D混料最優(yōu)設(shè)計(jì)優(yōu)化茶多酚微膠囊工藝及其脂肪氧化抑制作用

劉芝君,黃業(yè)傳,夏 嶼,卿 蘭,王 洋

(西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,四川綿陽(yáng) 621010)

微膠囊化過(guò)程中包埋的粒子組分被稱(chēng)為“芯材”,用來(lái)包埋芯材的聚合物被稱(chēng)為“壁材”、“殼”、“涂層”、“載體”或“密封劑”等[1]。茶多酚(TP)主要由茶葉制備而來(lái),具有抗菌和抗氧化活性,在食品工業(yè)中被作為防腐劑和抗氧化劑,特別在加工肉制品的貯藏領(lǐng)域表現(xiàn)出良好前景[2]。而多酚分子中存在不飽和鍵,使其非常不穩(wěn)定,易受氧化劑、光、熱、pH等環(huán)境因素的影響[3],且跟其他多酚一樣具有不良風(fēng)味,在加入食品或口服藥品之前必須掩蓋這些味道[4]。茶多酚微囊化就能保護(hù)其避免各種環(huán)境因素的影響,以延長(zhǎng)保質(zhì)期和穩(wěn)定性[5],防止不必要的味道和風(fēng)味[6],同時(shí)根據(jù)不同條件以受控制的形式釋放[7]。

已有許多將茶多酚添加到肉制品中抑制脂肪氧化的研究,如Faisal等[8]將綠茶提取物加入到牛肉中于4 ℃貯藏1、4、8、12 d,其研究結(jié)果表明,綠茶提取物能高效減少脂質(zhì)氧化和酸敗;Fan等[9]等通過(guò)在豬肉香腸中添加0.03%的茶多酚和不添加茶多酚的處理比較,研究發(fā)現(xiàn)茶多酚可以有效提高豬肉香腸的質(zhì)量特性并延長(zhǎng)其保質(zhì)期。茶多酚微膠囊的制備方法已相當(dāng)成熟,包括噴霧干燥[10]、冷凍干燥[11]、電噴[12]、脂質(zhì)體和納米脂質(zhì)體[13]、高速剪切均質(zhì)和高壓均質(zhì)[14]、成膜封裝[15]等,而茶多酚微膠囊在肉制品中的實(shí)際應(yīng)用還較少。

目前大多研究采用正交實(shí)驗(yàn)或Box-Behhken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化微膠囊制備工藝[16-17],本文采用混料設(shè)計(jì)中的D-optional方法優(yōu)化自組裝法制備茶多酚微膠囊,具有試驗(yàn)次數(shù)少、多目標(biāo)同步優(yōu)化、預(yù)測(cè)參數(shù)精密度高等特點(diǎn)[18],并結(jié)合電子鼻檢測(cè)不同條件處理后肉制品風(fēng)味變化情況,研究茶多酚微膠囊對(duì)豬肉脂肪氧化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮豬背肉 購(gòu)于某超市;茶多酚、殼聚糖 食品級(jí),鄭州康本生物科技有限公司;明膠 食品級(jí),河南博洋明膠有限公司;冰乙酸、無(wú)水乙酸鈉、沒(méi)食子酸、無(wú)水碳酸鈉、硫代硫酸鈉、碘化鉀、可溶性淀粉、三氯甲烷、三氯乙酸、2-硫代巴比妥酸、EDTA-2Na 均為分析純,成都科龍?jiān)噭S(chǎng);福林酚 上海源葉生物科技有限公司。

PHS-2F型pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;DF 101s集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;CR22GⅢ高速冷凍離心機(jī) 日本Hitachi Koki公司;FreeZone 2.5真空冷凍干燥機(jī) 美國(guó)LABCONCO公司;UV 1000單光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海天美科學(xué)儀器有限公司;HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州市金壇華特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備 根據(jù)GB/T 31740.2-2015 茶制品第2部分:茶多酚[19]的檢測(cè)方法進(jìn)行制備。按照福林酚法測(cè)定茶多酚含量,制備濃度分別為10、20、30、40、50 μg/mL的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,作校正標(biāo)準(zhǔn)定量茶多酚。以沒(méi)食子酸的吸光度為縱坐標(biāo)(y),其質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)作線(xiàn)性回歸,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為:y=0.0108x+0.0021,R2=0.9994。

1.2.2 茶多酚-明膠-殼聚糖納米微粒的制備 根據(jù)Chen等[20]、張力等[21]的方法,稍作修改,稱(chēng)取一定量的明膠和殼聚糖,分別溶解在0.2 mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH=5.4)中,配制成0.2%的明膠溶液和0.2%的殼聚糖溶液。稱(chēng)取一定量的茶多酚溶解在一定量的0.2%的殼聚糖溶液中,室溫下緩慢滴入裝有一定量的0.2%明膠溶液的100 mL小燒杯中,放入轉(zhuǎn)子,置于恒溫磁力攪拌器上,轉(zhuǎn)速為300 r/min,攪拌30 min,攪拌結(jié)束后在60 ℃恒溫水浴加熱20 min,即得到茶多酚-明膠-殼聚糖納米粒懸浮液。以包封率為因變量,考察體系中茶多酚、明膠、殼聚糖的合適含量。

1.2.2.1 明膠含量對(duì)可溶性復(fù)合物形成的影響 將0.2%明膠溶液滴入10 mL 0.2%殼聚糖溶液中,以試驗(yàn)體系干物質(zhì)質(zhì)量總量為1,在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定殼聚糖和明膠混合溶液質(zhì)量比(1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1)的吸光度,此時(shí)體系中明膠含量分別為0.50、0.67、0.75、0.80、0.83、0.86,0.2%殼聚糖溶液為測(cè)定的空白對(duì)照。以濁度及形成可溶性復(fù)合物的穩(wěn)定性為評(píng)價(jià)指標(biāo),探究確定體系中明膠與殼聚糖復(fù)合凝聚反應(yīng)形成可溶性復(fù)合物的合適含量[21]。

1.2.2.2 茶多酚含量對(duì)包封率的影響 試驗(yàn)體系干物質(zhì)質(zhì)量總量為1,固定明膠-殼聚糖質(zhì)量比為3∶1,稱(chēng)取一定量的茶多酚,按體系中不同的茶多酚∶明膠質(zhì)量比(1∶1、1∶2、1∶3、1∶6、1∶10)添加,此時(shí)體系中茶多酚含量分別為0.43、0.27、0.20、0.11、0.07,測(cè)定其包封率,同時(shí)結(jié)合懸浮液穩(wěn)定性確定合適的茶多酚含量范圍。

1.2.3 D-混料最優(yōu)設(shè)計(jì)優(yōu)化 納米粒制備工藝根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果運(yùn)用Design Expert 8.0.6,采用混料設(shè)計(jì)中D-optional的方法,體系中各成分干物質(zhì)含量總和為1,以體系中茶多酚含量(A)、明膠含量(B)、殼聚糖含量(C)為自變量,包封率為響應(yīng)值進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

1.2.4 不同茶多酚處理對(duì)豬肉脂肪氧化的影響 取新鮮肥瘦比例為4∶6的豬背肉,絞碎,將肉糜分成每200 g一份備用,每一組按表1分別添加不同質(zhì)量比例的茶多酚和由上述混料設(shè)計(jì)優(yōu)化配方后得到的茶多酚微膠囊,添加前用20 mL無(wú)菌蒸餾水溶解,然后與肉糜混合均勻,空白處理僅添加20 mL無(wú)菌蒸餾水。每一份肉樣平鋪于密封袋中置于4 ℃條件下冰箱中貯藏,在第0、1、2、4、6、8、10 d測(cè)定其丙二醛含量(TBARs值),并采用電子鼻測(cè)定其對(duì)風(fēng)味的影響。

表1 樣品處理

1.2.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.2.5.1 包封率的測(cè)定 將制備得到的茶多酚-明膠-殼聚糖納米懸浮液在17000×g的條件下離心30 min,取上清液按照1.2.1中的方法測(cè)定并計(jì)算茶多酚的含量,計(jì)算包封率,沉淀冷凍干燥即為茶多酚微膠囊。

1.2.5.2 TBARs值的測(cè)定 采用GB 5009.181-2016《食品安全標(biāo)準(zhǔn)食品中丙二醛的測(cè)定》的分光光度法[22]。

1.2.5.3 電子鼻測(cè)定及主成分分析 取貯藏第10 d均勻的1.0 g樣品于15 mL頂空進(jìn)樣瓶中,雙層保鮮膜封口,在常溫下放置30 min后采用頂空吸氣法進(jìn)行電子鼻檢測(cè)分析,每個(gè)樣品重復(fù)3次。電子鼻的采樣參數(shù)設(shè)置為:樣品測(cè)定間隔時(shí)間1 s,傳感器自動(dòng)清洗時(shí)間60 s,傳感器歸零時(shí)間10 s,進(jìn)樣準(zhǔn)備時(shí)間5 s,分析采樣時(shí)間70 s,進(jìn)樣流量400 mL/min。隨后提取電子鼻各傳感器特征值,利用PEN3傳感器配套的Winmuster軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(PCA)。為保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和精確度,選取測(cè)定過(guò)程中的50～52 s的數(shù)據(jù)用于后續(xù)分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次,利用Excel、SPSS及Design-Expert軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并加以分析。不同平均值之間采用鄧肯多重比較進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn),P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 茶多酚-明膠-殼聚糖微粒的制備

2.1.1 明膠含量對(duì)可溶性復(fù)合物形成的影響 由圖1可知,隨著明膠在體系中的含量增加,體系吸光度緩慢上升,濁度增加。試驗(yàn)中使用明膠為B型明膠,其等電點(diǎn)為4.8,體系pH為5.4高于其等電點(diǎn),則此時(shí)明膠帶負(fù)電荷,而殼聚糖因含有大量氨基在此條件下帶正電荷,二者通過(guò)兩性靜電相互作用產(chǎn)生復(fù)合凝聚反應(yīng),形成凝聚物[23]。當(dāng)兩者比例超過(guò)3∶1,即明膠含量超過(guò)0.75時(shí)體系濁度迅速增大,且有白色絮狀凝聚物析出,體系不穩(wěn)定,故確定明膠含量范圍為0.50～0.75。

圖1 明膠含量對(duì)聚合物濁度的影響

2.1.2 茶多酚含量對(duì)包封率的影響 由圖2可知隨體系中茶多酚含量增加,茶多酚微膠囊包封率也顯著增加,在茶多酚處于較低含量時(shí),體系呈現(xiàn)為乳光懸浮液,超過(guò)一定含量后,體系有絮凝沉淀產(chǎn)生。當(dāng)茶多酚含量超過(guò)0.43時(shí),茶多酚在體系中溶解性變差,形成大塊絮凝。根據(jù)張茵等[23]研究結(jié)果表明隨著茶多酚含量的增加,其包封率增大,粒徑也在增大,但超過(guò)一定比例后,其粒徑超過(guò)微粒要求,且懸浮液不穩(wěn)定,則確定茶多酚含量范圍為0.20～0.43。

圖2 茶多酚含量對(duì)包封率的影響

2.2 不同配比對(duì)包封率的影響

2.2.1 D-混料最優(yōu)設(shè)計(jì) 以試驗(yàn)體系中干物質(zhì)質(zhì)量總和為1,由2.1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到各因素實(shí)際含量,實(shí)驗(yàn)采用D-optional混料設(shè)計(jì),經(jīng)試驗(yàn)設(shè)計(jì)調(diào)整后確定體系中茶多酚含量為0.25～0.40,明膠含量為0.50～0.65,殼聚糖含量為0.10～0.25,考察茶多酚-明膠-殼聚糖納米粒包封率,試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表3所示。以包封率為響應(yīng)值,應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行二次項(xiàng)式回歸分析,得到數(shù)學(xué)模型如下:

表3 D-混料最優(yōu)設(shè)計(jì)及結(jié)果

包封率=51.07A+39.71B+40.05C+1.93AB+10.73AC+4.72BC

表2 混料設(shè)計(jì)因素和水平表

表4 試驗(yàn)結(jié)果方差分析

從圖3中可以看出,響應(yīng)面基本呈現(xiàn)出曲面趨勢(shì),說(shuō)明各組分之間存在交互作用。從得到的數(shù)學(xué)模型和圖3中可以看出茶多酚含量對(duì)包封率的影響最大,隨含量在一定范圍內(nèi)增大,包封率隨之顯著提高,在體系茶多酚含量較低時(shí),茶多酚分子未與明膠分子進(jìn)行期望的氫鍵或疏水作用力相互交聯(lián)進(jìn)行包埋行為,而是通過(guò)弱相互作用力依附在明膠分子表面[24],試驗(yàn)測(cè)試包封率時(shí)通過(guò)高轉(zhuǎn)速離心力可以使其小分子分離,導(dǎo)致在低茶多酚含量時(shí)包封率較低。

圖3 不同配比對(duì)包封率的影響

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 采用Design Expert 8.0.6軟件的優(yōu)化功能,以最大包封率為目標(biāo)進(jìn)行配方優(yōu)選,選擇期望值最大的一組進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。得到最優(yōu)配方為茶多酚含量為0.40、明膠含量為0.50、殼聚糖含量為0.10,預(yù)測(cè)包封率為51.10%;按最優(yōu)配方進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),三次實(shí)驗(yàn)重復(fù),得到實(shí)際包封率為50.87%±0.25%,與實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)值接近,說(shuō)明采用D-混料最優(yōu)設(shè)計(jì)進(jìn)行茶多酚-明膠-殼聚糖微膠囊的工藝優(yōu)化配方較準(zhǔn)確。張力[21]采用自組裝法以殼聚糖濃度、明膠濃度、丁香酚濃度為正交試驗(yàn)試驗(yàn)指標(biāo),優(yōu)化丁香酚-明膠-殼聚糖納米微粒的制備工藝,得到丁香酚-明膠-殼聚糖納米微粒的最優(yōu)工藝下包封率為 50.69%,與本方法試驗(yàn)結(jié)果相似。

2.3 不同茶多酚處理對(duì)豬肉脂肪氧化的影響

2.3.1 不同茶多酚處理對(duì)豬肉TBARs值的影響 TBARs值通常用來(lái)評(píng)價(jià)動(dòng)物性食品中脂肪氧化分解程度,是脂肪分解所產(chǎn)生的衍生物,如丙二醛等與TBA反應(yīng)的值,能夠反應(yīng)脂肪氧化程度[19]。在新鮮豬肉糜中添加不同比例的茶多酚及茶多酚微膠囊,其TBARs值在貯藏期間的變化如表5所示,添加不同茶多酚各組TBARs值在貯藏期的第1 d表現(xiàn)出下降,其原因可能是氧化產(chǎn)物丙二醛與冷卻肉中活性氨基作用生成1-氨基-3-氨基丙烯,從而導(dǎo)致TBARs值下降[23];隨貯藏時(shí)間的增加,各處理TBARs值也明顯增加,且貯藏期間(0 d除外)對(duì)照組TBARs值均顯著高于添加茶多酚和微膠囊處理組(P<0.05),說(shuō)明添加茶多酚或者微膠囊茶多酚均能有限抑制脂肪氧化。與尹愛(ài)武等[25]研究刺兒茶多酚對(duì)冷卻豬肉保鮮效果研究結(jié)果相同;孫承鋒等[26]研究蘋(píng)果多酚對(duì)對(duì)鮮肉色澤穩(wěn)定性及脂肪氧化的影響結(jié)果表明添加0.01%～0.1%的蘋(píng)果多酚能較好抑制脂肪氧化,隨著蘋(píng)果多酚添加量的增大,其抗氧化作用增強(qiáng),TBARs值降低。有資料提出良質(zhì)肉TBARs值≤0.664 mg/kg,TBARs值>0.5 mg/kg會(huì)有氧化異味產(chǎn)生,變質(zhì)肉TBARs值>1 mg/kg[19]。貯藏前4 d,添加不同狀態(tài)0.01%茶多酚的B、E組TBARs值無(wú)顯著差異,C、D組TBARs值則顯著高于F、G組(P<0.05),說(shuō)明使用本方法制的茶多酚微膠囊能達(dá)到良好的脂肪氧化抑制效果。處理第6～10 d,添加茶多酚的B、C、D組TBARs值顯著高于添加相同含量茶多酚微膠囊的E、F、G組(P<0.05),說(shuō)明茶多酚微膠囊的緩釋作用能有效延長(zhǎng)茶多酚的抗氧化效力。處理第10 d,肉樣TBARs值明顯增加，除A組TBARs值>1 mg/kg,其余六組TBARs值仍保持在較低水平(≤0.664 mg/kg)；E、F、G組分別使豬肉TBARs值較A組降低85.7%、89.4%和91.5%,較B、C、D組分別降低了67.7%、46.0%、50.7%。D組最終TBARs值為0.219 mg/kg,E組為0.183 mg/kg,說(shuō)明添加0.01%的茶多酚微膠囊就能達(dá)到添加0.05%茶多酚的脂肪氧化抑制效果,可能是明膠蛋白和殼聚糖通過(guò)靜電相互作用增強(qiáng)了芯材的穩(wěn)定性和生物活性[27],使其脂肪氧化抑制效果更加顯著,以此達(dá)到減少茶多酚用量的效果。

表5 不同茶多酚對(duì)豬肉TBARs值的影響(mg/kg)

2.3.2 不同茶多酚處理對(duì)豬肉風(fēng)味的PCA分析 主成分分析(PCA)是將傳感器提取的多元因子進(jìn)行降維、簡(jiǎn)化和數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換等,提取幾個(gè)特征值(能較大程度上反映樣本信息變量的因子)進(jìn)行線(xiàn)性分類(lèi),最后得到可視化的二維散點(diǎn)圖,散點(diǎn)圖上PC1軸和PC2軸包含第一主成分和第二主成分的貢獻(xiàn)率,貢獻(xiàn)率用來(lái)反映原始數(shù)據(jù)信息,貢獻(xiàn)率越大越能最大限度的反映樣本的原本特征[28]。圖4中的每個(gè)橢圓代表同批次豬肉風(fēng)味的數(shù)據(jù)采集點(diǎn),PCA分析中第一主成分的方差貢獻(xiàn)率為98.82%,第二主成分的方差貢獻(xiàn)率為0.94%,貢獻(xiàn)率總和達(dá)到99.76%,大于95%以上,說(shuō)明PC1和PC2已經(jīng)包含足夠的信息量,可以代表樣品揮發(fā)性風(fēng)味的主要特征。因PC1貢獻(xiàn)率遠(yuǎn)大于PC2的貢獻(xiàn)率,表明樣品間的差異主要在PC1上,樣品在橫坐標(biāo)上距離越大,其差異也越大。從主成分PC1和PC2兩個(gè)主軸上看,貯藏10 d后空白組(A)的信息采集點(diǎn)的橢圓位于效果圖右邊,與添加茶多酚各處理組無(wú)交叉重疊,說(shuō)明貯藏10 d后的空白組(A)與添加茶多酚各處理組在風(fēng)味上有較大差別。

圖4 不同茶多酚處理對(duì)豬肉風(fēng)味的PCA分析

表6中數(shù)值代表各組區(qū)分度大小,其值越接近1區(qū)分度越大,說(shuō)明區(qū)分越明顯。B組與E組區(qū)分度較差,C組與E、F、G組區(qū)分度較差,E組與F、G組區(qū)分度較差,與TBARs結(jié)果有一定差異。相洋[29]研究了幾種天然保鮮劑對(duì)冷鮮豬肉保鮮效果,運(yùn)用GC-MS對(duì)經(jīng)過(guò)處理的冷卻豬肉揮發(fā)性組分進(jìn)行了分析,其結(jié)果表明加入保鮮劑后,豬肉中烴類(lèi)物質(zhì)、醛類(lèi)物質(zhì)和酯類(lèi)物質(zhì)含量明顯減少,而其它類(lèi)物質(zhì)的含量明顯增加,醇類(lèi)物質(zhì)、酮類(lèi)物質(zhì)和羧酸類(lèi)物質(zhì)變化不大,其原因?yàn)樘砑拥奶烊槐ｕr劑自身香氣較為濃郁,揮發(fā)性成分豐富,對(duì)冷卻豬肉含有的部分氣味有所掩蓋。本試驗(yàn)中可能是除脂肪氧化產(chǎn)生的風(fēng)味外,添加的不同茶多酚自身攜帶一些味道,脂肪氧化程度較低時(shí),在一定程度上掩蓋了脂肪氧化味,則其風(fēng)味差異不明顯。雖然D組脂肪氧化指標(biāo)處于較低水平,但其風(fēng)味與其余組仍存在較為顯著的差異,可能是因?yàn)楦邼舛鹊牟瓒喾犹砑訒?huì)嚴(yán)重影響豬肉本身的風(fēng)味,而同處在較高添加量的G組,由于微膠囊包埋掩蓋了茶多酚本身的風(fēng)味,則在實(shí)際應(yīng)用中能減少對(duì)風(fēng)味的影響。TBARs值測(cè)定結(jié)果表示A組處于變質(zhì)肉水平,其余組均處于良質(zhì)肉水平,脂肪氧化導(dǎo)致肉變質(zhì),出現(xiàn)明顯的脂肪氧化味,其電子鼻測(cè)定結(jié)果與TBARs值結(jié)果保持一致,說(shuō)明電子鼻能較好區(qū)分變質(zhì)肉與良質(zhì)肉。

表6 不同茶多酚處理豬肉風(fēng)味PCA分析數(shù)據(jù)矩陣表

3 結(jié)論

利用Design Expert 8.0.6軟件中的D-optional混料設(shè)計(jì)對(duì)自組裝法制備茶多酚-明膠-殼聚糖微粒配方進(jìn)行優(yōu)化,得到最優(yōu)配方為茶多酚含量為0.40、明膠含量為0.50、殼聚糖含量為0.10,其包埋率為為50.87%±0.25%。以得到的最優(yōu)配方制備得到茶多酚微膠囊在豬肉中按一定比例添加后還能有效抑制脂肪氧化,添加0.01%、0.03%和0.05%的茶多酚微膠囊能分別使豬肉TBARs值較未添加茶多酚的空白組降低85.7%、89.4%和91.5%;分別較添加0.01%、0.03%和0.05%的茶多酚組降低67.7%、46.0%、50.7%；電子鼻測(cè)定結(jié)果也顯示，添加不同茶多酚處理組的風(fēng)味與空白組有較大區(qū)別，說(shuō)明得到的茶多酚微膠囊能有效抑制脂肪氧化，延長(zhǎng)豬肉的保藏時(shí)間。此外，高濃度的茶多酚也會(huì)嚴(yán)重影響豬肉的風(fēng)味，因此，將茶多酚微膠囊化，除了能提高茶多酚的穩(wěn)定性、保持其抗氧化活性外，還能掩蓋其自身的異味，以此可減少其在食品加工中的添加量。