正交優(yōu)化超聲輔助雙水相法粗提雪菊色素

李娜，夏娜，王玉濤，朱思明, *

1. 喀什大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院（喀什 834000）；2. 華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院（廣州 510641）

雪菊（Coreopsis tinctoriaNutt.）學(xué)名蛇目菊，為高寒野生植物，有極高藥用價(jià)值。中藥記載雪菊有解毒、化瘀及健脾的功效；現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，雪菊有降脂、將壓、降糖、改善胰島素敏感性等藥理作用[2]。此外，雪菊有養(yǎng)生、保健功能，泡茶可治口渴、腸胃不適、痢疾、瘡癤等[3]。國(guó)內(nèi)外研究者在雪菊理化性質(zhì)、栽培等方面開(kāi)展大量研究，取得一定成果，為開(kāi)發(fā)雪菊經(jīng)濟(jì)價(jià)值提供理論指導(dǎo)。

雪菊的提取方法包括水或醇浸提、回流、超聲、微波、超臨界、亞臨界水技術(shù)，并輔助響應(yīng)面優(yōu)化、隨機(jī)質(zhì)心映射優(yōu)化、正交等技術(shù)研究最佳提取工藝?？傸S酮含量測(cè)定方法主要有ZrOCl2法、NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法、AlCl3、HCl-Mg粉法、差示分光光度法、FS、TLCS、HPLC及毛細(xì)管電泳等。有研究表明，差示分光光度法測(cè)定結(jié)果與HPLC法相符，表明該法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)單，有良好的穩(wěn)定性、重復(fù)性[13]。因此，試驗(yàn)采用差示分光光度法，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的最大吸收波長(zhǎng)不一致，對(duì)2種波長(zhǎng)下所得數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，測(cè)定樣品含量。

因傳統(tǒng)雙水相技術(shù)所用聚合物黏度大、成本高、效率低、目標(biāo)物回收處理困難[5]，應(yīng)用受限。改進(jìn)后的低級(jí)醇-鹽雙水相系統(tǒng)可攻克上述弊端，又有易于放大、可連續(xù)化操作、易集成及綠色環(huán)保及組成多樣等優(yōu)點(diǎn)，被應(yīng)用于天然代謝物的提取分離[5]。應(yīng)用較多的是乙醇或正丙醇與無(wú)機(jī)鹽組成的雙水相體系，并輔助超聲、微波等技術(shù)優(yōu)化分離工藝，不僅可以簡(jiǎn)化分離工藝且提高分離效率。國(guó)內(nèi)外關(guān)于雪菊色素提取的報(bào)道較少。此外，由于合成色素對(duì)環(huán)境、人體健康危害越來(lái)越大，天然色素的應(yīng)用越來(lái)越普及，市場(chǎng)需求越來(lái)越大。近年來(lái)，雪菊已廣泛種植，因此合理開(kāi)發(fā)雪菊的商業(yè)價(jià)值尤為重要。試驗(yàn)以雪菊為研究對(duì)象，采取正丙醇（NPA）/硫酸銨構(gòu)造雙水相系統(tǒng)（ATPS）輔助超聲波技術(shù)粗提雪菊色素，并借助正交試驗(yàn)確定最優(yōu)提取條件，研究雙水相應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)的可行性，為工業(yè)生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雪菊（喀什市東巴扎市場(chǎng)）；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)B20771，純度HPLC≥98%，Shanghai Yuanye Bio- Technology Co.，Ltd.）；正丙醇（分析純，Aladdin Reagent Co.，Ltd.）；硫酸銨（分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠）；ZrOCl2·8H2O（分析純，阿拉丁試劑有限公司）；蒸餾水。

滴定管；移液管；分析天平（BSA223S，Sartorius Scientific Instruments Co.，Ltd.）；電子秤（JJ1000，常熟雙杰測(cè)試儀器廠）；容量瓶；超聲清洗儀；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；0.45 μm水系針頭濾器、有機(jī)系針頭濾器（0.45 μm，25 mm；AMERITECH SCIENTIFIC）；分液漏斗；具塞磨口錐形瓶；量筒

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 雪菊預(yù)處理

純凈干燥的雪菊粉末，過(guò)20目篩，再過(guò)100目篩，分成2份，密封袋保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 雙水相分相

一些小分子醇與一些無(wú)機(jī)鹽水溶液作用可形成ATPS。劉磊磊等[9]發(fā)現(xiàn)NPA的分相能力大于異丙醇、乙醇；對(duì)比K3PO4、K2HPO4、KH2PO4、(NH4)2SO4分相能力發(fā)現(xiàn)均能構(gòu)成ATPS，其中(NH4)2SO4分相能力最佳，可于鹽量較少情況下分相，故試驗(yàn)選擇NPA和(NH4)2SO4構(gòu)造ATPS。采用濁點(diǎn)法繪制ATPE相圖，操作步驟為：精密稱取9.000 0 g左右的(NH4)2SO4于小燒杯中，滴定管加入一定體積的水（13.55 mL）至(NH4)2SO4溶解，形成(NH4)2SO4溶液；磁力攪拌器攪拌下，滴定管緩慢滴加NPA至溶液出現(xiàn)渾濁即為滴定終點(diǎn)，記錄NPA加入量；向體系加入一定體積的水至溶液澄清，記錄水的加入量，向澄清液滴加一定體積NPA至渾濁，記錄NPA加入量，如此反復(fù)操作，結(jié)果見(jiàn)圖1。

1.2.3 雪菊中色素的雙水相提取

準(zhǔn)確稱取一定量(NH4)2SO4于250 mL具塞錐形瓶中，加定量蒸餾水，振蕩溶解；加入一定量NPA，建立總質(zhì)量20.0 g NPA/(NH4)2SO4ATPS[5]，稱取一定量雪菊粉末加入到已構(gòu)建的20.0 g體系中；用超聲清洗儀在一定溫度和時(shí)間下萃取。萃取結(jié)束，放置一段時(shí)間，等上下相完全分層，分液漏斗過(guò)濾，分別讀取上下相體積，分得的醇相和水相分別過(guò)有機(jī)濾膜和水膜。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

根據(jù)步驟1.2.3，分別研究(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)（25%，26%，27%，28%，29%和30%），NPA質(zhì)量分?jǐn)?shù)（20%，21%，22%，23%，24%和25%），雪菊粉末用量（0.02，0.04，0.05，0.06，0.08和0.10 g）、pH（1，3，5，7和9）、超聲溫度（20，30，40，50和60℃）及時(shí)間（20，40，60，80和90 min）6個(gè)因素對(duì)雪菊色素提取的影響。

1.2.5 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)、NPA質(zhì)量分?jǐn)?shù)、雪菊粉末用量、溫度、時(shí)間、pH進(jìn)行正交試驗(yàn)考察，每個(gè)因素3個(gè)水平，優(yōu)選雪菊色素提取工藝，用正交設(shè)計(jì)助手（Latin）設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，因素水平表如表1。

圖1 正丙醇/硫酸銨雙水相圖

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

1.2.6 雪菊色素含量測(cè)定

提取后的雪菊色素主要富集于上相，下相含量較少（對(duì)雪菊色素提取液上相和下相分別顯色，發(fā)現(xiàn)下相中色素含量很少，后續(xù)試驗(yàn)采用上相溶液測(cè)量）。上相過(guò)0.45 μm有機(jī)濾膜，以總黃酮為指標(biāo)測(cè)量雪菊色素含量。

1.2.6.1 蘆丁對(duì)照品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.3 mg，加少量60%乙醇，超聲溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，60%乙醇定容至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度0.206 mg/mL的蘆丁對(duì)照品儲(chǔ)備液。

1.2.6.2 蘆丁最大波長(zhǎng)的測(cè)定

準(zhǔn)確量取2份3 mL蘆丁儲(chǔ)備液于25 mL容量瓶中，一份加60%乙醇溶液稀釋至刻度做參比；另一份加4 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)2% ZrOCl2·8H2O乙醇液[13]，并用60%（質(zhì)量百分?jǐn)?shù)）乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻放置1 h，于波長(zhǎng)范圍250～700 nm內(nèi)掃描測(cè)定。結(jié)果顯示，顯色前后對(duì)照品在440 nm處有最大差示吸光度。另取雪菊色素供試品有機(jī)相溶液0.3 mL 2份，同上述步驟，掃描樣品絡(luò)合前后的差示吸收光譜。結(jié)果提示，雪菊色素樣品溶液顯色后在413 nm處有最大差示吸光度，由此發(fā)現(xiàn)，對(duì)照品和供試品溶液顯色后的差示吸收光譜不同，故分別測(cè)定對(duì)照品和供試品在413和440 nm處的吸收差值。

1.2.6.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

準(zhǔn)確移取蘆丁儲(chǔ)備液0.4，0.6，0.8，1.0，1.2和1.4 mL各2份置于10 mL容量瓶中，同1.2.6.2法顯色，放置1 h，分別于413和440 nm處測(cè)定各組溶液顯色后差示吸光度，同一濃度下不同波長(zhǎng)處的吸光度相減，并以此為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（mg/mL），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6.4 雪菊色素得率的計(jì)算

按方法1.2.3制備雪菊色素，取0.3 mL有機(jī)相溶液2份于25 mL容量瓶中，按1.2.6.2的方法顯色，靜置1 h，在413和440 nm處分別測(cè)定相應(yīng)的差示分光光度值。按照回歸方程，通過(guò)吸收度差值計(jì)算被測(cè)液中色素含量。

式中：C為線性方程計(jì)算出的質(zhì)量濃度，mg/mL；V0為分離后的醇相或水相體積，mL；V為測(cè)定所吸取稀釋液體積，mL；m為稱取的樣品質(zhì)量，mg。

2 結(jié)果與討論

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

按1.2.6.3的方法求得回歸方程為ΔA=7.253 8C+ 0.009 18（R2=0.993 71），表示蘆丁質(zhì)量濃度在0.008 24～0.028 84 mg/mL之間，和相應(yīng)的吸收度差值線性關(guān)系良好。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 (NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

如圖2，在25%～28%范圍內(nèi)隨(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，雪菊色素得率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，可能是由于體系中(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，鹽的助溶作用也增加，因此雪菊色素不斷富集于水相。(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)28%時(shí)，與水相體積相比，發(fā)現(xiàn)醇相體積相對(duì)減少，可能是由于此時(shí)分相能力較弱，色素大量溶解于水相或提取不充分，這與28%處色素得率低的結(jié)果一致。

2.2.2 正丙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3，隨NPA質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，雪菊色素得率出現(xiàn)先下降后增加又逐漸下降現(xiàn)象，可能是由于NPA本身具有良好的分相能力，很大程度上影響雪菊色素的分離，隨著NPA含量增加，使得雪菊中更多的脂溶性物質(zhì)等溶出，溶液中色素含量相對(duì)減少。

圖2 (NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)雪菊色素得率的影響

圖3 正丙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)雪菊色素得率的影響

2.2.3 雪菊粉末用量的影響

從圖4可以看出，在雪菊粉末用量小于0.08 g，雪菊色素得率總體上呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，這說(shuō)明有利于雪菊色素的提取分離。雪菊粉末用量大于0.08 g，提取率出現(xiàn)減少趨勢(shì)，可能是因?yàn)殡S著雪菊粉末加入增多，雪菊中大量的糖類、果膠等物質(zhì)溶出，對(duì)雪菊色素的分離造成干擾，從而減弱雙水相對(duì)雪菊色素的分離。

圖4 雪菊粉末用量對(duì)色素得率的影響

2.2.4 超聲溫度的影響

由圖5可以看出，在前30 min，雪菊色素得率隨溫度升高而升高，30 min以后有所下降，可能是因?yàn)殡S著溫度升高，糖類等多數(shù)成分均不同程度的溶出并分配到雙水相體系中，影響色素分離。但40 min以后雪菊色素得率有不同程度上升，可能隨溫度升高，雪菊細(xì)胞壁大量破裂，基質(zhì)中色素大量擴(kuò)散到溶液中；此外，隨溫度升高，分子熱運(yùn)動(dòng)逐漸加劇，色素物質(zhì)在濃度差的作用下擴(kuò)散到溶液中便越來(lái)越容易，因此得率相對(duì)增加。

圖5 溫度對(duì)雪菊色素得率的影響

2.2.5 超聲時(shí)間的影響

從圖6可知，40 min之前，雪菊色素得率隨著超聲時(shí)間增加逐漸增加，40～80 min之間，雪菊色素得率變化不大，可能在此時(shí)間段內(nèi)，雪菊色素提取分離達(dá)到飽和。80～90 min時(shí)，得率有不同程度增加，可能因?yàn)闀r(shí)間越久，超聲越完全，分子運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的熱能逐漸升高，使得更多物質(zhì)溶出，尤其結(jié)合型的色素類物質(zhì)，故色素得率上升。

2.2.6 pH的影響

如圖7所示，pH對(duì)雪菊色素得率作用較大，在強(qiáng)酸條件下，雪菊色素得率隨pH增加而增加，可能是因?yàn)樗嵝詶l件利于結(jié)合型黃酮苷類物質(zhì)的水解，使得溶液中游離的黃酮類物質(zhì)增加；在堿性條件下，雪菊色素得率顯著降低，可能是因?yàn)?，色素中大量黃酮苷類成分、蒽醌苷類等含有大量酚羥基的結(jié)構(gòu)，因酚羥基的存在，一方面增強(qiáng)其酸性，使得水相中溶解度增大；另一方面，蒽醌苷類成分因其酚羥基和羰基的存在可在堿性條件下形成共軛體系，改變其化學(xué)結(jié)構(gòu)，從而使溶液顯紅色或紫紅色，這在試驗(yàn)提取結(jié)果中得到證實(shí)。因此強(qiáng)堿性條件下提取到的雪菊色素在水相含量增大，在有機(jī)相卻減少。

圖6 時(shí)間對(duì)雪菊色素得率的影響

圖7 pH對(duì)雪菊色素得率的影響

2.3 雪菊色素提取工藝正交優(yōu)化試驗(yàn)

按照上述結(jié)果，選取(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A）、NPA質(zhì)量分?jǐn)?shù)（B）、雪菊粉末質(zhì)量（C）、溫度（D）、時(shí)間（E）、pH（F）進(jìn)行六因素三水平正交試驗(yàn)，L18(36)試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

接表2

由極差R可以得出，影響雪菊色素得率的因素主次關(guān)系是F＞D＞C＞A＞B＞E。雪菊色素最佳提取條件為A3B3C2D3E1F1；開(kāi)展重復(fù)試驗(yàn)3次，結(jié)果如表3。結(jié)果顯示RSD為4.413%＜5%，平均得率為240.146 9 mg/g。這表明超聲輔助雙水相正交優(yōu)化粗提雪菊色素，以總黃酮為測(cè)量指標(biāo)，該工藝可行，重現(xiàn)性較好。

表3 重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 精密度試驗(yàn)

準(zhǔn)確移取3 mL 2份蘆丁儲(chǔ)備液于25 mL容量瓶中，根據(jù)1.2.6.2所述顯色，1 h后，于413和440 nm處測(cè)定絡(luò)合后的吸光度，結(jié)果如表4，顯示儀器精密度較好。

表4 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按最佳方案，開(kāi)展穩(wěn)定性試驗(yàn)，按1.2.6.2法顯色。室溫下放置一定時(shí)間，測(cè)定吸光度，RSD是3.04%，說(shuō)明供試品中雪菊色素在2 h內(nèi)穩(wěn)定，結(jié)果如表5。

表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 重現(xiàn)性試驗(yàn)

按照2.3下重復(fù)試驗(yàn)操作，測(cè)定其吸光度，計(jì)算RSD，結(jié)果見(jiàn)表4。RSD為4.413%，表明該方案可行，重現(xiàn)性較好。

3 結(jié)論與討論

研究正交優(yōu)化超聲輔助NPA/(NH4)2SO4ATPS粗提雪菊色素的工藝條件。確定以總黃酮為指標(biāo)時(shí)最佳工藝為：20 g ATPS中(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)29%，正丙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)23%，雪菊粉末用量0.08 g，溫度60℃，時(shí)間60 min，pH 3。驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果表明，差示分光光度法用于雪菊色素中總黃酮的檢測(cè)可行，雪菊色素得率為240.146 9 mg/g，總體來(lái)說(shuō)高于文獻(xiàn)中雪菊總黃酮提取率[5,15,21]，但比邱佳俊[2]所用方法提取率58.95%顯著低，說(shuō)明試驗(yàn)還需要改進(jìn)。此外，超聲輔助雙水相法粗提雪菊色素可以相對(duì)提高雪菊色素分離效率，且試驗(yàn)所用溶劑較少，提取時(shí)間較短，安全綠色環(huán)保，所需工藝設(shè)備要求低，操作簡(jiǎn)單，成本較低，為雪菊色素的工業(yè)生產(chǎn)提供一定理論基礎(chǔ)。