謝村黃酒的雙酶法發(fā)酵工藝優(yōu)化

韓惠敏,耿敬章,2,3,李新生,2,3,*,裴金金,2,3,楊 佳,吳東平

(1.陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,陜西漢中 723000;2.陜西省資源生物重點實驗室,陜西漢中 723000;3.中國謝村北派黃酒研究院,陜西漢中 723000;4.陜西省秦洋長生酒業(yè)有限公司,陜西漢中 723300)

黑米為禾本科植物,可分為黑糯米和黑粘米兩種[1]。黑米色香味俱全且含有多種營養(yǎng)成分,胚芽和種皮是其大部分養(yǎng)分聚集的部位[2]。黑米色素是存在于黑米種皮中的一類天然黃酮類色素,與合成色素相比安全性高且具有較高的營養(yǎng)價值和藥理活性[3]。功能性黑米保健食品成為當(dāng)今的研究熱門,黑米果茶、黑米雙歧酸奶、黑米黃酒等新成果不斷出現(xiàn)[4-5]。

黃酒是世界上最為古老的酒種之一,傳統(tǒng)黃酒根據(jù)其釀造原料與生產(chǎn)地域的不同,可分為南方黃酒及北方黃酒[6],謝村黃酒是北方黃酒的代表性產(chǎn)品。目前,謝村黃酒的生產(chǎn)主要以傳統(tǒng)手工釀造為主,具有生產(chǎn)周期長且勞動強(qiáng)度大等特點。此外,黃酒傳統(tǒng)釀造工序中,“浸米-蒸飯”使得原料米中的生理活性成份流失,同時也降低了單位原料米的黃酒產(chǎn)率[7]。對此,研究者們開發(fā)了擠壓膨化法、焙炒法、液化法及生料法來替代傳統(tǒng)“浸米-蒸飯”工序,且部分已進(jìn)行應(yīng)用[8-11]。據(jù)文獻(xiàn)報道,目前黑米黃酒的釀造工藝以浸米、蒸飯、大曲傳統(tǒng)黃酒發(fā)酵;原料經(jīng)生物酶糖化后采用純菌種進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵;原料米經(jīng)糖化、純菌種固液二次連續(xù)發(fā)酵為主[12-15]。但仍存在一些問題亟需解決,如浸米工序使生理活性物質(zhì)花青苷大量損失,酒體中黑米色素不穩(wěn)定等。

本研究以黑糯米為釀造原料,以“焙炒”替代傳統(tǒng)“浸米-蒸飯”工序,在發(fā)酵過程中,采用雙酶液化糖化后,接入傳統(tǒng)謝村麥曲進(jìn)行發(fā)酵。通過單因素實驗聯(lián)合正交實驗優(yōu)化黑米黃酒的最佳釀造工藝。旨在為深入開發(fā)具有更好保健作用的新型謝村黃酒做前期研究,同時進(jìn)一步健全我國北派黃酒研究體系,為我國黃酒釀造提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑米 洋縣周大黑;麥曲 陜西省秦洋長生酒業(yè)有限公司;高溫α-淀粉酶(食品級,40000 U·g-1)、糖化酶(食品級,100000 U·g-1) 北京索萊寶科技有限公司;濃硫酸、氯化鉀、乙酸鈉、3,5-二硝基水楊酸、苯酚、亞硫酸鈉、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、葡萄糖 分析純,天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司。

BD-chj100型自動恒溫控溫電加熱炒貨機(jī) 廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司;CLF-06C型高速粉碎機(jī) 浙江省溫嶺市藥材器械廠;ZA220R4型電子天平 上海贊維衡器有限公司;DK-98-II A型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;3FG-01B型電熱恒溫干燥箱 湖北省黃石市醫(yī)療器械廠;DT5-1型低速臺式離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司;UV-1750型紫外可見分光光度計 日本島津有限公司;RP-300B型人工氣候箱 南京恒裕電子儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 釀造工藝流程 挑選有光澤、顆粒飽滿的黑米,篩選除雜、清洗干凈后。潤麥調(diào)節(jié)水分至30%,平衡24 h后,在220～240 ℃下炒制30 min,室溫冷卻干燥12 h。粉碎機(jī)粉碎至可過60目篩,備用。

釀造工藝:黑米→焙炒→粉碎→液化→糖化→發(fā)酵→過濾→酒液。

1.2.2 黑米黃酒液化工藝的優(yōu)化

1.2.2.1 液化工藝單因素實驗 液化工藝程度是液化法釀制黃酒過程中的關(guān)鍵因素,在醪液液化過程中,直鏈淀粉在酶的作用下逐步分解為還原糖,以供后期酵母發(fā)酵利用[11]。醪液pH、液化溫度、高溫α-淀粉酶的添加量以及液化時間是影響液化程度的幾個關(guān)鍵因素,預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)所采用的高溫α-淀粉酶在pH為6時酶活最強(qiáng),故選取液化溫度、高溫α-淀粉酶的添加量以及液化時間三個因素對黑米黃酒液化工藝進(jìn)行優(yōu)化。參考文獻(xiàn)[16-18]的實驗方法并稍做修改,對黑米黃酒液化工藝進(jìn)行優(yōu)化。稱取50 g經(jīng)過預(yù)處理的黑米粉,以1∶3 g/mL的料液比進(jìn)行混勻,以液化溫度80、85、90、95、100、105 ℃;液化時間10、20、30、40、50、60 min;高溫α-淀粉酶添加量10、20、30、40、50、60 U·g-1為單因素條件依次優(yōu)化黑米黃酒液化處理。其中各因素固定水平為料液比為液化溫度85 ℃,液化時間50 min,高溫α-淀粉酶添加量為50 U·g-1。液化完成后,以4500 r/min離心10 min,吸取上清液,測定葡萄糖值(DE值)。

1.2.2.2 液化工藝正交實驗 根據(jù)單因素實驗所確定的最適水平范圍,采用SPSS 19.0設(shè)計方案,以液化溫度、液化時間與高溫α-淀粉酶添加量為因素,設(shè)計L9(34)正交表,以DE值為指標(biāo)確定最優(yōu)液化工藝條件組合,因素水平如表1所示。

表1 L9(34)正交試驗因素與水平

1.2.3 黑米黃酒糖化工藝的優(yōu)化

1.2.3.1 糖化工藝單因素實驗 醪液經(jīng)液化處理后進(jìn)行糖化工藝的優(yōu)化。參考文獻(xiàn)[16-18]的實驗方法并稍做修改,對黑米黃酒糖化工藝進(jìn)行優(yōu)化。以糖化溫度50、55、60、65、70、75 ℃;糖化時間60、90、120、150、180、240 min;糖化酶添加量50、60、70、80、90、100 U·g-1為單因素條件依次優(yōu)化黑米黃酒糖化處理。其中各因素固定水平為料液比為糖化溫度75 ℃,糖化時間150 min,糖化酶添加量為70 U·g-1。糖化完成后,以4500 r/min離心10 min,吸取上清液,測定葡萄糖值(DE值)。

1.2.3.2 糖化工藝正交實驗 根據(jù)單因素實驗所確定的最適水平范圍,選擇糖化時間、糖化溫度與糖化酶添加量為因素,設(shè)計L9(34)正交表,以DE值為指標(biāo)確定最優(yōu)糖化工藝條件組合,因素水平如表2所示。

表2 L9(34)正交試驗因素與水平

1.2.4 黑米黃酒主酵工藝的優(yōu)化

1.2.4.1 主酵工藝單因素實驗 參考王元軍等[19-21]的實驗方法并稍做修改,對黑米黃酒主酵工藝進(jìn)行優(yōu)化。醪液以最優(yōu)液化工藝、糖化工藝處理完成后,以料液比1∶1.5、1∶2.0、1∶2.5、1∶3.0、1∶3.5、1∶4.0 g/mL;主酵溫度16、20、24、27、30、34 ℃;接曲量0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%為單因素條件,在30 ℃下發(fā)酵4 d。其中各因素固定水平為料液比為1∶2.5 g/mL,主酵溫度為30 ℃,酒曲添加量為0.25%,酵母添加量為0.25%。發(fā)酵完成后,以4500 r/min離心10 min,吸取上清液,測定酒精度與花青苷含量。

1.2.4.2 主酵工藝正交實驗 根據(jù)單因素實驗所確定的最適水平范圍,設(shè)計L9(34)正交表,以酒精度與花青苷含量為指標(biāo)確定最優(yōu)主酵工藝條件組合,因素水平如表3所示。

表3 L9(34)正交試驗因素與水平

1.2.5 測定分析方法

1.2.5.1 DE值的測定 DE值在工業(yè)上可表示淀粉的水解或糖化程度[22]。計算公式如下:

DE(%)=(水解后還原糖含量(mg/mL)-水解前還原糖含量(mg/mL))/總固形物含量(mg/mL)×100

還原糖含量的測定參照趙凱等[23]的實驗方法并略作修改。準(zhǔn)確稱取1.000 g烘干至恒重的葡萄糖,用蒸餾水定容到1 L容量瓶中,配置成1 mg/mL的葡萄糖母液。從母液中分別取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL于10 mL容量瓶中,加入7.5 mL DNS試劑,用蒸餾水定容至10 mL,充分混勻后沸水浴5 min,流水冷卻后取2 mL于10 mL試管中,加入4 mL蒸餾水混勻,于540 nm下測定吸光度。

標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1.861x+0.000619(R2=0.9998),其中x為體積(mL),y為吸光度值。

樣品測定時吸取0.5 mL樣品,加入1.5 mL DNS試劑,沸水浴5 min,流水冷卻,蒸餾水定容至10 mL,顯色定容30 min后,于550 nm處測定波長。

固形物含量的測定采用105 ℃恒重法[24]。

1.2.5.2 黃酒基本理化指標(biāo)的測定 總酸、總糖、酒精度、氨基酸態(tài)氮的測定參考文獻(xiàn)[24]的方法。

1.2.5.3 花青苷含量測定 采用雙波長pH示差法[25],吸取1 mL酒液于9 mL pH=1的緩沖液中,進(jìn)行全波長掃描,確定花青苷的最大(520 nm)及最小(700 nm)吸收波長。樣品測量時,吸取1 mL以蒸餾水稀釋40倍后樣品于10 mL容量瓶中,用pH=1與pH=4.5的緩沖液定容至10 mL?？瞻捉M與樣品處理方式相同;在40 ℃下平衡20 min后,分別于520、700 nm下測量。計算公式如下:

A=[(A520-A700)]pH1-[(A520-A700)]pH4.5

式中:C:花青苷含量(mg/L,以矢車菊素-3-葡萄糖苷計);A:吸光度;ε-矢車菊花素-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)(29600 L·mol-1·cm-1);DF:待測樣酒稀釋倍數(shù);Mw:矢車菊花素-3-葡萄糖苷的相對分子質(zhì)量(449.2 g/mol);L-光路長(1 cm)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個樣品設(shè)置三組平行實驗,采用SPSS 19.0設(shè)計正交實驗同時對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析,繪圖由Graphpad Prism 7.0完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑米黃酒最佳液化工藝條件的確定

2.1.1 液化工藝單因素實驗結(jié)果 醪液液化程度可由DE(葡萄糖當(dāng)量)值進(jìn)行評判,顏懷偉[26]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)醪液DE值控制于15%～20%左右時,有利于后續(xù)工序(液化與發(fā)酵)的進(jìn)行。液化溫度、液化時間以及高溫α-淀粉酶的添加量對液化程度的影響如圖1所示。

圖1 液化溫度、時間及酶添加量對液化程度的影響

液化溫度對醪液DE值的影響如圖1A所示,隨著液化溫度的升高,醪液DE值呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當(dāng)液化溫度為85 ℃時DE值達(dá)到峰值,而繼續(xù)提升液化溫度,DE值則開始下降,在105 ℃時DE值最低,說明隨著液化溫度的升高,高溫α-淀粉酶開始失活,導(dǎo)致醪液中水解后還原糖含量下降。因此,在此反應(yīng)體系中最適液化溫度區(qū)間在80～90 ℃。

圖1B中可看出液化時間對醪液DE值有顯著影響,隨著液化過程中酶解的進(jìn)行,DE值上升很快。在40 min時開始趨于平緩,50 min后則開始呈現(xiàn)下降趨勢。這是因為在一定時間內(nèi),淀粉在酶的作用下開始水解,而液化時間過長后,酶含量被消耗到一定程度,同時逐漸增多的酶分解物也不利于反應(yīng)的進(jìn)行,此時醪液中還原糖含量達(dá)到定值,而干物質(zhì)含量則仍處于上升趨勢,因此過長的液化時間會使DE值下降。故液化時間范圍選為40～60 min。

由圖1C可知,當(dāng)酶添加量小于50 U·g-1時,隨著酶添加量的增加,DE值不斷上升,之后則趨于下降。從生產(chǎn)成本與酶解效果兩方面綜合考慮,高溫α-淀粉酶最優(yōu)添加量在40～60 U·g-1，

2.1.2 液化正交實驗結(jié)果 結(jié)果如表4、表5所示,3個單因素對液化程度影響的主次順序為C(高溫α-淀粉酶添加量)>A(液化溫度)>B(液化時間),由方差分析可以看出,高溫α-淀粉酶添加量對DE值影響最為顯著(P<0.05),液化溫度與液化時間兩因素影響均不顯著(P>0.05)。由正交試驗所得出的最佳組合為A2B2C3,即液化溫度為85 ℃,液化時間為50 min,高溫α-淀粉酶添加量為50 U·g-1,在該組合條件下DE值可達(dá)19.77%±0.0360%。

表5 液化正交試驗結(jié)果方差分析

表4 液化L9(34)正交試驗結(jié)果

2.2 黑米黃酒最佳糖化工藝條件的確定

2.2.1 糖化工藝單因素實驗結(jié)果 糖化工藝是為了進(jìn)一步提高醪液中的還原糖含量,醪液的糖度水平與酵母菌的增殖發(fā)酵相關(guān)。糖化溫度、糖化時間與糖化酶添加量是控制糖化過程的幾個關(guān)鍵因素,以DE值為參考通過單因素實驗優(yōu)化醪液糖化工藝。三個因素與醪液DE值的關(guān)系如圖2所示。

圖2 糖化溫度、時間及酶添加量對糖化程度的影響

由圖2A可知,糖化溫度在50～70 ℃范圍內(nèi),DE值隨著溫度的升高而逐漸增大,當(dāng)溫度為70 ℃時,DE值達(dá)到最大值;隨著溫度的進(jìn)一步升高,DE值開始下降。這是由于過高的溫度使糖化酶開始失活,綜合考慮,醪液的最適糖化溫度應(yīng)為60～80 ℃范圍內(nèi)。

糖化時間與DE值的關(guān)系如圖2B所示,DE值隨糖化時間的延長而增大,當(dāng)糖化時間大于180 min時,DE值的增長開始趨于平緩,為保證糖化質(zhì)量且節(jié)約時間成本,選擇糖化時間在150～240 min范圍內(nèi)進(jìn)行正交實驗。

糖化酶添加量與醪液DE值的關(guān)系如圖2C所示,當(dāng)糖化酶添加量為50～80 U·g-1時,醪液的DE值不斷上升且增速較快;而當(dāng)添加量大于80 U·g-1時,醪液DE值增速開始趨于平緩。因此,最適糖化酶添加量應(yīng)在70～90 U·g-1之間。

2.2.2 糖化工藝正交實驗結(jié)果 結(jié)果如表6、表7所示,3個因素對糖化程度影響的主次順序為A(糖化溫度)>C(糖化酶添加量)>B(糖化時間),由方差分析可以看出,糖化溫度對DE值影響最為顯著(P<0.05),其次為糖化酶添加量,糖化時間對DE值影響不顯著(P>0.05)。由正交試驗所得出的最佳組合為A2B1C1,即糖化溫度為70 ℃,糖化時間為150 min,糖化酶添加量為70 U·g-1,該組合并未出現(xiàn)于實驗組中,補(bǔ)充實驗后該組合DE值可達(dá)68.15%±0.0264%,確定為最優(yōu)糖化工藝。

表7 糖化正交試驗結(jié)果方差分析

表6 糖化L9(34)正交試驗結(jié)果

2.3 黑米黃酒最佳主酵工藝條件的確定

2.3.1 主酵工藝單因素實驗結(jié)果 經(jīng)最佳液化工藝、糖化工藝處理后,以酒精度與花青苷含量為指標(biāo),從料液比、主酵溫度與酒曲添加量三因素優(yōu)化黑米黃酒主酵工藝。料液比、主酵溫度與酒曲添加量對主酵工藝的影響如圖3所示。

圖3 料液比、主酵溫度及曲添加量對發(fā)酵程度的影響

由圖3A可知,料液比對花青苷含量與酒精度的影響趨勢一致,當(dāng)料液比處于1∶1.5～1∶3之間時,酒精度呈上升趨勢,在料液比為1∶3時,酒精度達(dá)到最大值;繼續(xù)加大料液比后,酒精度與花青苷含量均呈現(xiàn)下降趨勢。在料液比較小時,由于發(fā)酵程度較低,導(dǎo)致還原糖未被進(jìn)一步轉(zhuǎn)換為酒精,因此酒精度也很低,此時原料中的有效成分物質(zhì)花青苷也未被充分浸漬于酒體中;而當(dāng)料液比過高時,稀釋作用則影響了酒體的酒精度[27]。因此,選擇料液比為1∶2.5～1∶3.5 g/mL進(jìn)行正交實驗。

主酵溫度對酒精度與花青苷含量的影響如圖3B所示,當(dāng)主酵溫度低于30 ℃時,酒體中花青苷含量與酒精度隨溫度上升而增加,當(dāng)溫度超過30 ℃后,花青苷含量與酒精度則開始下降。這是因為在低溫條件下,酵母菌增殖緩慢,對還原糖的利用度也較低;當(dāng)溫度過高時,酵母菌由于增殖速度過快而老化,影響了酒體的酒精度。酒體中的花青苷含量易受主酵溫度與酒精度影響為20～40 ℃。

由圖3C可得,當(dāng)酒曲添加量為0.25%時,酒精度與花青苷含量達(dá)到最大值,過高或過低時均會使酒體質(zhì)量下降。故在后續(xù)正交實驗因素中酒曲添加量范圍定為0.20%～0.30%。

2.3.2 主酵工藝正交實驗結(jié)果 由表8、表9可知,3個因素對主酵程度影響的主次順序為C(酒曲添加量)>B(主酵溫度)>A(料液比),由方差分析可以看出,酒曲添加量對DE值影響最為顯著,其次為主酵溫度(P<0.05),料液比影響不顯著(P>0.05)。由正交試驗所得出的最佳組合為A1B2C2,即料液比為1∶2.5 g/mL,主酵溫度為30 ℃,酒曲添加量為0.25%,此時,酒體酒精度為9.8%vol,花青苷含量為(298.32±0.02) mg/L,確定為最優(yōu)主酵工藝。

表9 主酵正交試驗結(jié)果方差分析

表8 主酵L9(34)正交試驗結(jié)果

2.4 最佳工藝條件下黃酒品質(zhì)檢測

在最佳液化、糖化、釀造工藝條件處理后,以20 ℃后發(fā)酵30 d,對壓榨所得酒體進(jìn)行品質(zhì)檢驗,各項指標(biāo)均合格,檢驗結(jié)果如表10所示。

表10 最佳工藝條件下黑米黃酒品質(zhì)指標(biāo)

3 結(jié)論

本研究首先以DE值為量化評價指標(biāo),采用單因素實驗與正交實驗優(yōu)化確定了雙酶液化法生產(chǎn)謝村黃酒的最佳液化及糖化工藝,隨后以酒精度與花青苷含量為指標(biāo),確定了醪液最優(yōu)發(fā)酵工藝參數(shù):即原料經(jīng)焙炒處理后添加50 U·g-1高溫α-淀粉酶,在85 ℃下液化50 min,其后加入70 U·g-1糖化酶,在75 ℃下糖化150 min。料液比為1∶2.5,主酵溫度為30 ℃,酒曲添加量為0.25%。在此工藝條件下所得謝村黃酒的酒精度為(20 ℃)10.8%vol,總糖(以葡萄糖計)為6.4 g/L,總酸為5.03 g/L,pH為4.08,花青苷含量為284.17 mg/L。酒體呈紅棕色,具有黃酒的典型特征與黑糯特有香味,酒體協(xié)調(diào),酒味醇厚。

目前,以黑糯米為釀造原料生產(chǎn)黃酒的相關(guān)研究已有不少報道。在原料處理時大多采用傳統(tǒng)“浸米-蒸飯”工序[13,28-30],致使黑米有效成分溶出,本研究以“焙炒”替代傳統(tǒng)“浸米-蒸飯”,避免了原料處理造成的浪費問題。但實驗中仍存在不足之處,焙炒處理后的米含有焦香,這對謝村黃酒香氣成分的影響仍有待進(jìn)一步的研究;黑糯米中含有大量的生理活性物質(zhì),本研究僅以主酵過程中花青苷含量進(jìn)行優(yōu)化,花青苷在酒體陳釀過程中的變化以及其他生理活性物質(zhì)在酒體中是否保留還需要進(jìn)一步研究。