基于隸屬函數(shù)法的辣椒苗期耐冷性綜合評價

張 婷，郭勤衛(wèi)，劉慧琴，李朝森，章心惠，崔文浩，項小敏，趙東風

(衢州市農(nóng)業(yè)科學研究院，浙江 衢州 324000)

辣椒屬于茄科辣椒屬，是一年生或者多年生的草本植物，果實形狀、大小各異，一般為辣或甜味。它廣泛種植于熱帶和溫帶地區(qū)，對溫度較為敏感[1]。低溫會導致生長發(fā)育遲緩，隨著辣椒周年生產(chǎn)和周年供應技術的出現(xiàn)，早春和晚秋的種植模式容易遇到低溫，尤其是冬春保護地生產(chǎn)中，低溫成為主要制約辣椒生長發(fā)育的關鍵因素，培育耐低溫的品種一直是我國辣椒抗逆育種的主攻目標之一，辣椒材料耐冷性的比較與篩選為選育耐冷的優(yōu)異育種材料奠定了物質(zhì)基礎，對辣椒栽培與推廣具有深遠的指導意義。

辣椒材料耐低溫能力的鑒定一般分為直接鑒定法和間接鑒定法，田間鑒定法可通過直接觀察植物遭遇自然低溫后外在形態(tài)的變化來評價和鑒定其耐冷性，但試驗過程中極易受到環(huán)境中其他不可控因素的影響，試驗周期也相對較長[2]。間接鑒定法是指人工模擬低溫環(huán)境，分析與耐冷性相關的指標參數(shù)變化來反映其耐冷性。有研究表明：通過測定與植物耐低溫有關的生理生化指標可以間接評價植物的耐冷能力，如可溶性糖、可溶性蛋白、葉綠素含量、膜透性、氧化還原性酶活性等[3-10]。張茹等[8]發(fā)現(xiàn)辣椒幼苗在5 ℃低溫處理后，其電導率升高、葉綠素含量均降低、可溶性蛋白含量增加；王慧等[9]研究發(fā)現(xiàn)低溫脅迫后，辣椒葉綠素含量降低、可溶性糖含量和脯氨酸含量增加、POD和SOD活性升高。與此同時，也有研究人員采取直接鑒定法，丁夢佳等[11]對44份辣椒材料進行苗期和成株期的耐冷性鑒定，發(fā)現(xiàn)1份耐冷辣椒材料。此外，還有研究人員針對辣椒耐冷機理[12-14]、耐冷材料的篩選方法[15]、辣椒萌芽期耐冷性[16-18]等方面開展了相關研究。但是關于辣椒耐冷性的生長指標和生理生化指標的主成分分析報道較少，利用隸屬函數(shù)法分析辣椒材料的耐冷性也未見報道。本試驗通過研究前人認為與植物耐冷性有關的生理生化指標6個，包括可溶性蛋白含量、丙二醛(MDA)含量、SOD酶活性、POD酶活性、膜透性和葉綠素含量(SPAD值)，以及人工接種鑒定后的冷害指數(shù)，對7個指標進行主成分分析，最終通過隸屬函數(shù)分析對其耐冷性進行綜合評價。隸屬函數(shù)法是可以將定性評價轉化為定量評價，采用多指標分析植物受到脅迫后的響應進行綜合評價，利用該方法綜合評價植物抗逆性的強弱，避免了利用單一生理指標對辣椒材料進行耐冷性評價的片面性[19-20]。

1 材料與方法

1.1 材料

2個辣椒品種為玉龍椒和衢椒3號，9個辣椒材料分別為Y801、L11-3-2-1-1、金5-8、05B03、B1-2、L19-1-1-1-1、L11-2-1-1、05B11、B15-4-6，所有材料均來自于衢州市農(nóng)業(yè)科學研究院蔬菜所資源圃。

1.2 方法

1.2.1 試驗材料培養(yǎng) 試驗在衢州市農(nóng)科院實驗室進行。2018年3月9日進行浸種催芽，每個材料(品種)選取飽滿的種子100粒，采用溫湯浸種后用0.1%高錳酸鉀溶液處理15 min，用自來水沖洗干凈后放入28 ℃恒溫箱中催芽。出苗后移至營養(yǎng)缽進行培養(yǎng)，育苗期間進行常規(guī)管理直至幼苗長到4葉1心。每個品種挑選健壯、長勢一致的60株幼苗進行試驗，每個處理10株，共3個重復，并設有空白對照。

1.2.2 試驗材料處理 將處理材料放置在8 ℃/5 ℃的人工氣候箱低溫處理3 d，光照強度2000 lx，晝夜時長均為12 h，以25 ℃/15 ℃下的植株為對照。3 d后觀察辣椒冷害情況，按照徐偉慧等[5]的冷害分級標準進行冷害分級鑒定，并按照公式冷害指數(shù)=∑(各級株數(shù)×級數(shù))/(總株數(shù)×最高級別數(shù))計算各材料的冷害指數(shù)。分別取處理后和對照的辣椒植株的功能葉片作為測定葉片膜透性、MDA含量、可溶性蛋白含量、葉片SPAD值、超氧化物歧化酶(SOD)活性和過氧化物酶(POD)活性的樣品。

1.2.3 指標測定 葉片膜透性采用電導儀法進行測定；葉片丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法測定；葉片可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍G-250染色法測定；葉片SPAD值采用SPAD-502葉綠素計測定；葉片SOD活性采用氮藍四唑(NBT)光還原法測定；葉片POD活性采用愈創(chuàng)木酚法測定。所有指標測定均設置3個重復，數(shù)據(jù)處理結果均為3個處理的平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016對數(shù)據(jù)進行處理，采用Duncan’s新復極差法比較不同處理組數(shù)據(jù)的差異，用SPSS 19.0軟件分析不同指標間的相關性和主成分。并用模糊函數(shù)法進行分析[21]，以隸屬函數(shù)值對低溫脅迫下的供試材料進行綜合評價，具體方法參照文獻[21]，運用的主要公式如下：

(1)隸屬函數(shù)值:

公式中，Xa表示第a個因子的得分值，Xmin表示第a個因子得分的最小值，Xmax表示第a個因子得分的最大值。

(2)綜合評價

公式中，Di為材料在鹽堿地用綜合指標評價所得的辣椒苗期耐冷性綜合評價值，k為樣品個數(shù)。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫對辣椒幼苗生理生化指標的影響

2.1.1 可溶性蛋白 由圖1A可知，對照中不同的辣椒材料可溶性蛋白含量差異較大，含量最高的是L11-3-2-1-1，其次為B1-2，而低溫處理后可溶性蛋白含量均明顯升高。除L11-3-2-1-1外，其余均與對照達到顯著性差異，其中可溶性蛋白含量最高的是B1-2，其次為05B03和Y801。僅從可溶性蛋白含量來看，耐低溫性最好的是Y801，最差的是L11-3-2-1-1。

2.1.2 SPAD值 由圖1B可看出，各辣椒材料的SPAD值以B1-2材料的最高，其他材料差異不大；低溫處理后不同辣椒材料的SPAD值均低于對照，呈下降趨勢，其中B1-2的降幅最大，達47.78%，與對照差異性顯著；衢椒3號與對照差異最小，僅比對照降低10.09%。僅從SPAD值來看，耐低溫性最好的是衢椒3號，最差的是B1-2。

小寫字母表示對照中不同材料間差異顯著(P<0.05)，*表示各材料的對照與低溫處理差異顯著(P<0.05)。下同。

2.1.3 葉片MDA含量 由圖2A可看出，對照中不同品辣椒材料的MDA含量有差異，但并不大，在4.7～6.45 μmol/g之間，最大的為B1-2，最小的為Y801。低溫處理后不同辣椒材料的葉片MDA含量均呈現(xiàn)上升的趨勢，但是變化幅度差異較明顯，其中增幅最小的是B1-2，比對照增加2.03%，增幅最大的是B15-4-6，比對照增加1.6倍，表明在低溫脅迫下，B1-2、Y801、05B03還能保持較低的MDA水平。

2.1.4 葉片膜透性 由圖2B可看出，對照中不同辣椒的膜透性差異并不明顯，均在20%左右，表明所有材料均處在相同的環(huán)境條件下，并且培養(yǎng)環(huán)境比較適宜辣椒材料生長。低溫脅迫后，不同辣椒材料的膜透性變化差異較大，都出現(xiàn)了不同程度的上升，并且低溫處理后的膜透性均與對照有顯著性的差異，其中增幅最大的是Y801，比對照增長2.05倍；增幅最小的是衢椒3號，僅比對照增加1%，說明衢椒3號在低溫情況下仍然可以保持較低的膜透性，其耐低溫性較強。

圖2 低溫脅迫對不同辣椒材料的MDA含量和膜透性的影響

2.2 低溫脅迫對辣椒苗抗氧化酶活性的影響

2.2.1 SOD活性 由圖3A可看出，對照中不同辣椒材料的SOD活性差異比較明顯，表明不同材料中SOD酶活不同。對照中SOD活性最強的是05B03，最弱的是B1-2；低溫處理后大部分辣椒材料的SOD活性有所增強，期中衢椒3號、玉龍椒、L11-3-2-1-1等3個材料僅有略微的上升，而金5-8和Y801增幅最大，并顯著高于對照，金5-8和Y801在低溫脅迫后SOD活性明顯增強。

2.2.2 POD活性 由圖3B可看出，對照中不同辣椒材料的POD活性差異并不顯著，均在500 μ/g FW左右，其中POD活性最強的是衢椒3號；低溫處理后不同辣椒材料的POD活性明顯增強，并達到顯著性差異。其中05B03和衢椒3號的POD活性增強最明顯，分別比對照增加4.4倍和3.8倍。相比較而言，低溫脅迫后辣椒植株內(nèi)的活性氧迅速積累，可以看出POD的活性變化幅度明顯高于SOD活性變化幅度，表明在清除活性氧的過程中POD酶的作用比SOD酶的作用大。

圖3 低溫脅迫下不同辣椒材料的SOD和POD活性的影響

2.3 低溫脅迫下辣椒的冷害指數(shù)

從表1可以看出，不同辣椒材料的耐冷性差異明顯，耐冷指數(shù)最小的是B1-2，最大的為B15-4-6。根據(jù)耐冷指數(shù)分級，耐低溫材料有2份，分別為B1-2和衢椒3號，Y801、05B03、玉龍椒為中等耐低溫材料，剩余6份為不耐低溫材料。

2.4 隸屬函數(shù)法對低溫脅迫下辣椒苗期的耐低溫性的綜合評價

2.4.1 耐低溫系數(shù)分析 耐低溫性是一個復雜的數(shù)量性狀，單一的研究指標不能表示品種的耐低溫能力，該研究綜合辣椒耐低溫相關研究中的指標分析，從中選取低溫處理后變化幅度較大的生理指標作為主要分析指標。通過耐低溫系數(shù)法，用相對值消除品種自身的固有差異，其中耐低溫系數(shù)=樣品測定平均值/對照平均值×100%，7個指標的耐低溫系數(shù)如表2所示。

表1 不同辣椒材料的冷害指數(shù)比較

表2 供試材料單項指標的耐低溫系數(shù)

2.4.2 主成分分析 由表3、表4可知，對11個辣椒材料低溫脅迫下的7個指標的耐低溫系數(shù)進行主成分分析，提取出3個主成分，其中第一主成分(F1)主要包括膜透性、可溶性蛋白含量2個指標，2個指標代表了總指標的37.233%信息；第二主成分(F2)主要包括MDA含量、SPAD值和冷害指數(shù)3個指標，代表了總指標21.670%的信息；第三主成分(F3)包括SOD活性和POD活性2個指標，代表了總指標17.24%的信息。這3個主成分可代表所有7個指標的76.145%的信息。

表3 主成分分析

表4 方差旋轉因子的載荷矩陣

2.4.3 耐低溫相關性分析及綜合評價 采用D值對低溫脅迫下11個辣椒材料苗期的耐冷性的7個指標進行綜合評價，D值越大，辣椒的耐低溫性越強。結果如表5所示，低溫脅迫下11個辣椒材料耐低溫性D值排序為：Y801>衢椒3號>05B03>L19-1-1-1-1>B1-2>金5-8>B15-4-6>L11-2-1-1>L11-3-2-1-1>玉龍椒>05B11。

對11個辣椒材料耐冷性的7個指標和綜合指標D值進行相關性分析，結果顯示(表5)，辣椒材料苗期的MDA含量與冷害指數(shù)呈顯著正相關(P<0.05，下同)，相關系數(shù)為0.646，說明當辣椒遭遇低溫時，丙二醛含量增高，耐低溫能力越弱，丙二醛積累越多，冷害癥狀明顯，冷害指數(shù)越大?？扇苄缘鞍缀颗c膜透性呈顯著正相關關系，相關系數(shù)為0.695，低溫脅迫后可溶性蛋白含量增加，膜透性增加。冷害指數(shù)與D值呈顯著負相關，相關系數(shù)為-0.661，說明冷害指數(shù)越小的，D值越大，冷害指數(shù)可作為篩選耐低溫辣椒材料的可靠參考指標。

表5 隸屬函數(shù)值及綜合排名

表6 指標相關性分析

注：*表示在5%水平上的差異顯著性。

3 討論

3.1 低溫脅迫對辣椒生理生化指標值的影響

前人研究發(fā)現(xiàn)辣椒遭受低溫脅迫后，辣椒葉片的膜透性明顯高于對照，可溶性蛋白、可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)會大量積累，SOD酶和POD酶的活性明顯高于對照，植物光合作用能力減弱，葉綠素含量降低，SPAD值減小[6,8-11]。本研究結果中葉片中可溶性蛋白、MDA含量、SPAD值、膜透性、SOD酶活性與POD酶活性等的變化趨勢與前人研究結果相似，在低溫脅迫后辣椒幼苗葉片的可溶性蛋白含量明顯高于對照，葉片的SPAD值明顯小于對照，膜透性變大，SOD酶活性、POD酶活性均高于對照，并且不同辣椒材料間升高或降低幅度差異較大。產(chǎn)生這一系列變化的主要是由于低溫環(huán)境首先引起細胞膜的主要構成物質(zhì)——脂類由液晶態(tài)變?yōu)槟z態(tài)，導致細胞膜的選擇透過性變大，細胞內(nèi)的可溶性物質(zhì)外滲，導致電導率增大。植物為了防止從細胞質(zhì)中吸水會產(chǎn)生更多的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)如可溶性糖、可溶性蛋白等物質(zhì)來平衡滲透式，因此可溶性蛋白、可溶性糖含量等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)在低溫脅迫后升高。其次，低溫環(huán)境會引起植物體內(nèi)的抗氧化酶的活性降低，導致植物體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧不能被清除，丙二醛積累；同時刺激植物體內(nèi)的保護酶如SOD酶、POD酶等活性增強，防止細胞受到氧化脅迫。低溫導致辣椒的葉綠素含量降低可能是由于低溫導致葉綠素合成受阻，持續(xù)低溫可造成辣椒體內(nèi)合成的葉綠素被分解，導致葉綠素含量降低，SPAD值減小。

3.2 辣椒材料耐冷性的綜合評價

本研究采用隸屬函數(shù)法并綜合SPAD值、MDA含量、SOD和POD酶活性、膜透性、可溶性蛋白含量等生理生化指標及冷害指數(shù)人工接種鑒定指標進行降維處理，經(jīng)過隸屬函數(shù)法計算后的D值最高的是Y801，為0.597，耐冷性排名第1位。雖然低溫脅迫下不同辣椒材料的膜透性與可溶性蛋白含量相關性顯著，相關系數(shù)為0.695，但是兩者與D值相關性不顯著，但低溫脅迫下各品系(種)辣椒材料的膜透性、可溶性蛋白含量均高于對照也可說明膜透性、可溶性蛋白對低溫脅迫的響應，且在低溫脅迫下可溶性蛋白含量最高的品系是Y801，膜透性最小的材料也是Y801，表明本研究得出的結論符合膜透性小、可溶性蛋白含量高的品系(種)耐低溫性強的機理，但是膜透性與D值得相關系數(shù)極低，說明膜透性只可作為篩選辣椒苗期耐低溫材料的參考指標，可溶性蛋白含量可作為重要參考指標。與膜透性相同，同一品系(種)的MDA含量、SPAD值雖然低溫脅迫后均有響應，但是其影響值可能小于冷害指數(shù)，因此這些指標能否作為篩選耐低溫材料的主要參考指標有待進一步驗證。

在對照處理和低溫脅迫下MDA含量和耐冷指數(shù)最小的是B1-2，其經(jīng)過隸屬函數(shù)法計算后的D值為0.525，耐冷性排名第5位，低溫脅迫下不同辣椒材料的MDA含量與冷害指數(shù)的相關性為0.646，達顯著水平，說明MDA含量與冷害指數(shù)呈明顯正相關關系，冷害指數(shù)與D值的相關性值為0.616，達顯著性水平，表明冷害指數(shù)可作為耐冷性評價的代表性指標。

低溫脅迫后SOD活性最高的是金5-8，但是金5-8的D值并不高，SOD活性與D值相關性并不顯著，說明SOD能否作為篩選低溫材料的主要參考指標有待進一步驗證；POD活性最高的是衢椒3號，且低溫脅迫后所有材料的POD活性與對照均有顯著性差異，衢椒3號的D值較高，排名第2位，POD活性與D值相關性并不顯著，但相關系數(shù)還比較高，綜合比較說明POD活性可作為篩選耐低溫辣椒材料的主要參考指標。

4 結論

利用隸屬函數(shù)法對11個辣椒材料的苗期耐低溫能力強弱排序為：Y801>衢椒3號>05B03>L19-1-1-1-1>B1-2>金5-8>B15-4-6>L11-2-1-1>L11-3-2-1-1>玉龍椒>05B11；結合各指標的代表性值與D值的相關性，得出冷害指數(shù)可作為篩選辣椒材料苗期耐低溫品種的代表性指標。