人參皂苷的乙醇溶出性能及分布特征研究

侯明韜，李瀟然，曹 芮，遲乃超

（1.中國建筑材料科學(xué)研究總院，北京100024；2.中國建材檢驗認(rèn)證集團(tuán)股份有限公司，北京100024；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京100700）

人參素有“百草之王”的稱號，其具有多種藥理功能，在我國中醫(yī)的使用中已有悠久歷史。人參皂苷是人參中的主要有效成分，其包含原人參二醇（PPD）類、原人參三醇（PPT）類、齊墩果酸（OA）類及其他型皂苷[1]。由于不同來源的人參中皂苷含量有所差異，因此其含量成為人參品質(zhì)的重要評價指標(biāo)。目前，人參中皂苷的檢測方法主要包括比色法、紫外分光光度法、薄層色譜法、液相色譜法、液相色譜-串接質(zhì)譜法等[2～6]。此外，使用液相色譜-四級桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜、超高效液相色譜-三重四級桿-線性離子阱等高端質(zhì)譜儀檢測人參及其制品中的皂苷含量也已經(jīng)被使用[7～10]。

值得注意的是，人參的前處理方式對人參皂苷的測定亦有較大影響。目前，通過粉碎樣品后，使用超聲萃取、索氏提取及加壓流體萃取人參樣品中皂苷是其檢測的主要前處理方式[2,11,12]，其提取效率高，為人參品質(zhì)的鑒別提供了重要支持。但是，此類前處理方法對樣品的破壞性大，且提取利用的有機(jī)溶劑（三氯甲烷、甲醇、正丁醇、石油醚等）[3,7,11,13]皆不是食品行業(yè)適宜使用的有機(jī)物，導(dǎo)致其提取效率雖高，但測定結(jié)果不能真實反饋人參中的皂苷在醫(yī)藥食品行業(yè)的實際提取及利用效率。

目前，人參的利用方式主要包括整支入藥煎服及制備各類保健制品，其中人參泡酒是人參利用的重要方式之一，其具有保健功效，可輔助治療各類疾病，且制備方式簡單。家庭制備人參酒主要通過靜態(tài)浸泡，在常溫常壓下，利用白酒中的乙醇溶解人參中的皂苷。但是，此方法制備人參酒通常需要較長的時間，且采購高品質(zhì)的人參需要較高的價格，限值了其推廣程度。

在已有的研究中，證明人參葉及花中同樣存在高含量的人參皂苷[1,11,14]，如使用其進(jìn)行藥酒的制備，可減少人參酒的制備成本。但是，目前針對人參各部位皂苷在乙醇中溶出特性的系統(tǒng)研究較少[12,15～17]。本研究中，模擬人參酒的制備條件，在常溫常壓下考察人參葉、花及根中皂苷的乙醇溶出特性，并分析人參各部位皂苷的分布規(guī)律，為人參酒的制備及利用提供支持。

1 實驗材料及儀器

1.1 實驗材料

購置不同來源及產(chǎn)地經(jīng)過風(fēng)干后的人參葉、花及根（根：1～5 年，切片 1～2 mm）編號；采集市售不同來源的人參藥酒并編號；人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品Rg1（99.4%，批號：Z6140050）、Re （100%，批號：Y9070100）、Rb1（99.3%， 批號：Y4250050）、Rc （98.5%， 批號：12360025）、Rb2 （98.5%， 批號：Z9980025）、Rd（100%，批號：R7880050）均購置于上海安普實驗科技股份有限公司；無水乙醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純）；乙腈（Fisher，色譜純）；實驗用水為 Milli-Q 超純水系統(tǒng)制備。

1.2 實驗設(shè)備

島津LC 20AT高效液相色譜（二元梯度淋洗，紫外檢測器）；梅特勒ME204E電子天平；梅特勒MS105DU電子天平。

2 實驗方法

2.1 色譜條件

色譜柱：島津 InertSustain C18色譜柱（5μm，4.6×150mm）；流動相為乙腈-水溶液，梯度淋洗程序：0～10 min，10% 乙腈→22% 乙腈；10～16 min，22%乙腈；16～30 min，22% 乙腈→60% 乙腈；30～35 min，60%乙腈→100% 乙腈；35～40 min，100%乙腈；40～42 min，100%乙腈→10% 乙腈；42～55 min，10% 乙腈；流動相流速為1.2 mL/min，柱溫20°C，檢測器波長203 nm，進(jìn)樣量為20 μL；該條件下標(biāo)準(zhǔn)品分離效果良好，色譜圖見圖1。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Figure 1 Chromatogram of mixed standard solution

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

使用十萬分之一電子天平精確稱取Rg1 4.87 mg，Re 5.04 mg，Rb1 4.62 mg，Rc 5.21 mg，Rb2 5.01 mg，Rd 5.32 mg于50 mL容量瓶中，使用甲醇溶解后定容，得到濃度分別為 97.4，100.8，92.4，104.2，100.2，106.4 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液。將此溶液稀釋后，配制標(biāo)準(zhǔn)系列溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，各組分經(jīng)液相色譜法測定，使用峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（Rg1:y=7084.65 x- 1762.47,R2=0.9999;Re=5799.64 x- 406.33,R2=0.9998;Rb1:y=4511.55 x- 59.7726,R2=0.9999;Rc:y=4858.59 x-152.457,R2=0.9999;Rb2:y=5487.10 x- 274.332,R2=0.9999;Rd:y=5974.40 x+265.557,R2=0.9998）。

2.3 樣品浸泡

使用乙醇與水按一定比例混合，配制樣品浸泡溶液，取200 mL倒入250 mL磨砂廣口瓶中。取完整干凈實驗材料（人參葉、花及根），用天平稱取一定質(zhì)量后，小心的放入裝有浸泡溶液的廣口瓶中，輕輕震搖廣口瓶，使實驗樣品全部浸泡于浸泡液中，將廣口瓶蓋緊，于室溫下（25±2°C）避光處保存。

2.4 樣品測試

使用1 mL一次性滅菌注射器吸取浸泡液樣品，經(jīng)過0.22 μm有機(jī)相過濾膜過濾后，使用液相色譜測定上述六種皂苷濃度，并以其和計算總皂苷含量。風(fēng)干的人參葉、花及根中皂苷含量計算公式如下：

其中，ρ— 樣品中皂苷含量，g/kg；

c—浸泡溶液中皂苷測試濃度，mg/L；

有了和小阿布的親情后，甲洛洛更關(guān)注登子，可對登子幾乎沒什么跟蹤價值，他每天早上六點起床就開始在門口一間用幾張木板搭的小房子里叮叮當(dāng)當(dāng)?shù)厍么蛑鲆恍└畈莸溺牭叮┕返逆溩?，挖地的鋤頭。而且一整天除了吃一坨糌粑，上、下午在院壩的一個角落里去撒尿外，不去任何地方。三五天有個人找上門去買一些這些東西，但大多是用糌粑換的，而且他從來不給人家討價還價。

v—浸泡液體積，L；

m—樣品質(zhì)量，g；

n—測試溶液稀釋倍數(shù)。

3 結(jié)果與討論

3.1 乙醇含量對皂苷溶出性能的影響

實驗考察不同乙醇含量對人參葉、花及根中人參皂苷溶出性能的影響。實驗分別在乙醇-水含量（v/v%）為0～100%的范圍內(nèi)進(jìn)行，詳見圖2。如圖所示，乙醇含量對人參不同部位皂苷的溶出量有明顯影響，使用純水做浸泡液浸泡人參葉、花及根時，均可獲得較好的皂苷溶出效果（葉：623 mg/L，花：674 mg/L，根：51.5 mg/L），但隨乙醇濃度的提高，人參葉與花的浸泡液中總皂苷溶出量降低（其規(guī)律與Rg1及Re相關(guān)性較大），最低值均出現(xiàn)在乙醇含量為10%的實驗組。之后，隨乙醇含量的繼續(xù)提高，人參葉、花中的皂苷溶出含量逐漸提高，但當(dāng)乙醇含量達(dá)到100%時，測試的6種皂苷含量均出現(xiàn)斷崖上下跌，實驗范圍內(nèi)，人參葉、花及根的100%乙醇浸泡液中的總皂苷含量均為實驗范圍內(nèi)最低，相似的結(jié)論在文獻(xiàn)中亦有報道[12,16,18]，證明過高的乙醇含量不利于皂苷的溶出。

圖2 乙醇含量對a）人參葉，b）人參花，c）人參根中皂苷溶出性能的影響，實驗條件：固液比（m/v）=1/100，乙醇含量=0-100%，人參葉浸泡時間=20 d，人參花浸泡時間=20 d，人參根浸泡時間=30 dFigure 2 Effect of alcohol content on the dissolution performance of ginsenoside in a)ginseng leaf,b)ginseng flower and c)ginseng root,experimental condition:solid-liquid ratio=1/100,alcohol content=0- 100%,soaking time of ginseng leaf=20 d,soaking time of ginseng flower=30 d,soaking time of ginseng root=30 d

此外，由實驗結(jié)果可知，人參葉、花及根的最大總皂苷溶出含量出現(xiàn)在乙醇含量為60～80%的范圍內(nèi)，由此可見，使用較高含量乙醇的白酒作為人參酒的浸泡溶液較適合提高液相的皂苷含量。雖然乙醇含量為80%的浸泡溶液可以獲得最高的皂苷溶出結(jié)果，但高濃度乙醇含量的白酒不便被消費者接受。在我國，53～58°白酒為市面上較易獲得的品種，其乙醇含量適宜，較易被廣大消費者接受，適合家庭人參泡酒使用。因此后續(xù)實驗均選擇乙醇含量60%做浸泡液進(jìn)行。

3.2 浸泡時間對皂苷溶出性能的影響

實驗分別考察人參葉、花及根中皂苷的溶出量與浸泡時間之間的關(guān)系。由圖3可知，人參不同部位的皂苷溶出速度有明顯區(qū)別：人參葉片浸泡液中的皂苷含量在浸泡5天時達(dá)到穩(wěn)定；人參花浸泡液中的皂苷在浸泡10天時達(dá)到穩(wěn)定；人參根則需要浸泡30天后，浸泡液中的皂苷才可以達(dá)到穩(wěn)定，這可能是人參葉、花較易被浸泡液滲透的緣故。由此可見，選擇人參葉片及花作為浸泡藥酒的材料，可以節(jié)約浸泡時間，提高生產(chǎn)效率。

圖3 浸泡時間對a）人參葉，b）人參花，c）人參根中皂苷溶出性能的影響，實驗條件：固液比=1/100，乙醇含量=60%，浸泡時間=20～30 dFigure 3 Effect of soaking time on the dissolution performance of ginsenoside in a)ginseng leaf,b)ginseng flower and c)ginseng root,experimental condition:solid-liquid ratio=1/100,alcohol content=60%,soaking time=20～30 d

3.3 固液比對皂苷浸出性能的影響

實驗分別在廣口瓶中加入不同質(zhì)量的實驗樣品，考察浸泡實驗下的最佳固液比。本研究中，考慮到廣口瓶的最大實驗樣品容納能力，分別在固液比（m/v%）為 0.125%～1.5%、0.5%～5%、0.5%～7%的范圍內(nèi)考察人參葉、花及根的皂苷溶出效果。經(jīng)過30 d時間浸泡后發(fā)現(xiàn)，詳見圖4，在60%的乙醇中，浸泡液中的總皂苷含量與固液比間有較好的線性關(guān)系 （R＞0.994），證明固液比的增加不會影響人參各部位的皂苷溶出能力，因此在人參藥酒的制備過程中，可以通過提高浸泡材料的固液比，獲得皂苷含量較高的藥酒。

圖4 固液比對a）人參葉，b）人參花，c）人參根中皂苷溶出性能的影響；實驗條件：乙醇含量=60%，浸泡時間=30 d；固液比 m/v：人參葉0.125～1.5%，人參花0.5～5%，人參切片0.5～7%Figure 4 Effect of solid-liquid ratio on the dissolution performance of ginsenoside in a)ginseng leaf,b)ginseng flower and c)ginseng root,experimental condition:alcohol content=60%,soaking time=30 d,solid-liquid ratio:ginseng leaf 0.125～1.5%,ginseng flower 0.5～5%,ginseng root 0.5～7%

3.4 人參皂苷的分布特性

研究收集19種人參葉、花及根樣品，考察浸泡條件下人參不同部位皂苷的溶出分布規(guī)律。由圖5可知，人參不同部位的皂苷含量及比例存在一定差異（結(jié)果以樣品中含量計算，g/kg）。例如，人參葉中的Rg1顯著高于人參花及根中的含量；人參葉與花中的Re、Rc、Rb2及Rd含量顯著高于人參根中的含量，導(dǎo)致人參葉及花中的總皂苷含量（114 g/kg與119 g/kg）顯著高于人參根中的總皂苷含量（12.3 g/kg）。

圖5 人參各部位皂苷含量分布；實驗條件：浸泡時間=30d，乙醇含量=60%，固液比m/v=1/100Figure 5 Distribution content of ginsenoside in various part of ginseng,experimental condition:alcohol content=60%,soaking time=30 d,solid-liquid ratio=1/100

圖6 人參各部位皂苷含量分布比例；實驗條件：浸泡時間=30d，乙醇含量=60%，固液比m/v=1/100Fig.6 Distribution ratio of ginsenoside in various parts of ginseng,experimental condition:alcohol content=60%,soaking time=30 d,solid-liquid ratio=1/100

此外，人參不同部位的各種皂苷含量比例也存在區(qū)別（圖6）。例如，在人參葉片及人參根中，Rg1平均含量占比達(dá)到16.29%～25.01%，而在人參花中僅為4.57%；人參葉及人參花中的Rb1平均含量僅為4.33%～7.04%，而其在人參根中占29.78%；人參葉及花中的Rd為17.93%～23.75%，但在人參根中Rd含量僅為3.36%。

圖7 六種人參皂苷的PCA分析雙標(biāo)Fig.7 Bioplot of PCA based on 6 gnsenosides

為進(jìn)一步驗證人參皂苷的分布規(guī)律與人參部位的關(guān)系，使用PCA雙標(biāo)圖對測定數(shù)據(jù)進(jìn)行分析（CANOCO 5.0，圖7）。如圖所示，主成分1和2共解釋了總變量的98.32%，證明其保留了原始數(shù)據(jù)中大部分的信息量。不同采樣部位在PCA圖中呈明顯分離，表明皂苷含量在這三個部位的差異性較大。其中，根與主成分1表現(xiàn)出極度正相關(guān)性，而花與主成分2表現(xiàn)出極度正相關(guān)性。PCA雙標(biāo)分析圖中，Rg1屬性箭頭指向葉片，Rb1屬性箭頭指向人參花，證明此兩者在區(qū)分皂苷來源上起到重要作用，上述結(jié)果在皂苷含量分布規(guī)律上亦有體現(xiàn)（圖5-6），皂苷在人參不同部位含量差異的機(jī)理值得研究。由于不同種類人參皂苷的醫(yī)藥功效存在區(qū)別（表1），選擇含有適宜皂苷含量較多的人參部位有利于提高人參的利用效果。

表1 不同人參皂苷功能Table 1 Medical function of various ginsenosides

3.5 實際人參酒樣品的測定

實驗收集了不同來源的16個人參藥酒樣品 （人參根浸泡），對其中的皂苷成分進(jìn)行分析。結(jié)果見表2?？梢园l(fā)現(xiàn)，測試樣品中的總皂苷含量處于71.3～1140 mg/L之間，平均值為359 mg/L，實驗樣品中皂苷含量存在差異，這可能與泡酒使用的人參質(zhì)量有關(guān)。實驗測試的樣品中，最大總皂苷含量（S2，1140 mg/L）與上述人參葉片及花于60%乙醇浸泡液浸泡后得到的總皂苷含量相似 （人參葉：1008～1290 mg/L，人參花：1022～1382 mg/L）， 然而實驗采購的人參葉（50 RMB/500g～100 RMB/500g）及花（100 RMB/500g～200 RMB/500g）相較于人參根（150 RMB/500g～600 RMB/500g，＜5年）更加廉價，因此人參葉及花或許可以作為廉價材料，代替人參炮制藥酒。

表2 藥酒樣品皂苷含量分析，mg/LTable 2 Ginsenoside content in liquor samples,mg/L

4 結(jié)論

研究優(yōu)化了人參各部位在乙醇-水溶液中的浸泡條件，提高了人參皂苷的溶出能力。人參各部位的皂苷含量存在一定差異，且人參葉及花中皂苷的平均含量顯著高于人參根中的皂苷含量，通過合理使用人參葉、花，可以提高人參酒中皂苷的成分，達(dá)到提高藥酒質(zhì)量的作用，其或許可以成為人參酒制備行業(yè)的發(fā)展方向。