蒲公英甾醇調(diào)控膀胱癌T24細(xì)胞遷移與侵襲能力的作用及機(jī)制研究

陳 翔，鄭 雷，陳大可，張 杰

關(guān)鍵字：蒲公英甾醇；膀胱癌；遷移與侵襲；Akt/mTOR；SDF-1/CXCR4

膀胱癌是臨床常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)腫瘤，其發(fā)病部位通常位于膀胱黏膜，其發(fā)病率在泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤中高達(dá)90%以上[1]。膀胱癌好發(fā)于中老年群體，其中男性患者數(shù)量遠(yuǎn)高于女性。臨床通常表現(xiàn)為：血尿，膀胱刺激征，且伴有間歇性、無(wú)痛性，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[2]。我國(guó)膀胱癌患者中90%以上是膀胱尿路上皮癌，其中肌層浸潤(rùn)性約占30%，非肌層浸潤(rùn)性約占70%，但其中約10%～20%的非肌層浸潤(rùn)性患者可進(jìn)展為肌層浸潤(rùn)性膀胱癌，通常采用根治性膀胱癌切除術(shù)治療肌層浸潤(rùn)性膀胱癌，但易遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)，手術(shù)失敗率較高，五年生存率并不理想[3-4]。因此如何減少膀胱癌復(fù)發(fā)及控制癌細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，是有效降低患者病死率的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)化療可明顯改善膀胱癌患者的預(yù)后及生存，但因化療不良反應(yīng)嚴(yán)重，且易產(chǎn)生耐藥性[5]。因此尋找新的抗腫瘤藥物對(duì)于維護(hù)膀胱癌患者的生命健康具有重大意義。近年來(lái)，天然化合物因其療效明確、不良反應(yīng)小等特點(diǎn)，受到越來(lái)越多的關(guān)注。在已批準(zhǔn)上市用于抗腫瘤的藥物中，約有70%來(lái)源于天然植物[6]。蒲公英為菊科植物蒲公英（TaraxacummongolicumHand Mazz.）、堿地蒲公英（T.sinicumKitag.）或同屬數(shù)種植物的干燥全草，始載于《唐本草》，味苦甘、性寒、無(wú)毒，有清熱解毒、消腫散結(jié)、利尿通淋等功效[7]?，F(xiàn)代藥理發(fā)現(xiàn)，蒲公英具有抗菌、抗炎、利膽保肝及增強(qiáng)免疫等作用，臨床常用于癤癰、急性乳腺炎或感冒等疾病的治療[8]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，蒲公英具有良好的抗腫瘤活性[9]，其黃酮、酚酸、植物甾醇類等成分在抗氧化、抗腫瘤、抗菌消炎等方面均表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)[10]。其重要成分蒲公英甾醇對(duì)膀胱癌是否具有良好的生物活性目前尚不清晰。本課題擬體外培養(yǎng)膀胱癌細(xì)胞并加入蒲公英甾醇進(jìn)行干預(yù)，考察蒲公英甾醇對(duì)膀胱癌的作用及機(jī)制，為膀胱癌的藥物研發(fā)提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 蒲公英甾醇（≥98%，批號(hào)127-22-0），購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司；FBS、胰蛋白酶、P/S、RPMI 1640培養(yǎng)基，購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；BCA蛋白定量試劑、PBS、TBS，購(gòu)自上海碧云天公司；Transwell小室，購(gòu)自美國(guó)Corning公司；Matrigel基質(zhì)膠，購(gòu)自美國(guó)BD公司；基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9 ELISA試劑盒，購(gòu)自上海酶聯(lián)生物公司；蛋白激酶B(Akt)、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（SDF-1）、CXCR-4兔抗人一抗及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗，購(gòu)自Cell Signaling Technology公司；ECL發(fā)光試劑盒，購(gòu)自美國(guó)Pierc公司；細(xì)胞工作臺(tái)、細(xì)胞孵育箱、電泳和轉(zhuǎn)膜儀、酶標(biāo)儀，購(gòu)自美國(guó)Bio-rad公司；倒置熒光顯微鏡，購(gòu)自日本Nikon公司。

1.2 細(xì)胞株 人膀胱移行細(xì)胞癌T24細(xì)胞株，由上海細(xì)胞研究所提供。配制含10% FBS、1% P/S的RPMI 1640培養(yǎng)基，隨后復(fù)蘇細(xì)胞，并在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。隔日更換一次培養(yǎng)基，待細(xì)胞融合80%～90%進(jìn)行傳代，至2～3代時(shí)開(kāi)展細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.3 劃痕實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的膀胱癌細(xì)胞置入6孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)用200 μL移液槍頭在中間劃直線，確保每次劃痕寬度一致。采用無(wú)菌PBS液清洗孔內(nèi)脫落細(xì)胞，再加入完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)并加入不同濃度（10、20及40 μg/mL）的蒲公英甾醇進(jìn)行干預(yù)。分別在劃痕0 h及24 h后置顯微鏡下進(jìn)行觀測(cè)，評(píng)估細(xì)胞遷移情況，并根據(jù)劃痕愈合率對(duì)給藥前后細(xì)胞遷移能力進(jìn)行考察。

1.4 Transwell小室法 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的膀胱癌細(xì)胞，將其稀釋到5×104濃度后取200 μL加入到包被有Matrigel的Transwell上室，各組孔內(nèi)分別滴加不同濃度（10、20及40 μmol/L）的蒲公英甾醇進(jìn)行干預(yù)，同時(shí)在下室中加入完全培養(yǎng)基，隨后放置在細(xì)胞孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束，用棉簽輕柔擦凈上室面未穿過(guò)膜層的膀胱癌細(xì)胞，并置入甲醛進(jìn)行固定。20 min后常溫晾干，采用結(jié)晶紫染色20 min，用預(yù)冷的PBS進(jìn)行清洗，并放置顯微鏡下進(jìn)行觀測(cè)。

1.5 ELISA法檢測(cè) 取細(xì)胞上清液，低溫經(jīng)3500 r/min離心5 min后，分離上層液并將其儲(chǔ)存在-20 ℃條件下。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)上清液中MMP-2及MMP-9的含量。

1.6 Western boltting法檢測(cè) 將細(xì)胞低溫裂解后制備細(xì)胞蛋白樣本，對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定。將樣本根據(jù)10% SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離，隨后在轉(zhuǎn)膜儀中將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜。PBS漂洗、加入5% BSA封閉后滴加一抗（SDF-1、CXCR4、p-Akt、Akt、p-mTOR 及 mTOR，1:1000），放置在-4 ℃冰箱中孵育過(guò)夜。12～18 h后在室溫中加入二抗進(jìn)行孵育30 min，PBS漂洗后滴加ECL液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，放置在成像儀中顯影成像。使用Image J軟件分析各組蛋白灰度值，以β-Tubulin作為內(nèi)參進(jìn)行比對(duì)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件包分析，計(jì)量資料的數(shù)據(jù)以表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組T24細(xì)胞遷移能力比較 在膀胱癌細(xì)胞中加入不同濃度（10、20及40 μg/mL）蒲公英甾醇均可抑制膀胱癌細(xì)胞的遷移能力。與空白對(duì)照組比較，各蒲公英甾醇給藥組均可顯著降低膀胱癌細(xì)胞的遷移率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)圖1。

圖1 各組T24細(xì)胞的遷移能力比較

2.2 各組T24細(xì)胞侵襲能力比較 在膀胱癌細(xì)胞中給予蒲公英甾醇干預(yù)處理后，其侵襲能力也降低。與空白對(duì)照組比較，不同濃度（10、20、40 μg/mL）蒲公英甾醇均可明顯減少侵襲細(xì)胞數(shù)量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中以20及40 μg/mL的蒲公英甾醇作用最優(yōu)。見(jiàn)圖2。

圖2 各組T24細(xì)胞的侵襲能力比較

2.3 各組T24細(xì)胞SDF-1及CXCR4的表達(dá)水平比較 在調(diào)控SDF-1表達(dá)方面：與空白對(duì)照組比較，不同濃度（10、20及40 μg/mL）蒲公英甾醇均可明顯降低膀胱癌細(xì)胞中SDF-1的表達(dá)水平（P＜0.05），其中以20及40 μg/mL蒲公英甾醇下調(diào)作用最為顯著（P＜0.01）；在調(diào)控CXCR4表達(dá)方面：與空白對(duì)照組比較，20及40 μg/mL的蒲公英甾醇可顯著降低膀胱癌細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)水平（P＜0.01），而10 μg/mL的蒲公英甾醇組與空白對(duì)照組比較未見(jiàn)明顯差異（P＞0.05）。見(jiàn)圖3。

2.4 各組T24細(xì)胞p-Akt及p-mTOR的表達(dá)水平比較 在調(diào)控Akt活化方面：與空白對(duì)照組比較，不同濃度（10、20及40 μg/mL）蒲公英甾醇均可明顯降低膀胱癌細(xì)胞中p-Akt的表達(dá)水平（均P＜0.05），其中以20及40 μg/mL的蒲公英甾醇下調(diào)作用最顯著（P＜0.01）；在調(diào)控mTOR活化方面：與空白對(duì)照組比較，20及40 μg/mL的蒲公英甾醇可顯著降低膀胱癌細(xì)胞中p-mTOR的表達(dá)水平（P＜0.01），而10 μg/mL的蒲公英甾醇組與空白對(duì)照組比較未見(jiàn)明顯差異（P＞0.05）。見(jiàn)圖4。

圖3 各組T24細(xì)胞中SDF-1及CXCR4蛋白表達(dá)水平比較

圖4 各組T24細(xì)胞中Akt及mTOR蛋白活化水平比較

3 討論

膀胱癌屬臨床高發(fā)病率的腫瘤性疾病，嚴(yán)重影響患者生理機(jī)能及生活質(zhì)量，甚至導(dǎo)致死亡?！栋螂装┰\療規(guī)范2018》表明，膀胱癌發(fā)病率在全球腫瘤疾病中高居11位，死亡率位于13位，在男性惡性腫瘤中排第9位[11]。研究發(fā)現(xiàn)，膀胱癌的發(fā)病可能與膀胱炎癥、吸煙、遺傳等因素有關(guān)[12]，而其中致癌基因與抑癌基因參與了膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展[13]。中醫(yī)通常將膀胱癌歸屬于“尿血”“血淋”、“癃閉”等范疇，瘀毒內(nèi)蘊(yùn)是其重要病機(jī)，通常采用活血化瘀、化痰散結(jié)、排毒利尿等治法進(jìn)行干預(yù)[14]。西醫(yī)在膀胱癌治療中方法多樣，但無(wú)論手術(shù)治療還是放、化療等對(duì)身體損傷嚴(yán)重，預(yù)后亦不理想。而中藥在對(duì)抗膀胱癌的過(guò)程中取得了長(zhǎng)足進(jìn)步，較好地彌補(bǔ)了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)不足之處[15]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)膀胱癌轉(zhuǎn)移是膀胱癌致死的關(guān)鍵，因此針對(duì)抗膀胱癌細(xì)胞侵襲及遷移的藥物發(fā)現(xiàn)成了研究熱點(diǎn)[16]?；谄压⒕哂星鍩峤舛?、消腫散結(jié)、利尿通淋等功效[7]，筆者深入考察了其重要成分蒲公英甾醇干預(yù)膀胱癌細(xì)胞遷移及侵襲的作用與機(jī)制。

腫瘤微環(huán)境主要包括局部的各類細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)及相關(guān)細(xì)胞因子等，其中細(xì)胞外基質(zhì)作為腫瘤的組織學(xué)屏障，通過(guò)使其降解可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移與侵襲[17]。MMP是降低細(xì)胞外基質(zhì)的關(guān)鍵蛋白酶，對(duì)維持機(jī)體正常生理功能具有重要意義。其中MMP-2及MMP-9是目前的研究熱點(diǎn)，其可通過(guò)破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障，繼而加速腫瘤細(xì)胞的遷移與侵襲[18]。本研究結(jié)果顯示，蒲公英甾醇可以抑制T24細(xì)胞中MMP-2及MMP-9的分泌，同時(shí)抑制了T24細(xì)胞的遷移率及侵襲細(xì)胞數(shù)。提示蒲公英甾醇通過(guò)減少膀胱癌細(xì)胞MMP-2及MMP-9的分泌，繼而抑制其遷移及侵襲能力。SDF-1是趨化因子家族的重要成分，與機(jī)體心血管及神經(jīng)系統(tǒng)生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)SDF-1對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖與遷移也發(fā)揮調(diào)控作用[19-20]。SDF-1與其受體CXCR4結(jié)合后可激活下游信號(hào)傳導(dǎo)，釋放多種效應(yīng)因子，繼而參與調(diào)控細(xì)胞增殖、趨化、遷移及黏附等功能[21]?；罨蟮腟DF-1/CXCR4信號(hào)通路可有效促進(jìn)Akt/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)[22]，而通過(guò)抑制Akt和mTOR磷酸化，可有效降低MMP-2及MMP-9表達(dá)水平，防止膀胱癌細(xì)胞的遷移與侵襲[23-24]。已有研究證實(shí)，SDF-1/CXCR4在膀胱癌中呈高水平表達(dá)狀態(tài)，參與介導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞的侵襲能力[25]。本研究結(jié)果顯示，膀胱癌細(xì)胞中SDF-1、CXCR4、p-Akt及p-mTOR的表達(dá)水平可同時(shí)受蒲公英甾醇下調(diào)而降低。由此提示，蒲公英甾醇可通過(guò)抑制SDF-1/CXCR4信號(hào)通路，繼而調(diào)控Akt/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)，最終干擾膀胱癌細(xì)胞中MMP-2及MMP-9分泌。

綜上所述，膀胱癌細(xì)胞具有高度的遷移與侵襲能力，而該類細(xì)胞功能可受蒲公英甾醇逆轉(zhuǎn)。其相關(guān)具體機(jī)制主要為：蒲公英甾醇通過(guò)抑制膀胱癌細(xì)胞中SDF-1/CXCR4信號(hào)通路，降低下游通路中Akt及mTOR活化水平，減少了MMP-2、MMP-9分泌，繼而削弱了膀胱癌細(xì)胞的遷移與侵襲能力。