正交法優(yōu)選柔毛淫羊藿生品炮制工藝研究*

張 敏，李 瑋，王先菊，劉婭琴，魏洪利，杜洪志

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025)

淫羊藿為小檗科植物淫羊藿EpimediumbrevicomuMaxim、箭葉淫羊藿Epimediumsagittatum(Sieb.et Zucc.) Maxim、柔毛淫羊藿EpimediumpubescensMaxim.或朝鮮淫羊藿EpimediumkoreanumNakai的干燥葉[1]。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為中品，具有祛風(fēng)除濕、補腎壯陽、增強免疫、保護心血管等功效。主要分布在長江流域。在吉林、遼寧、甘肅、山西、陜西、浙江、安徽、福建、江西、四川、貴州等地均有分布。淫羊藿中有黃酮類、苯酚苷類、木酯素類、多糖類、生物堿類、色酮類等化學(xué)成分[2]。淫羊藿苷為淫羊藿的主要活性成分之一，具有增強機體免疫力[3]、延緩衰老[4]、抗病毒、抗腫瘤、改善并保護心腦血管[5]、促進成骨細胞增殖[6]、抗骨質(zhì)疏松[7]、抗動脈粥樣硬化[8]、擬雌性激素[9]等作用。淫羊藿在現(xiàn)今醫(yī)藥領(lǐng)域用處廣泛，為貴州省同濟堂制藥有限公司主打產(chǎn)品“仙靈骨葆膠囊”中主要配方藥物之一。該品種藥物在2013年銷售額就已經(jīng)達到8.5億元。

淫羊藿歷代炮制方法主要有羊油脂炙、酒炙、米泔水浸制等，現(xiàn)代炮制方法主要為羊油炙，有關(guān)淫羊藿飲片炮制中最基本的切制研究甚少，2015版《中國藥典》中收載的淫羊藿飲片炮制工藝為：除去雜質(zhì)，噴淋清水，稍潤，切絲，干燥，并未記載具體的工藝參數(shù)，不利于企業(yè)規(guī)范化及大規(guī)?；a(chǎn)。本研究以淫羊藿苷含量為優(yōu)化切制工藝參數(shù)的指標，采用高效液相色譜法測定其含量，設(shè)計正交試驗以優(yōu)選出柔毛淫羊藿切制最佳工藝，將其工藝參數(shù)具體化。

1 儀器、試劑

1.1 儀器

LC-20AT 230V高效液相色譜儀(日本島津制作所)；JA2003型千分之一電子分析天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；ME204E型萬分之一電子分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；ZT-150型高速多功能粉碎機(永康市展帆市工貿(mào)有限公司)；HS10260D型超聲波清洗機(天津恒奧科技發(fā)展有限公司)；CS101-1C型鼓風(fēng)干燥箱(重慶四達實驗儀器廠)；SHZ-D III型循環(huán)水式真空泵 (鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)。

1.2 試劑

淫羊藿苷對照品(購自中國食品藥品檢定研究院，ID：TBJ6-WPU3，批號：11504-20154，經(jīng)面積歸一化處理含量>99%)；乙腈(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號：20180113，色譜純)；無水乙醇(重慶川東化工(集團)有限公司，批號：20180801，分析純)；甲醇(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號：20180226，色譜純)；水為娃哈哈純凈水。淫羊藿藥材采自貴州省貴陽市修文縣龍場鎮(zhèn)原慶文廠，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院魏升華教授鑒定為小檗科植物柔毛淫羊藿EpimediumpubescensMaxim的干燥葉。

2 方法

2.1 炮制方法

2.1.1 單因素試驗

為考察炮制過程中浸潤時間、浸潤水量、切絲寬度、干燥溫度等因素對淫羊藿飲片品質(zhì)的影響，設(shè)計以下單因素試驗進行考察。

1)浸潤時間 取淫羊藿原藥材，除去雜質(zhì)，分4份，每份10 g，加入藥重的 1倍水量分別浸潤0.5 h、1 h、2 h、3 h，切成2～4 mm寬的絲，在60 ℃下干燥至同等干燥程度，備用。

2)浸潤水量 取淫羊藿原藥材，除去雜質(zhì)，分成4份，每份10 g，分別加入藥重的0倍(即不加水)、0.5倍、1倍、1.5倍水量浸潤0.5 h，切成2～4 mm寬的絲，在60 ℃下干燥至同等干燥程度，備用。

3)切絲寬度 取淫羊藿原藥材，除去雜質(zhì)，分成3份，稱重，每份10 g，加入藥重的1倍水量浸潤0.5 h，分別切成1～2 mm、2～4 mm、4～6 mm寬的絲，分別在60 ℃下干燥至同等干燥程度，備用。

4)干燥溫度 取淫羊藿原藥材，除去雜質(zhì)，分成4份，稱重，每份10 g，加入藥重的1倍水量浸潤0.5 h，切成2～4 mm寬的絲，分別在40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃下干燥至同等干燥程度，備用。

2.1.2 正交試驗

考慮不同單因素之間可能存在相互間的影響，根據(jù)單因素考察結(jié)果，以L9(34)正交設(shè)計優(yōu)選淫羊藿最佳炮制工藝條件，試驗因素及水平見表1。

表1 正交試驗L9(34)因素及水平Tab.1 Factors and levels of L9(34) orthogonal test

2.2 淫羊藿苷的含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：SN：10375993 Therm色譜柱(Dim.(mm)250×4.6)；流動相：乙腈-水(30∶70)；檢測波長：270 nm；進樣量：10 μL；流速：1 mL/min。

2.2.2 對照品溶液的制備

精密取淫羊藿苷對照品適量，加甲醇溶解制得濃度為0.25 mg/mL的淫羊藿苷對照品儲備液。

2.2.3 供試品溶液制備

取淫羊藿樣品粉末0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇20 mL，稱定重量，超聲處理1 h，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取不同體積“2.2.2”項下制備的對照品儲備液，加適量的甲醇溶液制成淫羊藿苷濃度分別為0.25 mg/mL、0.20 mg/mL、0.1875 mg/mL、0.15 mg/mL、0.14 mg/mL、0.125 mg/mL、0.09375 mg/mL，按上述色譜條件測定其含量。

2.2.5 樣品測定

取樣品粉末，按照“2.2.3”項下制備供試品溶液，按照“2.2.1”項下色譜條件進行測定，計算含量。

2.3 最佳工藝驗證

為驗證優(yōu)選出的最佳炮制工藝的科學(xué)性、穩(wěn)定性和可重復(fù)性，對正交試驗優(yōu)選出的最佳切制工藝進行3批次驗證性試驗。取柔毛淫羊藿生品3份，每份3個平行樣，以最佳炮制工藝條件炮制淫羊藿，測定淫羊藿苷的含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 線性關(guān)系

以峰面積值為縱坐標(Y)，進樣濃度為橫坐標(X)進行線性回歸，得淫羊藿苷的回歸方程為：y=2E+07x-140867.90(R2=0.9996)。結(jié)果表明淫羊藿苷在0.94～2.5 μg范圍線性關(guān)系良好。

3.2 單因素分析

3.2.1 浸潤時間

在浸潤時間分別為0.5 h、1 h、2 h、3 h時，柔毛淫羊藿中淫羊藿苷的質(zhì)量分數(shù)分別為1.90%、1.6%、1.62%、1.21%。方差分析P<0.05，說明差異具有顯著意義。當浸潤時間為0.5 h時，柔毛淫羊藿中淫羊藿苷的含量最高。隨著浸潤時間的增大，淫羊藿苷含量呈下降趨勢，因此考慮浸潤時間為0.5 h。

3.2.2 浸潤水量

在浸潤水量為0倍、0.5倍、1倍、1.5倍水量的條件下，淫羊藿苷的質(zhì)量分數(shù)分別為1.97%、1.91%、1.85%、1.81%。由方差分析P<0.05，差異具有顯著意義，且浸潤水量為0倍時，淫羊藿苷含量最高，因此選擇0倍水量浸潤為宜。

3.2.3 切絲寬度

在切絲寬度為1～2 mm、2～4 mm、4～6 mm的條件下，淫羊藿苷質(zhì)量分數(shù)分別為2.07%、2.01%、2.07%。由方差分析P>0.05，可知切絲寬度對淫羊藿苷含量的影響無顯著性差異。結(jié)合實際生產(chǎn)綜合考慮，以2～4 mm的切絲寬度為宜。

3.2.4 干燥溫度

在干燥溫度為40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃的條件下，淫羊藿苷質(zhì)量分數(shù)分別為1.99%、1.87%、2.20%、1.76%，方差分析P<0.05，差異具有顯著性。當干燥溫度為60 ℃時，其含量最高，因此考慮干燥溫度以60 ℃為宜。

3.3 正交試驗結(jié)果

由方差分析表(表2)可知，不同的浸潤水量相比較具有顯著性差異(P<0.05)，浸潤時間、干燥溫度對淫羊藿質(zhì)量的影響均無顯著性差異(P>0.05)。由直觀分析表(表3)可知，各因素對淫羊藿生品影響順序為：浸潤水量>浸潤時間>干燥溫度。因此，根據(jù)方差分析比較及直觀分析表均值選取最佳工藝為：A1B1C3，即淫羊藿最佳炮制工藝為：取生淫羊藿，除雜，保持其干燥，切成2～4 mm寬的絲，在70 ℃下稍干。

表2 方差分析表Tab.2 Variance analysis

表3 正交試驗直觀分析表Tab.3 Orthogonal test results and direct analysis

3.4 最佳工藝驗證

取生淫羊藿，除雜，保持其干燥，切成2～4 mm寬的絲，在70 ℃下稍干，以此工藝平行制備3份樣品，每個樣品3個平行樣。按2.2.1節(jié)下色譜條件測定，得最佳工藝制備3個平行樣的平均含量為2.29%，RSD值均小于3%，說明該工藝合理可行，結(jié)果見表4。

表4 最佳工藝驗證結(jié)果Tab.4 Verification results of the optimal techniques

4 結(jié)論與討論

4.1 結(jié)論

以浸潤時間、浸潤水量、切絲寬度、干燥溫度為考察因素進行正交試驗設(shè)計，以淫羊藿皂苷含量為評價指標，采用正交試驗優(yōu)選淫羊藿生品最佳炮制工藝，得出淫羊藿生品最佳炮制工藝為：取淫羊藿生品，除去雜質(zhì)，切成2～4 mm寬的絲，在70 ℃下干燥。最佳工藝驗證試驗表明，該工藝穩(wěn)定、可行。

4.2 討論

目前，市面上淫羊藿飲片的用處廣，用量較大，但其質(zhì)量參差不齊。淫羊藿不同采收期、不同產(chǎn)地加工及不同炮制方法對淫羊藿質(zhì)量的影響較大。本研究以淫羊藿苷含量為質(zhì)量檢測指標，對浸潤時間、浸潤水量、切絲寬度、干燥溫度4個單因素進行考察，結(jié)果顯示浸潤時間、浸潤水量、干燥溫度對淫羊藿苷含量具有顯著性差異，切絲寬度對淫羊藿苷的含量無顯著性影響。因此，在設(shè)計正交試驗時主要對浸潤時間、浸潤水量、干燥溫度進行考察，正交試驗結(jié)果顯示，不同的浸潤時間之間具有顯著性差異，浸潤水量、干燥溫度對淫羊藿苷無顯著性差異。根據(jù)正交試驗方差分析與直觀分析表中極差及均值大小優(yōu)選最佳炮制工藝。在該工藝條件下，測得淫羊藿苷的含量為2.29%，大于0.4%，符合藥典規(guī)定。通過驗證性試驗結(jié)果表明，該工藝穩(wěn)定、可行，可為淫羊藿生品炮制工藝提供參考。