殼聚糖納米顆粒對(duì)紅鰭東方鲀生長(zhǎng)、免疫酶及免疫基因的影響

王榮月，勞錦程，王重陽(yáng)，李睿鑫，謝紅國(guó)，葉仕根，黎睿君，尹恒，劉娟*

(1.大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大連市海珍品疾病預(yù)防重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023；2.中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所 天然產(chǎn)物及糖工程研究組，遼寧 大連 116023)

紅鰭東方鲀Takifugurubripes隸屬于鲀形目Telraodontiformes鲀科Teraodontoidae東方鲀屬Takifugu[1]，是目前水產(chǎn)養(yǎng)殖的主要品種之一。在紅鰭東方鲀養(yǎng)殖類生產(chǎn)過(guò)程中，寄生蟲、細(xì)菌、病毒會(huì)對(duì)其造成危害[2]。之前主要通過(guò)化學(xué)藥物和抗生素來(lái)對(duì)抗魚類疾病，但是過(guò)多地使用化學(xué)藥品會(huì)出現(xiàn)魚體耐藥性、污染環(huán)境等問(wèn)題[3]。因此，在養(yǎng)殖中通過(guò)向飼料中添加新型免疫添加劑來(lái)預(yù)防魚類疾病的方法已成為人們研究的熱點(diǎn)。

殼聚糖(Chitosan, CS)，是幾丁質(zhì)脫乙?；蟮玫降漠a(chǎn)物，存在于蝦、蟹、昆蟲等的外殼及真菌細(xì)胞壁中[4]，其代謝產(chǎn)物無(wú)毒、可生物降解，具有抗微生物等活性[5]。近年來(lái)研究表明，殼聚糖作為飼料添加劑能有效提高水產(chǎn)動(dòng)物免疫力[6-8]。但殼聚糖分子量大，不易吸收。殼寡糖(Chitosan oligosaccharide，COS)在水產(chǎn)中的研究報(bào)道效果好[9]，但成本高。納米化的飼料或飼料添加劑，由于粒徑小，有利于在消化道滯留，延長(zhǎng)腸壁接觸時(shí)間易于被吸收，能大大提高飼料的生物利用率[10-11]，且成本低。本項(xiàng)目組引入納米技術(shù)制備納米級(jí)殼聚糖用于水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物飼料添加劑，對(duì)于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)是一項(xiàng)技術(shù)性及概念性的革新之舉，意義重大。本研究中，以紅鰭東方鲀幼魚為研究對(duì)象，考察了殼聚糖納米顆粒對(duì)鲀幼魚生長(zhǎng)及免疫指標(biāo)的影響，旨在為殼聚糖納米顆粒作為水產(chǎn)飼料添加劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用紅鰭東方鲀幼魚購(gòu)自大連天正實(shí)業(yè)有限公司，初始體質(zhì)量為(9.910±0.306)g，體長(zhǎng)為(6.577±0.437)cm。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)飼料的配制 試驗(yàn)用基礎(chǔ)飼料為顆粒飼料，購(gòu)自大連天正實(shí)業(yè)有限公司，其營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1。殼聚糖購(gòu)于阿拉丁公司，脫乙酰度>95%，黏度為100～200 mPa·s。殼寡糖由中科院大連化學(xué)物理研究所天然產(chǎn)物及糖工程研究組提供，聚合度為2～10，脫乙酰度>95%，平均相對(duì)分子質(zhì)量<1500。殼聚糖納米顆粒：溶液A為殼聚糖與1%醋酸的混合液，溶液B為三聚磷酸鈉溶液，將溶液A與B逐滴混勻，以3000 r/min離心，去除沉淀保留上清液[12]。殼聚糖納米顆粒平均粒徑為460 nm，平均濃度為0.19%。將0.2%的殼寡糖、0.2%的殼聚糖，以及0.2%、0.1%、0.02%的殼聚糖納米顆粒添加到基礎(chǔ)飼料中，另設(shè)一組不添加任何免疫添加劑的基礎(chǔ)飼料為對(duì)照，配制成6種紅鰭東方鲀?cè)囼?yàn)飼料，飼料現(xiàn)用現(xiàn)配。

表1 基礎(chǔ)飼料營(yíng)養(yǎng)成分

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理 將540尾紅鰭東方鲀隨機(jī)分成6組，每組設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行放30尾魚，于大連天正實(shí)業(yè)有限公司大黑石養(yǎng)殖場(chǎng)中暫養(yǎng)1周后開(kāi)始正式試驗(yàn)。用6種試驗(yàn)飼料投喂試驗(yàn)魚，分別記為空白對(duì)照組、0.2%殼寡糖組(0.2%COS組)、0.2%殼聚糖組(0.2%CS組)、0.2%殼聚糖納米顆粒組(0.2%CN組)、0.1%殼聚糖納米顆粒組(0.1%CN組)和0.02%殼聚糖納米顆粒組(0.02%CN組)，每日投喂5次，飽食投喂，早晚各清底1次，水溫控制在17～23 ℃，pH為7.5～8.0，24 h連續(xù)充氧，試驗(yàn)周期為50 d。

1.2.3 樣品采集 試驗(yàn)結(jié)束后，稱量各組中全部紅鰭東方鲀的體質(zhì)量并記錄，計(jì)算其特定生長(zhǎng)率(SGR,%/d)：

SGR=100%×(ln 終末體質(zhì)量-ln初始體質(zhì)量)/試驗(yàn)時(shí)間。

從每組隨機(jī)選取6尾紅鰭東方鲀幼魚作為測(cè)定混合樣本，分別取魚體的肝臟、腎臟和脾臟組織于液氮中速凍后存放于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。一部分用于檢測(cè)不同組織中的酶活性，另一部用于RNA的提取。

1.2.4 酶活性測(cè)定 在檢測(cè)酶活性之前，分別取出0.5 mg肝臟、腎臟、脾臟組織，加入4.5 mL的生理鹽水，研磨，4 ℃下以3000 r/min離心15 min。取上清分別測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、溶菌酶(LZM)的活性，試驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照南京建成生物工程研究所的試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。每個(gè)樣品分3個(gè)平行進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5 總 RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 試驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照莫納生物科技有限公司的RNA提取試劑說(shuō)明書進(jìn)行。提取紅鰭東方鲀不同組織中的總RNA，并取3 μL使用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，取1 μL用于RNA純度和濃度的檢測(cè)。OD260 nm/OD280 nm值在 1.9～2.1 之間的 RNA 可繼續(xù)按照莫納生物科技有限公司的MonScriptTMRTIII aII-in-one Mix(with dsDNase)說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，擴(kuò)增產(chǎn)物使用 10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果，并于-20 ℃下保存。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 選取β-actin作為內(nèi)參基因，以hsp70、ifr2、tlr3、c3作為目的基因，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表2)。試驗(yàn)步驟根據(jù)莫納生物科技有限公司的實(shí)時(shí)熒光定量PCR說(shuō)明書進(jìn)行，最后用2-△△CT法來(lái)計(jì)算4個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量[13]。每個(gè)樣品分3個(gè)平行進(jìn)行測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示，使用SPSS 24.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan法進(jìn)行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同添加劑組紅鰭東方鲀的生長(zhǎng)性能

從表3可見(jiàn)：殼寡糖和殼聚糖納米顆粒對(duì)紅鰭東方鲀幼魚生長(zhǎng)有顯著性影響(P<0.05)；飼料中添加0.2%殼寡糖、0.2%殼聚糖納米顆粒、0.02%殼聚糖納米顆粒的試驗(yàn)組幼魚終末體質(zhì)量和特定生長(zhǎng)率與對(duì)照組相比均有顯著升高(P<0.05)；各添加劑組中，0.2%殼聚糖納米顆粒組的促生長(zhǎng)效果最好，顯著好于殼聚糖組和殼寡糖組(P<0.05)。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

表3 飼料中不同免疫添加劑對(duì)紅鰭東方鲀生長(zhǎng)性能的影響

Tab.3 Effects of dietary immune additives on the growth of tiger pufferTakifugurubripes

組別group添加量additivelevel初始體質(zhì)量/ginitialbodyweight終末體質(zhì)量/gfinalbodyweight特定生長(zhǎng)率/(%·d-1)specificgrowthrate空白對(duì)照0(空白對(duì)照)9.822±0.44923.357±4.831a0.294±0.113a0.2%COS0.2%殼寡糖10.153±0.37625.610±1.387b0.337±0.031b0.2%CS0.2%殼聚糖10.387±0.11422.703±0.693a0.268±0.018a0.2%CN0.2%殼聚糖納米顆粒9.587±0.37028.707±5.794c0.341±0.059c0.1%CN0.1%殼聚糖納米顆粒9.673±0.07423.833±1.443a0.308±0.031a0.02%CN0.02%殼聚糖納米顆粒9.850±0.33026.490±1.379b0.362±0.037c

注：同列中標(biāo)有不同字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)，下同

Note:The means with different letters within the same column are significantly different in the groups at the 0.05 probability level, and the means with the same letters within the same column are not significant differences, et sequentia

2.2 不同添加劑組紅鰭東方鲀幾種非特異性免疫酶活性的變化

從表4可見(jiàn)：紅鰭東方鲀肝臟中，0.2%殼寡糖組、0.2%殼聚糖組、0.2%殼聚糖納米顆粒組和0.1%殼聚糖納米顆粒組AKP酶活性與對(duì)照組相比均顯著升高(P<0.05)，殼聚糖納米顆粒組與殼寡糖、殼聚糖組AKP酶活性有顯著性差異(P<0.05)；腎臟中，0.2%殼寡糖組和0.2%殼聚糖納米顆粒組AKP酶活性與對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P>0.05)，而添加0.2%殼聚糖組、0.1%殼聚糖納米顆粒組和0.02%殼聚糖納米顆粒組AKP酶活性較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)；脾臟中，所有試驗(yàn)組AKP酶活性與對(duì)照組均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

從表4可見(jiàn)：肝臟中，不同的添加劑組CAT酶活性均較對(duì)照組顯著升高(P<0.05)，0.2%殼聚糖納米顆粒組較對(duì)照組CAT酶活性提高了6.3倍，且0.2%殼聚糖納米顆粒組CAT酶活性較殼寡糖組和殼聚糖組有顯著性升高(P<0.05)；腎臟中，0.1%和0.02%殼聚糖納米顆粒組的CAT酶活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，且3個(gè)殼聚糖納米顆粒組CAT酶活性均顯著高于殼寡糖和殼聚糖組(P<0.05)；脾臟中，不同的添加劑組CAT酶活性均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

從表4可見(jiàn)：肝臟中，0.2%殼寡糖組、0.2%殼聚糖納米顆粒組的SOD酶活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，且0.2%殼聚糖納米顆粒組顯著高于0.2%殼寡糖組(P<0.05)；腎臟中，所有海洋多糖添加劑試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，SOD酶活性均顯著升高(P<0.05)，但所有殼聚糖納米顆粒組與殼寡糖組均未表現(xiàn)出顯著性差異(P>0.05)，與殼聚糖組表現(xiàn)出顯著性差異(P<0.05)；脾臟中，0.2%殼寡糖組和0.1%殼聚糖納米顆粒組SOD酶活性與對(duì)照組相比略有升高(P>0.05)。

從表4可見(jiàn)：肝臟中，0.2%殼寡糖組、0.2%殼聚糖組的ACP酶活性與對(duì)照組相比均顯著升高(P>0.05)；腎臟中，所有海洋多糖添加劑試驗(yàn)組ACP酶活性與對(duì)照組相比均降低；脾臟中，所有海洋多糖添加劑試驗(yàn)組ACP酶活性與對(duì)照組相比均有顯著升高(P<0.05)。

從表4可見(jiàn)：肝臟中，除0.02%殼聚糖納米顆粒組外其他海洋多糖添加劑組的LZM酶活性均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；腎臟中，所有海洋多糖添加劑試驗(yàn)組LZM酶活性與對(duì)照組相比均升高，除0.2%殼寡糖組無(wú)顯著性差異外其他組均表現(xiàn)出顯著性差異(P<0.05)；脾臟中，所有海洋多糖添加劑試驗(yàn)組LZM酶活性與對(duì)照組相比均顯著升高(P<0.05)，且0.1%和0.02%殼聚糖納米顆粒組LZM酶活性均顯著高于殼寡糖組(P<0.05)。

表4 飼料中不同添加劑對(duì)紅鰭東方鲀相關(guān)免疫酶活性的影響

Tab.4 Effects of dietary additives on the activities of related immune enzymes in tiger pufferTakifugurubripesU/100 mL

組織tissue添加量additivelevel堿性磷酸酶AKP過(guò)氧化氫酶CAT超氧化物歧化酶SOD酸性磷酸酶ACP溶菌酶LZM肝臟liver0(空白對(duì)照)0.184±0.019b7.160±0.479a0.561±0.084b0.170±0.004b1.133±0.044c0.2%殼寡糖0.432±0.037e16.938±0.512c0.684±0.058e0.203±0.003d0.778±0.047b0.2%殼聚糖0.559±0.021f35.382±1.845e0.366±0.026a0.180±0.001c0.891±0.056b0.2%殼聚糖納米顆粒0.373±0.095d53.164±1.332f0.715±0.017f0.152±0.005a0.480±0.053a0.1%殼聚糖納米顆粒0.257±0.026c21.027±1.964d0.312±0.017a0.171±0.003b0.505±0.053a0.02%殼聚糖納米顆粒0.057±0.060a11.978±0.644b0.351±0.009a0.171±0.002b3.302±0.059d腎臟kidney0(空白對(duì)照)0.072±0.012c5.660±0.194c11.910±0.165a0.852±0.012d0.849±0.070a0.2%殼寡糖0.078±0.015c3.983±0.274a14.614±0.408b0.660±0.022c1.330±0.121a0.2%殼聚糖0.040±0.006b3.508±0.231a19.918±0.597c0.545±0.041b2.779±0.306c0.2%殼聚糖納米顆粒0.066±0.011c4.578±0.044b15.115±0.327b0.558±0.057b2.045±0.362b0.1%殼聚糖納米顆粒0.019±0.003a6.845±0.239d15.409±0.190b0.478±0.030a2.496±0.205b0.02%殼聚糖納米顆粒0.027±0.008a7.317±0.495e15.279±0.431b0.825±0.051d2.497±0.317b脾臟spleen0(空白對(duì)照)0.014±0.005a12.502±0.445e11.411±0.210c0.154±0.029a0.120±0.009a0.2%殼寡糖0.008±0.001a2.407±0.223a12.000±0.464c0.308±0.019b0.773±0.038b0.2%殼聚糖0.025±0.001a4.990±0.096b10.150±0.247b0.552±0.037d1.347±0.131c0.2%殼聚糖納米顆粒0.006±0.003a7.903±0.471d8.298±0.434a0.538±0.020d0.763±0.132b0.1%殼聚糖納米顆粒0.004±0.002a4.413±0.295b11.459±0.457c0.380±0.044c1.559±0.083c0.02%殼聚糖納米顆粒0.016±0.007a6.540±0.370c8.829±0.461a0.539±0.041d2.496±0.148d

2.3 不同添加劑組紅鰭東方鲀幾種免疫相關(guān)基因表達(dá)的變化

從圖1可見(jiàn)：腎臟中，0.2%殼寡糖組、0.2%殼聚糖組的c3基因表達(dá)量與對(duì)照組相比均顯著增高(P<0.05)，添加不同濃度的殼聚糖納米顆粒組與對(duì)照組均無(wú)顯著性差異(P>0.05)；肝臟中，所有海洋多糖添加劑試驗(yàn)組c3基因的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比均降低；脾臟中，所有海洋多糖添加劑試驗(yàn)組c3基因的相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組，除0.1%殼聚糖納米顆粒組外其他組均顯著升高(P<0.05)。

從圖2可見(jiàn)：腎臟中，所有海洋多糖添加劑試驗(yàn)組hsp70基因相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比均顯著降低(P<0.05)；肝臟中，除了0.2%殼聚糖納米顆粒組hsp70基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組外(P<0.05)，其他海洋多糖添加劑試驗(yàn)組hsp70基因相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組；脾臟中，所有海洋多糖添加劑試驗(yàn)組hsp70基因相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比均有增加。

從圖3可見(jiàn)：腎臟中，0.2%殼寡糖組、0.2%殼聚糖組、0.1%殼聚糖納米顆粒組ifr2基因相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；肝臟中，除了0.02%殼聚糖納米顆粒組ifr2基因相對(duì)表達(dá)量略高于對(duì)照組外，其他海洋多糖添加劑試驗(yàn)組ifr2基因表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；脾臟中，所有海洋多糖添加劑試驗(yàn)組ifr2基因相對(duì)表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

從圖4可見(jiàn)：腎臟中，0.2%殼寡糖組、0.2%殼聚糖組的tlr3基因相對(duì)表達(dá)量略高于對(duì)照組(P>0.05)，所有殼聚糖納米顆粒試驗(yàn)組tlr3基因相對(duì)表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；肝臟中，0.1%殼聚糖納米顆粒組、0.02%殼聚糖納米顆粒組的tlr3基因相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組，分別提高0.1倍、0.7倍，其他海洋多糖添加劑組的tlr3基因相對(duì)表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；脾臟中，0.2%殼寡糖組、0.2%殼聚糖納米顆粒組和0.1%殼聚糖納米顆粒組tlr3基因相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比均顯著升高(P<0.05)。

3 討論

3.1 不同添加劑對(duì)紅鰭東方鲀生長(zhǎng)性能的影響

本試驗(yàn)中，添加殼聚糖納米顆粒對(duì)紅鰭東方鲀的生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用，且飼料中添加0.2%相同濃度的殼聚糖納米顆粒比殼寡糖的促進(jìn)效果更好，分析原因可能是殼聚糖納米顆粒易通過(guò)內(nèi)吞方式進(jìn)入細(xì)胞[16]。殼聚糖納米顆粒尺寸小，其負(fù)載小分子物質(zhì)的能力較強(qiáng)，水溶性較好、穩(wěn)定性強(qiáng)，能促進(jìn)細(xì)胞的吞噬作用[17]，更容易被紅鰭東方鲀利用。

3.2 不同添加劑對(duì)紅鰭東方鲀免疫酶活性的影響

AKP是一種磷酸單酯酶, 可直接參與魚類機(jī)體磷的代謝, 在DNA、RNA、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝中有極其重要的生理功能[18]，也是魚類體內(nèi)巨噬細(xì)胞溶酶體的標(biāo)志性酶, 在魚類機(jī)體內(nèi)磷酸基團(tuán)的代謝中發(fā)揮重要作用，其活性的高低反映了溶酶體酶防御和消化功能的強(qiáng)弱[19]。本試驗(yàn)中，飼料中添加殼聚糖納米顆粒和殼寡糖組一樣，能使肝臟中AKP活性顯著提高，這說(shuō)明，其在肝臟中發(fā)揮了重要的解毒作用，有助于魚體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和自身的生長(zhǎng)，可促進(jìn)機(jī)體的代謝。

動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的有害超氧陰離子自由基會(huì)通過(guò)各種應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞活動(dòng)而產(chǎn)生，自身及其衍生出的活性產(chǎn)物，都具有毒性作用，可引起細(xì)胞和組織的氧化損傷[20]。SOD 和 CAT 酶可分別清除機(jī)體內(nèi)超氧陰離子自由基和自由基被分解過(guò)后的氧化氫產(chǎn)物，其活性的高低可反映動(dòng)物機(jī)體在脅迫環(huán)境下的免疫力[21]。本試驗(yàn)中，飼料中添加殼聚糖納米顆粒組CAT酶在魚體肝臟中活性升高，分析原因可能是試驗(yàn)過(guò)程中由于小瓜蟲病的暴發(fā)，向養(yǎng)殖水體中投入了不同程度的雙氧水來(lái)殺滅小瓜蟲，導(dǎo)致其活性在紅鰭東方鲀體內(nèi)積累，進(jìn)而損傷細(xì)胞，從而激活了肝臟CAT酶分解過(guò)量的過(guò)氧化氫，以及激活腎臟中SOD酶分解大量活性氧自由基。

溶菌酶為一種堿性蛋白酶, 在魚類的皮膚黏液、吞噬細(xì)胞、血清及組織器官中均有分布，在魚體的非特異性免疫系統(tǒng)中占有重要地位[22]。本試驗(yàn)中，所有海洋多糖添加劑試驗(yàn)組溶菌酶活性在腎臟、脾臟中都顯著增加，說(shuō)明添加多糖類物質(zhì)可提高魚體溶菌酶活性，增加吞噬細(xì)胞活性，抵御異物入侵，且腎臟中殼聚糖納米顆粒組均顯著高于寡糖組和對(duì)照組，說(shuō)明殼聚糖納米顆粒具有一定的抗菌作用，這與之前的研究結(jié)果一致[23]。

3.3 不同添加劑對(duì)紅鰭東方鲀免疫基因的影響

補(bǔ)體是抗體與吞噬細(xì)胞間連接的中介, 能在非特異性免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要的作用,c3在補(bǔ)體系統(tǒng)中占關(guān)鍵性地位,被激活后的補(bǔ)體c3有溶菌、殺菌、殺病毒的作用, 也能滅活細(xì)菌胞外的毒素[24]。本試驗(yàn)中，殼聚糖納米顆粒添加劑能有效促進(jìn)脾臟中補(bǔ)體c3的表達(dá)量，而脾臟和腎臟是紅鰭東方鲀的主要免疫器官，說(shuō)明添加殼聚糖納米顆粒可增加脾臟免疫器官對(duì)病原菌的抗性。

熱休克蛋白70(hsp70)是一類重要的非特異性細(xì)胞保護(hù)蛋白，具有抗氧化、分子伴侶、抗原遞呈和免疫等作用。hsp70能調(diào)節(jié)機(jī)體非特異性的免疫應(yīng)答過(guò)程，即當(dāng)免疫細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答時(shí)，免疫細(xì)胞如淋巴細(xì)胞等分泌的一些細(xì)胞因子可誘導(dǎo)生成hsp70，hsp70協(xié)同免疫細(xì)胞完成一系列應(yīng)答過(guò)程[25]。本試驗(yàn)中，殼聚糖納米顆粒添加組hsp70基因在脾臟中表達(dá)顯著增加。推測(cè)殼聚糖納米顆粒的刺激作用能有效地激發(fā)脾臟hsp70協(xié)助抗原提呈細(xì)胞將抗原提呈給淋巴細(xì)胞，促進(jìn)淋巴細(xì)胞分泌溶菌酶，從而提高紅鰭東方鲀抗逆性。這與溶菌酶活性測(cè)定結(jié)果一致。

干擾素調(diào)節(jié)因子ifr2是一種轉(zhuǎn)錄因子，主要調(diào)節(jié)Ⅰ型干擾素、干擾素刺激基因的表達(dá)[26]，在機(jī)體免疫反應(yīng)中有重要作用，如抗菌、細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、病原體應(yīng)答和細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)等反應(yīng)過(guò)程。本試驗(yàn)中，干擾素調(diào)節(jié)因子ifr2在各個(gè)組織中表達(dá)量未有顯著變化，表明以上海洋多糖添加劑對(duì)紅鰭東方鲀ifr2基因的表達(dá)沒(méi)有明顯促進(jìn)作用。

tlr3是Toll樣受體之一，是一種跨膜受體，位于細(xì)胞表面，主要作用于信號(hào)傳導(dǎo)，在識(shí)別病原、激活先天免疫和誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫方面具有重要作用[27]。本試驗(yàn)中，添加殼聚糖納米顆粒的試驗(yàn)組脾臟中Toll樣受體tlr3基因表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，推測(cè)添加多糖后可增強(qiáng)跨膜受體對(duì)病原菌的識(shí)別，刺激下游免疫反應(yīng)的發(fā)生，進(jìn)而提高魚體免疫力。

4 結(jié)論

在本試驗(yàn)條件下，殼聚糖米顆?？捎行Т龠M(jìn)紅鰭東方鲀的生長(zhǎng)，能顯著增加肝臟的AKP、CAT酶活性，脾臟的ACP、LZM活性，以及腎臟的SOD、LZM酶活性，提高脾臟中c3、tlr3、hsp70基因的相對(duì)表達(dá)量，對(duì)魚體免疫力的提高有一定的促進(jìn)作用。

同時(shí)，添加殼聚糖納米顆粒與殼寡糖組效果相當(dāng)，總體看，可為下一步紅鰭東方鲀免疫增強(qiáng)劑的添加提供新的選擇。