滇金石斛中4個對映海松烷二萜化合物的分離鑒定及其抗齲作用研究

李玲，胡繼藤，羅密，鄭麗云，朱江華

(1.佛山市婦幼保健院藥學部，廣東 佛山 528000； 2.中山大學腫瘤防治中心藥學部，廣東 廣州 510060)

齲齒是世界上最普通的傳染病之一[1]，盡管齲齒的病理生物學較復雜，但普遍認為牙菌斑生物膜是導致齲齒的主要原因之一[2]。牙菌斑由多種細菌形成，其中變形鏈球菌被認為是齲齒的主要病因[3]。所有類型齲病的發(fā)生機制都是相似的，是在以細菌為主的多種因素影響下,牙體硬組織發(fā)生的進行性破壞的一種疾病。引發(fā)齲病的細菌多為人體內(nèi)生的細菌，包括變形鏈球菌、唾液鏈球菌和乳桿菌等，這些細菌在發(fā)酵碳水化合物的同時產(chǎn)生有機弱酸，導致牙齒組織脫礦[4]。尋找到安全、有效抑制致齲菌的抗菌劑成為人們防治齲病的研究熱點?，F(xiàn)有的齲病防治措施，如使用氟化物及窩溝封閉，存在成本高、患者順應(yīng)性差和明顯不良反應(yīng)等不足。

金石斛屬植物在我國有較為豐富的資源分布[5]。目前，金石斛屬植物研究主要集中于流蘇金石斛、截葉金石斛和金石斛3種植物[6-9]。滇金石斛FlickingeriaalbopurpureaSeidenf易栽培，而且花姿優(yōu)雅，常用作觀賞植物，但至今未見關(guān)于其化學成分等方面的文獻報道。本研究擬對滇金石斛中的化學成分進行分離，并研究它們對致齲菌生長的影響，探討滇金石斛作為齲齒防治天然藥物的前景和可行性。

1 儀器與材料

1.1 儀器

AM400核磁波譜儀(Bruker)；ESIMS/HRESIMS電噴霧質(zhì)譜(Finnigan LC QDECA instrument)；N1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本Eyela公司)；SB200恒溫水浴鍋(日本Eyela公司)；Crystal Spec TM比濁儀(美國Becton Dickinson and Company)。

1.2 試劑

柱色譜硅膠(300～400目，青島海洋化工廠)；GF254硅膠薄層色譜預(yù)制板(青島海洋化工廠)；MCI填料(CHP20P，75～150 μm，日本Mitsubishi公司)；Sephadex LH-20葡聚糖凝膠(美國GE公司)；ODS填料(12 nm，S-50 μm，日本YMC公司)；其余溶劑和試劑(分析純，天津市百世化工有限公司)；BHI液體培養(yǎng)基(牛腦20%，牛心浸出液25%，蛋白胨1%，葡萄糖0.2%，NaCl 0.5%)。

1.3 菌株

變形鏈球菌StreptococcusmutansATCC25175；血鏈球菌StreptococcussanguisATCC10556；唾液鏈球菌StreptococcussalivariusSS196；內(nèi)氏放線菌ActinomucesnaeslundiiWVU627；黏性放線菌ActinomycesviscosusATCC19246；乳桿菌LactobacillusrhamnosusAC413。

2 方法

2.1 提取分離

干燥藥材2 kg，粉碎，用95%(體積分數(shù)，下同)乙醇冷浸提取，物料比10∶1，總共浸提3周，每周更換1次乙醇，合并提取液，減壓回收乙醇得浸膏200 g。浸膏用適量飽和食鹽水混懸后，依次以3倍體積的石油醚、乙酸乙酯及水飽和正丁醇萃取，得石油醚層、乙酸乙酯層、正丁醇萃取部位。乙酸乙酯部分約62.7 g，用適量RpC-18硅膠混合拌樣，取適量RpC-18硅膠裝柱(規(guī)格為10 cm×50 cm)，用5%甲醇2 L平衡柱子，干法上樣；然后依次用10%、20%、40%、60%、80%和100%的甲醇/水2 L洗脫，根據(jù)薄層色譜行為將洗脫液分為6段，分別編號為Fr1、Fr2、Fr3、Fr4、Fr5、Fr6。Fr3用甲醇溶解后用硅膠拌樣，溶劑充分揮干。過正相硅膠柱，用二氯甲烷-甲醇(體積比50∶1、30∶1、20∶1、10∶1、5∶1)梯度洗脫，洗脫液根據(jù)薄層色譜(TLC)檢測結(jié)果合并、濃縮，共得到6個部分Ⅰ～Ⅵ。Ⅱ部分經(jīng)正相硅膠柱色譜分離[二氯甲烷-甲醇(體積比100∶1→1∶1)]，得到3個部分Ⅱa～Ⅱc，Ⅱb經(jīng)過硅膠柱層析，用石油醚-丙酮(體積比20∶1→5∶1)得到化合物2(26 mg)。Ⅱc依次經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析[三氯甲烷-甲醇(體積比1∶1)]和硅膠柱層析[石油醚-二氯甲烷(體積比1∶1)]得化合物1(46 mg)。Fr5部分用甲醇溶解，過凝膠(Sphadex LH-20)，經(jīng)甲醇洗脫，分為4個部分Ⅰ～Ⅳ，Ⅱ部分經(jīng)反相硅膠C8柱色譜分離[甲醇-水(體積比50∶50→100∶0)]，得到3個部分Ⅱa～Ⅱe，Ⅱe經(jīng)過硅膠柱層析，用三氯甲烷-甲醇(體積比10∶1→1∶1)得到化合物3(16 mg)。Ⅲ部分經(jīng)過硅膠柱層析，用三氯甲烷-甲醇(體積比10∶1→1∶1)得到3部分Ⅲa～Ⅲc，Ⅲb過凝膠(Sphadex LH-20)，經(jīng)95%乙醇洗脫得化合物4(21 mg)。

圖1 滇金石斛中分離得到的4個化合物

Figure 1 The compounds isolated fromFlickingeriaalbopurpurea

2.2 菌液制備

將復蘇48 h后的各株細菌分別接種于BHI液體培養(yǎng)基中，80%N2、20%CO2、37 ℃下厭氧培養(yǎng)18 h，涂片檢查為純培養(yǎng)后，用Crystal Spec TM比濁儀測量菌懸液濃度，PBS用緩沖液將菌懸液調(diào)至1×108cfu/mL。

2.3 化合物對口腔致齲菌的抑制試驗[10]

試驗分組：陽性對照組為含菌懸液的BHI液體培養(yǎng)基，溶劑對照組為含40%聚乙二醇400和菌懸液的BHI液體培養(yǎng)基，實驗組為含實驗藥液和菌懸液的BHI液體培養(yǎng)基。每組設(shè)5個平行，重復3次。使用MBECTM-Device測定6種細菌的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC值)及最低生物膜清除濃度(minimal biofilm eradication concentration，MBEC值)。致齲菌培養(yǎng)條件：80%N2，20%CO2，37 ℃下厭氧培養(yǎng)。

在MBECTM-Device的孔板中加入已配制好的菌懸液50 μL和BHI液體培養(yǎng)基150 μL。厭氧培養(yǎng)24 h，水平取出帶有樁釘?shù)纳w板，依次放入裝有200 μL/孔PBS(pH7.2)的標準96孔板中，清洗2次；將樁釘蓋板放入裝有200 μL/孔BHI藥液培養(yǎng)基的標準96孔板中培養(yǎng)24 h，取出樁釘蓋板觀察孔板，以肉眼觀察無渾濁或沉淀生長的最低藥物濃度為該藥物的MIC值；再用PBS清洗樁釘2次，蓋板放入含有200 μL/孔BHI液體培養(yǎng)基的標準96孔板內(nèi)，微量振蕩器震動30 min，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，以肉眼觀察無渾濁出現(xiàn)的最低藥物濃度為MBEC值[11]。

3 結(jié)果

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色無定形粉末，基于高分辨ESI質(zhì)譜的準分子正離子峰m/z359.265 3[M+Na]+(calcd for C20H32O4Na)，不飽和度為5。分析1H NMR(CD3OD,400 MHz)譜，可見1個烯族質(zhì)子δ5.47(brs，H-14)，連氧原子的亞甲基的2個質(zhì)子4.36(d，J=4.6 Hz，2H-16)，2個連氧碳上的質(zhì)子信號3.85(ddd，J=2.4 Hz，4.8，7.6)和3.22(d，J=2.4 Hz)；4個單峰甲基信號δH1.07(s，H-17)、0.97(s，H-18)、0.85(s，H-19)和0.70(s，H-20)；根據(jù)碳譜并結(jié)合DEPT譜，有如下碳信號：δC215.3酮羰基，δC142.6、125.3雙鍵，2個連氧的碳δC79.7、67.0，以及δC66.5連乙酰氧基，4個甲基分別為δC29.6、28.0、23.0、 16.1；根據(jù)不飽和度為5，結(jié)合核磁信息，可以推斷化合物1為3環(huán)化合物。綜上，可以推斷化合物1為海松烷型二萜類化合物，結(jié)合DEPT實驗，并與文獻[12]比對，推斷化合物1為2β,3β,16-trihydroxy-ent-pimar-8-(14)-en-15-one。13C NMR數(shù)據(jù)歸屬如下(δ)：39.8(C1)，66.5(C2)，78.8(C3)，39.3(C4)，50.6(C5)，21.6(C6)，35.5(C7)，142.1(C8)，47.1(C9)，38.3(C10)，21.6(C11)，32.5(C12)，46.8(C13)，123.7(C14)，214.5(C15)，65.8(C16)，28.6(C17)，27.3(C18)，22.0(C19)，15.3(C20)。

化合物2：白色無定形粉末，根據(jù)HRESIMS 379.247 4[M+H]+，確定其分子式為C22H34O5，分析1H NMR和13C NMR譜數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)與化合物1非常類似，主要有多了乙酰基的信號[δH2.07(s)，δC21.3、170.1][13]和C-2的化學位移向低場遷移2點不同，因此，推斷化合物2是化合物1的乙?；苌铮煌ㄟ^H-2(δH5.14)與乙?；聂驶?δC170.1)的HMBC相關(guān)，推測乙酰氧基被定位在C-2上，同時相對化合物1，C-1和C-3的化學位移均向高場發(fā)生位移，從側(cè)面證明乙酰氧基鏈接在C-2上。核磁數(shù)據(jù)與文獻[14]一致。核磁13C NMR數(shù)據(jù)歸屬如下(δ) ：36.0(C1)，70.9(C2)，76.7(C3)，38.6(C4)，47.2(C5)，21.5(C6)，35.4(C7)，141.9(C8)，50.5(C9)，39.3(C10)，20.2(C11)，32.5(C12)，46.8(C13)，123.8(C14)，214.3(C15)，65.7(C16)，27.3(C17)，22.0(C18)，28.5(C19)，15.2(C20)，21.3(CH3CO)，170.1(CH3CO)。

化合物3：白色無定形粉末，根據(jù)HRESIMS中的準分子離子峰m/z585.292 9 [M+HCOO]-(calcd for C29H45O12，585.292 3)計算出分子式為C28H44O10。通過對其1H NMR和13C NMR譜分析，發(fā)現(xiàn)化合物3與化合物1和2為同一骨架類型化合物，不同的地方在于化合物3的核磁圖譜中明顯存在1個六碳糖，可以推斷化合物3為海松烷苷類化合物。此外，存在1個乙?；?[δH2.10 s(3H)，δC21.3、173.0]。根據(jù)上述推斷，結(jié)合文獻[15]結(jié)果對比，確定化合物3為2,16-dihydroxyl-15-keto-2-acetoxy-ent-pimar-8(14)-ene-16-O-β-D-glucopyranoside。核磁13C NMR數(shù)據(jù)歸屬如下(δ)： 41.3(C1)，65.9(C2)，81.5(C3)，39.9(C4)，49.9(C5)，22.6(C6)，36.5(C7)，142.9(C8)，52.0(C9)，40.5(C10)，21.3(C11)，33.5(C12)，48.7(C13)，125.5(C14)，213.5(C15)，72.4(C16)，27.5(C17)，28.5(C18)，22.4(C19)，16.0(C20)，21.3(CH3CO)，173.0(CH3CO)，104.2(C1′)，75.0(C2′)，78.2(C3′)，71.5(C4′)，77.6(C5′)，72.4(C6′)。

化合物4：白色無定形粉末，通過HRESIMS483.295 2 [M+H]+和核磁13C NMR推斷其分子式為C26H42O8，化合物4的1H和13C NMR數(shù)據(jù)與化合物3非常接近，推斷化合物4為化合物3的同系列物質(zhì)，不同之處如下：乙?；Я耍B氧的次甲基碳只剩下1個，多了1個脂肪族的亞甲基。由此，可以推斷化合物4是在化合物3的結(jié)構(gòu)上消去了乙酰化的羥基。通過與文獻[9]進行比對，發(fā)現(xiàn)核磁數(shù)據(jù)完全一致。核磁13C NMR數(shù)據(jù)歸屬如下(δ)：40.5(C1)，67.2(C2)，80.0(C3)，39.5(C4)，48.5(C5)，21.3(C6)，36.7(C7)，143.3(C8)，51.9(C9)，40.4(C10)，22.8(C11)，33.5(C12)，48.6(C13)，125.2(C14)，213.7(C15)，72.4(C16)，27.5(C17)，29.3(C18)，22.7(C19)，16.0(C20)，104.2(C1′)，75.0(C2′)，78.1(C3′)，71.5(C4′)，77.6(C5′)，62.7(C6′)。

3.2 抑菌試驗結(jié)果

從表1可見，化合物1～4對6種口腔致齲浮游菌均有明顯的抑制作用；化合物3和4的MIC值均明顯小于化合物1和2，表明化合物3和4對浮游菌的抑菌效果好于化合物1和2；聚乙二醇溶劑對照組沒有抑菌作用。從6種不同的菌株上看，4種化合物均對變形鏈球菌(Streptococcusmutans)的MIC值最小，抑菌效果強于其他5類致齲菌。在MBECTM-Device的樁釘表面，細菌可形成良好的生物膜?；衔?～4對口腔生物膜細菌的抑制作用也較強，MBEC值在33.2～100.2 μg/mL之間。

表1 化合物1～4對致齲菌MIC值及對生物膜細菌MBEC值

4 討論

本文采用多種色譜技術(shù)對滇金石斛的化學成分進行分離，得到了4個對映海松烷型二萜化合物，雖然該類化合物在金石斛屬植物中已有報道[16-17]，但該類對映海松烷型二萜是首次從滇金石斛中分離得到，確證了在分類學上的近緣關(guān)系。

本文的抑菌試驗結(jié)果顯示，化合物3和4的抑菌活性明顯強于化合物1和2，通過波譜結(jié)構(gòu)解析發(fā)現(xiàn)化合物3和4的結(jié)構(gòu)中具有化合物1和2所沒有的親水性葡萄糖取代基，提示親水性的葡萄糖取代基為活性取代基，為后續(xù)開展構(gòu)效關(guān)系提供參考。另外，從4種化合物對6類齲齒菌的抑菌效果可見，4種化合物均對變形鏈球菌的抑菌效果最好，化合物3和4對變形鏈球菌的MIC值在10 μg/mL左右。對植物提取物和天然化合物的抑菌分析的研究中，普遍認為代謝產(chǎn)物的MIC值高于100 μg/mL時幾乎是缺乏抑菌活性的，如分離的化合物最低抑制微生物的生長濃度低于10.0 μg/mL被認為是較有研究前途的，可作為新的抗感染藥物的研究前體[18-19]，提示在尋找新的齲齒根管治療沖洗劑時，化合物3和4可以被進一步研究和開發(fā)。

本研究對化合物的抑菌作用機制仍不夠深入，后續(xù)可針對化合物對致齲菌產(chǎn)酸和黏附作用的影響進行研究，同時可探索親水性葡萄糖取代基在抑菌效果中的作用。