaP的異構(gòu)體。結(jié)果表明：在相同流動(dòng)相條件下(乙腈-水，體積比為26∶74，流速1.2 mL/min)，345 nm處紫外光譜檢測(cè)，anti-BPDE-N2-dG的四種立體異構(gòu)體在C18柱上只能看到兩個(gè)峰(圖2A)，而在相同規(guī)格的PFP色譜柱上(圖2B)可觀察到四種立體異構(gòu)體的分離。

與中性或堿性流動(dòng)相相比，酸性流動(dòng)相可增強(qiáng)cis-(+)-anti-BPDE-N2-dG的穩(wěn)定性，并提高四種立體異構(gòu)體的分離度[19]。因此，在水中加入0.1%甲酸作為流動(dòng)相，PFP色譜柱在相同流動(dòng)相比例下(乙腈-0.1%甲酸水，體積比26∶74，流速1.2 mL/min)，可觀察到anti-BPDE-N2-dG四種立體異構(gòu)體中的第2、3、4峰的分離度明顯增大，且第3與第4個(gè)峰已達(dá)到基線分離(圖2D)。在此酸性流動(dòng)相條件下，anti-BPDE-N2-dG的四種立體異構(gòu)體在C18柱上可分離出三個(gè)峰(圖2C)，較中性流動(dòng)相的兩個(gè)峰(圖2A)有明顯改善，但分離效果不及PFP色譜柱(圖2D)。

圖3 PFP色譜柱上分離anti-BPDE-N2-dG四種立體 異構(gòu)體及兩種四醇-B[a]P的液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of four anti-BPDE-N2-dG stereoisomers and two BPDE tetrols obtained on PFP column the peaks of 1 and 2 are two BPDE tetrols，and the peaks labeled with asterisk are anti-BPDE-N2-dG stereoisomers；mobile phase： acetonitrile-0.1% formic acid(22.5∶77.5)；λ=345 nm

為了進(jìn)一步增加四種立體異構(gòu)體在PFP色譜柱上的分離度，繼續(xù)調(diào)整流動(dòng)相的比例，發(fā)現(xiàn)隨著有機(jī)相比例的減少，四種立體異構(gòu)體的分離度增加，六種物質(zhì)(anti-BPDE-N2-dG順?lè)磧蓪?duì)異構(gòu)體和兩種四醇-B[a]P)的保留時(shí)間均向后移，但anti-BPDE-N2-dG后移速度快于四醇-B[a]P。因此，anti-BPDE-N2-dG與四醇-B[a]P的峰出現(xiàn)重疊，流動(dòng)相比例為乙腈-0.1%甲酸水(22.5∶77.5)，流速1.2 mL/min時(shí)，45 min內(nèi)可將六種物質(zhì)完全分離開(kāi)，分離度均大于2(如圖3)。分別收集anti-BPDE-N2-dG四種立體異構(gòu)體，即保留時(shí)間分別為22.887、28.090、30.430、33.763 min的流出物并冷凍干燥去除溶劑，復(fù)溶于33%甲醇水溶液中進(jìn)行圓二色譜(CD)及紫外吸收光譜分析。

2.1.3 anti-BPDE-N2-dG合成條件的優(yōu)化為了提高anti-BPDE-N2-dG的合成產(chǎn)量，本實(shí)驗(yàn)對(duì)(±)anti-BPDE直接與dG反應(yīng)的溫度和時(shí)間進(jìn)行了考察?？刂破渌磻?yīng)條件不變，將相同的兩份樣品分別置于室溫(23.6 ℃)與37 ℃，避光反應(yīng)24 h；固相萃取初步純化后，HPLC-DAD檢測(cè)(乙腈-水，26∶74，C18柱)anti-BPDE-N2-dG與四醇-B[a]P的含量(如圖2A)，并比較其峰高。結(jié)果如表1所示：表中anti-BPDE-N2-dG為圖2A中保留時(shí)間為11 min的峰，四醇-B[a]P 1為圖中保留時(shí)間為15 min的峰1，四醇-B[a]P 2為圖中保留時(shí)間為25 min的峰2。經(jīng)兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)顯示，室溫下anti-BPDE-N2-dG的產(chǎn)量較37 ℃高(P<0.05)(表1)，而四醇-B[a]P的量下降，表明室溫下更有利于主反應(yīng)的進(jìn)行?？刂破渌磻?yīng)條件不變，僅將樣品在室溫反應(yīng)時(shí)間由24 h延長(zhǎng)至48 h，結(jié)果顯示：(±)anti-BPDE與dG反應(yīng)48 h時(shí)，anti-BPDE-N2-dG與四醇-BaP的峰高較24 h均提高2倍多(見(jiàn)表1)。為了提高anti-BPDE-N2-dG的合成產(chǎn)量，本實(shí)驗(yàn)將反應(yīng)條件定為室溫反應(yīng)48 h。

Experimental conditionAanti-BPDE-N2-dG(mAU)ABPDE tetrol 1(mAU)ABPDE tetrol 2(mAU)37 ℃,24 h52.17±0.28 74.17±0.73 2.56±0.37 23.6 ℃,24 h56.42±0.68 71.02±0.48 1.37±0.35 23.6 ℃,48 h 142.2±3.01 195.0±0.99 3.35±0.18

2.2 anti-BPDE-N2-dG立體異構(gòu)體的表征及定量

在HPLC-DAD上，anti-BPDE-N2-dG與副產(chǎn)物四醇-B[a]P的紫外吸收光譜很相似，但仍可通過(guò)比較紫外圖譜中280～282 nm和344～347 nm處相對(duì)吸收強(qiáng)度來(lái)區(qū)分anti-BPDE-N2-dG與四醇-B[a]P[15]。如圖4所示，anti-BPDE-N2-dG的紫外吸收在280～282 nm處相對(duì)較高，而兩種四醇-B[a]P的紫外吸收在344 nm處相對(duì)較高。此外，根據(jù)最長(zhǎng)波長(zhǎng)的紫外吸收峰位置還可粗略區(qū)分順?lè)串悩?gòu)體，cis(+)和cis(-)對(duì)映異構(gòu)體最長(zhǎng)的紫外吸收峰位于347 nm，而trans(+)和trans(-)對(duì)映異構(gòu)體最長(zhǎng)的紫外吸收峰位于346 nm處，cis-anti-BPDE-N2-dG相比于trans-anti-BPDE-N2-dG略有紅移[15,19]。

為了準(zhǔn)確區(qū)分四種立體異構(gòu)體，以及其中的對(duì)映異構(gòu)體，將收集的四種組分復(fù)溶于33%甲醇水溶液中進(jìn)行圓二色譜(CD)表征。對(duì)映異構(gòu)體加合物trans-(+)和trans-(-)，cis-(+)和cis-(-)的CD光譜相似，但符號(hào)相反。trans-(+)-和cis-(-)-anti-BPDE-N2-dG均具有10S的絕對(duì)構(gòu)型，且對(duì)其最強(qiáng)的CD波段(250 nm)均表現(xiàn)出正信號(hào)。而trans-(-)-和cis-(+)-anti-BPDE-N2-dG均具有10R的絕對(duì)構(gòu)型，且在相同的CD波段(250 nm)表現(xiàn)出負(fù)信號(hào)(圖5)。研究結(jié)果與文獻(xiàn)一致[19,22]。因此，確定PFP色譜柱分離anti-BPDE-N2-dG四種立體異構(gòu)體的出峰順序?yàn)閠rans(-)(22.887 min)、trans(+)(28.090 min)、cis(+)(30.430 min)、cis(-)(33.763 min)-anti-BPDE-N2-dG(圖3)。將復(fù)溶于33%甲醇水溶液的各異構(gòu)體溶液，測(cè)定其在345 nm處的紫外吸光度，可根據(jù)ε345 nm=3.43×104L/(mol·cm)算出各物質(zhì)的濃度[18]。

圖6 HPLC-MS/MS檢測(cè)anti-BPDE-N2-dG 四種立體異構(gòu)體的色譜圖Fig.6 Chromatogram for separation of four anti-BPDE-N2-dG stereoisomers recorded by HPLC-MS/MS

2.3 HPLC-MS/MS色譜分離條件的選擇

利用HPLC-MS/MS對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，質(zhì)譜在離子選擇模式下檢測(cè)可排除四醇-B[a]P的干擾，因此可不考慮四醇-B[a]P對(duì)色譜分離的影響，將anti-BPDE-N2-dG四種立體異構(gòu)體分開(kāi)即可滿足檢測(cè)條件。如果將HPLC-DAD分離anti-BPDE-N2-dG的條件：乙腈-0.1%甲酸水(22.5∶77.5)，1.2 mL/min，PFP柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)直接應(yīng)用于HPLC-MS/MS，1.2 mL/min流速的對(duì)于質(zhì)譜過(guò)高，不利于霧化，靈敏度偏低，故將流速設(shè)為0.5mL/min，調(diào)整流動(dòng)相比例為乙腈-0.1%甲酸水(28∶72)，柱溫30 ℃，即可在30 min內(nèi)分離四種立體異構(gòu)體(圖6)，最小分離度可達(dá)0.995。與相同規(guī)格的苯基柱需要60 min才能將anti-BPDE-N2-dG四種立體異構(gòu)體分離相比，大大縮短了分離時(shí)間，提高了分離效率，節(jié)約了分離成本。

3 結(jié) 論

本文對(duì)現(xiàn)有的合成純化anti-BPDE-N2-dG四種立體異構(gòu)體(包含兩對(duì)對(duì)映異構(gòu)體)方法進(jìn)行了改進(jìn)。通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)溫度和時(shí)間，提高了反應(yīng)產(chǎn)量，為定量檢測(cè)生物體苯并芘DNA加合物提供了標(biāo)準(zhǔn)品；并首次將五氟苯基色譜柱應(yīng)用于anti-BPDE-N2-dG四種立體異構(gòu)體的色譜分離，利用HPLC可以實(shí)現(xiàn)45 min內(nèi)分離提純四種立體異構(gòu)體，建立了一種快速純化與分離anti-BPDE-N2-dG四種立體異構(gòu)體的方法。利用HPLC-MS/MS檢測(cè)四種anti-BPDE-N2-dG立體異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，使用常規(guī)的五氟苯基色譜柱可在30 min內(nèi)完成分離，大大提高了檢測(cè)效率。制備純化以及檢測(cè)分離anti-BPDE-N2-dG均可在同一色譜柱上完成，節(jié)約了分離成本。