脫脂油棕谷蛋白2的營養(yǎng)價值與功能特性

李 艷,史攀琪

(山西師范大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,山西臨汾 040000)

谷蛋白-2,又名堿溶性谷蛋白,是植物貯藏蛋白中的一種。一般情況下,在堿性環(huán)境中植物蛋白質(zhì)容易發(fā)生結(jié)構(gòu)改變、降解或變性,有時甚至產(chǎn)生有毒物質(zhì);而谷蛋白-2在較高pH下具有溶解性和穩(wěn)定性的優(yōu)勢,使其更適宜于制備偏堿性食品或滿足特定的加工條件[1]。近年來的研究表明,一般油料作物如大豆、椰子等中球蛋白的含量較高,谷蛋白-2的含量較低;而糧食小麥、燕麥蛋白中谷蛋白的含量相對較高[2]。

油棕(oil palm)是世界上最重要的油料作物之一,棕櫚油的貿(mào)易量和使用量近年來穩(wěn)居世界第一[3]。脫脂油棕是棕櫚油產(chǎn)業(yè)的主要副產(chǎn)物,產(chǎn)量巨大[4]。前期研究表明,脫脂油棕中蛋白質(zhì)的含量高達26%,而谷蛋白-2約占總蛋白的47%[5],是良好的堿溶性植物蛋白來源。然而,目前脫脂油棕僅被作為飼料或肥料,其富含的蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、膳食纖維等成分未被開發(fā)利用。如何提高脫脂油棕的利用是目前棕櫚油產(chǎn)業(yè)亟需解決的問題。目前國內(nèi)外對脫脂油棕蛋白質(zhì)的研究多集中在其清蛋白、球蛋白及部分活性肽方面[4-6],對谷蛋白-2的研究報道也很少。Chee等[7]曾研究了用胰蛋白酶輔助法提取油棕谷蛋白-2的工藝,并分析了油棕粕谷蛋白-2的氨基酸組成;Zheng等[8]研究了油棕粕谷蛋白-1的氨基酸組成和抗氧化性,但目前未見到關(guān)于油棕粕谷蛋白-2營養(yǎng)價值和功能特性的研究報道。

基于此,本試驗采用逐步提取法制備脫脂油棕谷蛋白-2(defatted oil palm glutelin-2,DOPG-2),重點分析其氨基酸組成、生物價、體外消化吸收率等營養(yǎng)價值與功能特性,以期為其在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫脂油棕 由瑞南食品廠提供;大豆分離蛋白(SPI) 索萊寶公司;低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白(14.4～94.7 kDa) 上海生物研究所;考馬斯亮藍R-250、甘氨酸、十二烷基磺酸鈉等電泳試劑 均為電泳級;磷酸氫二鈉、無水乙醇等試劑 均為分析純。

970CRT熒光分光光度計 上海電儀儀器廠;GL-20B型離心機 德國Hettich公司;DYCZ-24D型電泳槽 北京六一廠;L-8900型氨基酸自動分析儀 日立公司;SHA-B雙功能數(shù)顯恒溫振蕩器 常州天瑞儀器有限公司;Synene BOXF3型凝膠分析儀 日本Gene公司;RVA-Tecmaster型黏度儀 上海精密儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 脫脂油棕谷蛋白-2(DOPG-2)的制備 采用逐步提取法[9]。取20 g脫脂油棕于三角瓶中,按照料液比1∶25的比例加入NaCl溶液(0.2 mol/L),35 ℃水浴中振蕩1 h后過濾。重復(fù)提取3次,棄濾液,得到脫除清蛋白和球蛋白的脫脂油棕濾渣。然后在該濾渣中加入0.1 mol/L NaOH,振蕩提取2 h,過濾,收集濾液,再次在濾渣中加入該NaOH溶液,如此重復(fù)提取3次,合并濾液后在12000×g、4 ℃下離心20 min,收集上清液,在透析袋(4.0 kDa)中透析48 h,將透析液真空冷凍干燥(-0.1 MPa、-40 ℃)后即得到脫脂油棕谷蛋白-2。將該蛋白儲存于-20 ℃中,用于營養(yǎng)價值和功能特性分析。

1.2.2 脫脂油棕分離蛋白的制備 采用Zheng等[6]的方法。取20 g脫脂油棕于三角瓶中,按照料液比1∶25的比例加入pH8.0、0.2 mol/L磷酸緩沖液(含NaCl 0.2 mol/L、EDTA 10 mmol/L),35 ℃水浴中振蕩1 h后過濾,收集濾液,在6000×g、4 ℃下離心20 min,收集上清液,在透析袋(4.0 kDa)中透析48 h,將透析液真空冷凍干燥(-0.1 MPa、-40 ℃)后即得到脫脂油棕分離蛋白(Defatted oil palm protein isolate,DOPPI)。將該蛋白儲存于-20 ℃下,用于營養(yǎng)價值和功能特性實驗的對照。

1.2.3 SDS-PAGE分析 將DOPG-2(1 mg/mL)分別在還原性SDS-PAGE(含5%β-巰基乙醇)和非還原性SDS-PAGE凝膠電泳(不含β-巰基乙醇)中分析[4,9]。還原性和非還原性SDS-PAGE系統(tǒng)中,濃縮膠濃度和分離膠濃度都分別為7.5%和12%,在凝膠成像儀上分析其亞基組成和分子量分布。

1.2.4 氨基酸組成分析 向DOPG-2中加入6 mol/L的鹽酸(料液比為1∶50),于110 ℃水浴中反應(yīng)24 h,冷卻至室溫后過濾、稀釋,在氨基酸自動分析儀上分析[4]。

1.2.5 Bigelow參數(shù)分析 以氨基酸組成為依據(jù),分析DOPG-2的NPS值(非極性氨基酸的總含量,含纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸、異亮氨酸和酪氨酸)、P值(極性基團與非極性基團比值)[11]。

1.2.6 營養(yǎng)價值分析 營養(yǎng)價值包括必需氨基酸組成與含量、生物價(biological value,BV)和體外消化吸收率[6]。其中,體外消化吸收率采用Tapal等[4]的方法,生物價參照Chee等[7]的方法進行,公式如下:

BV=102.15×q0.41Lys×q0.60Phe+Tyr×q0.77Met+Cys×q2.4Thr×q0.21Trp

式(1)

式中各氨基酸的q值的計算方法,分以下幾種情況:

如果樣品中該氨基酸含量≤FAO/WHO的推薦值,則qi=該氨基酸含量/推薦值;

如果樣品中該氨基酸含量≥FAO/WHO的推薦值,則qi=推薦值/該氨基酸含量。

FAO/WHO對各必需氨基酸的推薦值為Ile=4.00,Leu=7.04,Lys=5.44,Met+Cys=3.52,Phe+Tyr=6.08,Thr=4.00,Trp=0.96,Val=4.96(g/100 g)[12]

1.2.7 表面疏水性分析 將DOPG-2溶解于磷酸緩沖液中,配制成不同濃度的溶液(0.01、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mg/mL)。分別取各溶液2 mL,加入20 μL 8-苯胺-1-萘磺酸(ANS,8 mmol/L),混勻后靜置3 min,在發(fā)射波長470 nm、激發(fā)波長390 nm下測定其熒光強度。以各熒光強度為y值,對應(yīng)蛋白液濃度為x(mg/mL),繪制曲線,所得曲線的初始斜率即為蛋白質(zhì)的表面疏水性[7]。所得回歸方程為:y=ln(x)+5.8067,R2=0.9274。

1.2.8 乳化性和乳化穩(wěn)定性的測定 在30 mL DOPG-2溶液(1 mg/mL,pH8.0)中加入10 mL 大豆油,10000 r/min下勻漿30 s,立即從溶液底部吸取50 μL乳濁液加到5 mL SDS(1 mg/mL)中,500 nm下比色[6]。分別記錄初始吸光值A(chǔ)0和靜置10 min后的吸光值A(chǔ)t。乳化性(emulsifying activity index,EAI)表示為:

EAI=(2.303×2×Ao×稀釋倍數(shù))/(C×Ф×10000)

式(2)

式中:C-蛋白質(zhì)濃度(mg/mL),Ф-油相體積比(1/4)。

乳化穩(wěn)定性(emulsifying stability,ES)則為:

ES=(At/A0)×100

式(3)

式中:t=10 min。

1.2.9 起泡性與泡沫穩(wěn)定性的測定 取30 mL DOPG-2(1 mg/mL,pH8.0),高速均質(zhì)2 min(10000 r/min),記錄勻漿停止時泡沫的體積V0,以大豆分離蛋白做對照,起泡性(foaming capacity,FC)計算公式如下[6]:

FC(%)=V0/30 mL×100

式(4)

記錄放置30 min后泡沫的體積(Vt),泡沫穩(wěn)定性(foam stability,FS)的計算公式如下:

FS(%)=Vt/V0×100

式(5)

1.2.10 黏度的測定 參照Zheng等[6]的方法,在黏度儀上測定。將2 g DOPG-2溶解于100 mL蒸餾水中,調(diào)節(jié)溶液pH至7.0,在25 ℃用NDJ-1 型黏度計測定其表觀黏度,重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗均重復(fù)3次,取平均值,以鄧肯氏新復(fù)極差法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS-PAGE分析

脫脂油棕谷蛋白-2在SDS-PAGE和不加β-巰基乙醇SDS-PAGE系統(tǒng)中的亞基構(gòu)成和分子量分布,見圖1。圖1中結(jié)果表明,在還原性SDS-PAGE和非還原性SDS-PAGE中,脫脂油棕谷蛋白-2分子量分布和亞基構(gòu)成差異較大。在非還原性條件下,DOPG-2含5個亞基,分子量為22.1～133.5 kDa;而在還原性條件下,DOPG-2含4個主要亞基,分子量都小于或等于51.5 kDa(在SDS-PAGE中,蛋白質(zhì)的遷移率越大,其分子量越小)。這表明DOPG-2中含有二硫鍵,所含分子量為133.5 kDa的亞基在還原性電泳中二硫鍵斷裂,釋放出分子量較小的亞基。大豆蛋白和椰子蛋白亞基之間也含有二硫鍵,其還原性和非還原性凝膠電泳結(jié)果之間的差異也顯著[6-7]。二硫鍵的含量與蛋白質(zhì)的一些功能特性和生物活性相關(guān),例如,大豆11S球蛋白中的二硫鍵含量與其乳化性和凝膠性呈一定的正相關(guān)關(guān)系;而椰子球蛋白中二硫鍵的含量與其絡(luò)合金屬能力直接相關(guān)[6-7]。

圖1 脫脂油棕谷蛋白-2在SDS-PAGE中的凝膠電泳分析

2.2 氨基酸組成與營養(yǎng)價值分析

DOPG-2的氨基酸組成、Bigelow參數(shù)和營養(yǎng)價值見表1。

表1 脫脂油棕谷蛋白-2的氨基酸組成(g/100 g蛋白質(zhì))與營養(yǎng)價值分析

注:同行的數(shù)值上標(biāo)注的不同小寫字母表示顯著性差異(P<0.05);NPS表示非極性氨基酸比例;P表示極性氨基酸與非極性氨基酸的比值。

由表1可知,DOPG-2及DOPPI中必需氨基酸齊全,亮氨酸、半胱氨酸、異亮氨酸、纈氨酸及必需氨基酸總量均明顯高于FAO/WHO的推薦值。雖然DOPG-2的賴氨酸低于FAO/WHO的推薦值,但明顯高于大米蛋白和椰子蛋白[2,9]。DOPG-2中含硫氨基酸的含量很高,這是其分子中含有較多二硫鍵的重要原因(圖1)。此外,DOPG-2的體外消化吸收率為70.02±2.54 g/100 g,生物價為63.03,明顯高于燕麥蛋白、椰子蛋白[2,13,14],因此其營養(yǎng)價值較高。

Bigelow參數(shù)分析表明,DOPG-2中極性氨基酸與非極性氨基酸的比例較高(2.18),非極性氨基酸的比例較低(0.32)。蛋白質(zhì)中氨基酸的極性是影響其側(cè)鏈電化學(xué)性質(zhì)和其他理化性質(zhì)的因素之一。較高的極性氨基酸含量是DOPG-2在堿性條件下具有較高溶解性的重要原因。此外,DOPG-2的NPS值要明顯高于椰子球蛋白和大豆11S球蛋白[15-16]。有學(xué)者指出當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)中含有一些特定的疏水性氨基酸(如芳香族氨基酸、亮氨酸等),往往表現(xiàn)出較好的生物功能[6,16-23];而多肽鏈中氨基酸的極性可影響其溶解性和表面疏水性,進而影響其在食品加工中的特性(如黏度、起泡性、膠凝性和乳化性等)[4,6,13-15]。表1顯示,DOPG-2的表面疏水性為37.29±0.12,顯著(P<0.05)低于油棕分離蛋白,這與其較高P值和較低的NPS相對應(yīng)。由于油棕分離蛋白不但包括谷蛋白,還包括清蛋白和球蛋白,而后二者的疏水性更低,致使油棕分離蛋白表面疏水性更低。

2.3 脫脂油棕谷蛋白-2的功能特性分析

DOPG-2和大豆分離蛋白(SPI)的乳化性、起泡性和黏度如表2所示。

表2 脫脂油棕谷蛋白-2和分離蛋白的功能特性

2.3.1 脫脂油棕谷蛋白-2的乳化性質(zhì)分析 如表2所示,3種蛋白質(zhì)中,DOPG-2的乳化性和乳化穩(wěn)定性顯著高于DOPPI和SPI(P<0.05),而DOPPI的乳化性又顯著高于SPI(P<0.05)。大量研究表明,蛋白質(zhì)的乳化性能與其分子大小、側(cè)鏈基團極性、表面疏水性、溶解度、濃度等因素相關(guān)。溶解性佳意味著更多的蛋白質(zhì)分子可以在高速攪拌中,形成水包油型的乳濁液;而表面疏水性強,表明蛋白質(zhì)可以很好地平衡水相與油相之間的作用,維持乳濁液的穩(wěn)定。DOPG-2的乳化性和乳化穩(wěn)定性顯著高于DOPPI和SPI(P<0.05),原因主要在于其較低的表面疏水性(表1)和在堿性條件下有較高的溶解度。此外,有研究指出,大分子量的蛋白質(zhì)能夠?qū)⑷榈畏€(wěn)定在油水界面之上,而小分子蛋白質(zhì)形成的乳濁液的穩(wěn)定性則較差[14,24]。DOPG-2較高的乳化穩(wěn)定性可能與其分子量為133.5 kDa的亞基(圖1)有關(guān)。本試驗結(jié)果表明,DOPG-2的乳化性能顯著優(yōu)于大豆分離蛋白(P<0.05),可作為乳化劑、乳化穩(wěn)定劑兼營養(yǎng)強化劑等應(yīng)用于食品中。

2.3.2 起泡性和黏度分析 在冰激凌、肉湯、蛋白質(zhì)飲料等食品中,蛋白質(zhì)由于具有適宜的起泡性或黏度,可以滿足維持食品特殊結(jié)構(gòu)(如多孔結(jié)構(gòu))、流變性能、口感改良等方面的要求[1,25]。表2中結(jié)果顯示,DOPG-2和DOPPI的起泡性和泡沫穩(wěn)定性都顯著低于SPI(P<0.05);但DOPG-2的起泡性和泡沫穩(wěn)定性要顯著高于DOPPI(P<0.05)。而所測3種蛋白質(zhì)中,黏度的順序依次為DOPPI

3 結(jié)論

本試驗表明,脫脂油棕谷蛋白-2中含5個分子量為22.1～133.5 kDa的亞基,亞基之間含二硫鍵;DOPG-2的氨基酸組成較合理,其中亮氨酸、半胱氨酸、異亮氨酸、纈氨酸的含量較高,營養(yǎng)價值較高。同時,脫脂油棕谷蛋白-2的其乳化性(251.58±5.28 m2/g)和乳化穩(wěn)定性(84.40%)顯著(P<0.05)高于大豆分離蛋白(32.57 m2/g,43.08%),并具有較好的黏度以及一定的起泡性。由于油棕粕來源豐富、成本較低廉,因此脫脂油棕谷蛋白-2在食品工業(yè)中的應(yīng)用潛力較大。