玉米鹽堿響應(yīng)基因ZmERF1和ZmERF2的分子特性分析

程殿君，郭耀祖，吳庚錦，邊境，徐晶宇，李佐同，賀琳

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，大慶 163319）

鹽漬土壤是陸地上分布較廣泛的一種土壤類(lèi)型，全世界鹽漬土面積約109 hm2，亞洲約為3.99×108hm2，我國(guó)鹽漬土面積約為3.5×107hm2。受氣候變化，人口增多及使用不當(dāng)?shù)戎T多不利因素的影響，許多耕地正在面臨發(fā)生次生鹽堿化的危險(xiǎn)。黑龍江省鹽堿地主要分布在松嫩平原西部的低洼地區(qū)，約占松嫩平原總土地面積的14%，是世界上三大蘇達(dá)鹽堿地集中分布區(qū)之一，其中黑龍江省大慶及齊齊哈爾地區(qū)鹽堿土地近66.7×105hm2，主要致害成分為NaCl、Na2SO4、Na2CO3和NaHCO3。已知低濃度的鹽堿脅迫處理對(duì)種子萌發(fā)的影響很小或不影響，但濃度過(guò)高會(huì)對(duì)作物種子的萌發(fā)起到抑制作用，鹽堿脅迫使作物種子細(xì)胞膜透性增強(qiáng)，隨鹽堿脅迫的增加，作物遭受脅迫的程度更明顯且影響植物的后期生長(zhǎng)[1]。由于灌溉不當(dāng)和大量施用化肥等原因，次生鹽堿化土壤面積還在繼續(xù)擴(kuò)大，從而導(dǎo)致可耕地面積逐年下降，耕地土壤的不斷鹽漬化嚴(yán)重威脅著糧食生產(chǎn)安全。近年來(lái)，玉米已經(jīng)成為黑龍江省種植面積最大的糧食作物，玉米的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)關(guān)系到我省的糧食安全和經(jīng)濟(jì)建設(shè)。玉米是鹽中度敏感的作物，耐鹽性差，在中度鹽漬土（含鹽量0.3%～0.5%）種植玉米一般減產(chǎn)20%，嚴(yán)重者可達(dá)46.7%。因此，玉米在黑龍江省的生產(chǎn)頻繁地受到鹽堿逆境的威脅，研究玉米應(yīng)答鹽堿逆境是非常有必要的。

在植物抗脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中，轉(zhuǎn)錄因子在功能基因的表達(dá)調(diào)控中起關(guān)鍵作用。近年來(lái)，相繼分離出大量不同類(lèi)型的植物轉(zhuǎn)錄因子，其中參與抗逆反應(yīng)的有bZIP類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子、MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子、AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子、WRKY類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子以及NAC類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子等。AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子是其中一個(gè)重要家族，每個(gè)成員至少都含有一個(gè)高度保守的58或59個(gè)氨基酸組成的DNA結(jié)合域[2]。根據(jù)DNA結(jié)合區(qū)的數(shù)目可將 AP2/EREBP 分為 AP2、DREB、ERF、RAV和其他類(lèi)別5個(gè)亞家族[3]。

ERF是AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子大家族的一個(gè)主要亞家族，其成員眾多，擬南芥中有122個(gè)，水稻中有139個(gè)，而玉米中有186個(gè)（見(jiàn)TFDB數(shù)據(jù)庫(kù)）。已有的報(bào)道顯示ERF亞家族成員在調(diào)節(jié)植物生物和非生物逆境反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[4-5]。擬南芥ERF1基因的組成型表達(dá)，能使轉(zhuǎn)基因擬南芥有效抵御Botrytis cinerea 和 Plectosphaerella cucum erina 等[6]壞死營(yíng)養(yǎng)型真菌的侵染。AtERF14的過(guò)表達(dá)在乙烯誘導(dǎo)中能提高 ERF1、PDF1、Chi等[7]基因的表達(dá)，進(jìn)而提高擬南芥對(duì)鐮刀菌的抗病性。煙草和番茄中TERF2/LeERF2基因過(guò)表達(dá)可以提高植株抗冷性[8]；劉文奇等[9]經(jīng)過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)入OPBP1基因的煙草分析發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)OPBP1的表達(dá)能提高煙草的抗鹽能力；ERF類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子TSRF1的超表達(dá)可以提高水稻抗旱性[10]。小麥TaERF1基因在干旱、鹽、低溫及病菌侵害后迅速表達(dá)，TaERF1基因在煙草中過(guò)表達(dá)后既可以提高植株抗旱能力，又能提高植株耐鹽能力[11]。Zhang等[12]研究表明轉(zhuǎn)基因煙草中過(guò)量表達(dá)GmERF3可以提高植物對(duì)高鹽和干旱的抗性，干旱條件下轉(zhuǎn)基因植株中游離脯氨酸和可溶性碳水化合物的含量顯著高于非轉(zhuǎn)基因株系。麻瘋樹(shù)中編碼ERF類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子JcERF基因在擬南芥中過(guò)表達(dá)，可以提高植物對(duì)高鹽和低溫的適應(yīng)性[13]。擬南芥ERF74的過(guò)表達(dá)株系顯示了提高的旱、熱、強(qiáng)光和鋁耐受性[14]。擬南芥AtERF019的過(guò)表達(dá)可以提高植物的抗旱性[15]。

深入的研究顯示ERF蛋白主要通過(guò)識(shí)別DRE/CRT和GCC-box元件調(diào)控下游基因表達(dá)進(jìn)而參與植物抗逆反應(yīng)。DRE順式元件（drought reponse element）是指核心序列為T(mén)ACCGACAT的一段啟動(dòng)子序列，存在于許多低溫應(yīng)答或干旱誘導(dǎo)的基因中[16]。利用電泳遷移率變動(dòng)試驗(yàn)（EMSA）、順式作用元件突變分析以及體內(nèi)瞬間表達(dá)分析，證明擬南芥的CBF1、DREB1/2和玉米的 DBF1/2能與 DRE/CRT特異性結(jié)合[16-17]。GCC-box保守序列為AGCCGCC，主要存在于許多PR（pathogenesis-related）基因的啟動(dòng)子區(qū)域中，起著乙烯應(yīng)答元件的作用[18]。植物的許多抗病相關(guān)基因啟動(dòng)子都含有GCC-box，研究表明煙草ERF1/2/3、番茄 Pti4/5/6、擬南芥 AtERF1/2/3/4/5和水稻 OsEBP-89等 ERF轉(zhuǎn)錄因子能與 GCC-box結(jié)合[18-19]。不過(guò)，還有一些 ERF轉(zhuǎn)錄因子比較特殊，既能與DRE/CRT特異性結(jié)合，又能與GCC-box特異性結(jié)合。如煙草中乙烯響應(yīng)因子TERF1能同時(shí)結(jié)合乙烯響應(yīng)元件GCC-box和脫水響應(yīng)元件DRE，從而使乙烯途徑和滲透刺激途徑建立起聯(lián)系[20]。Jeong等[21]從煙草中分離出了Tsi1基因（Tobaccostress-induced gene 1），該基因既能結(jié)合GCC-box，也能結(jié)合 DRE/CRT元件，與GCC盒結(jié)合的強(qiáng)度要比與DRE/CRT元件結(jié)合的強(qiáng)度大。另外ERF轉(zhuǎn)錄因子還可以與as-1 元件[22]、CT-rich element元件[23]和 CE1 順式作用元件結(jié)合[24]。

雖然ERF轉(zhuǎn)錄因子在植物抵御不良環(huán)境過(guò)程中擔(dān)當(dāng)重要角色，然而目前的研究只明確了少數(shù)ERF轉(zhuǎn)錄因子在抗生物和非生物逆境反應(yīng)中的功能，關(guān)于玉米ERF轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)鹽堿脅迫反應(yīng)的報(bào)道尚未見(jiàn)到。實(shí)驗(yàn)室利用實(shí)時(shí)定量PCR鑒定了兩條在根部高度響應(yīng)鹽堿脅迫的基因ZmERF1（GRMZM2G-544539）和 ZmERF2（GRMZM2G425798）。利用生物信息學(xué)方法對(duì)兩條ERF的進(jìn)化關(guān)系、蛋白保守結(jié)構(gòu)域、啟動(dòng)子所含元件等進(jìn)行綜合分析，期望研究的結(jié)果能夠?yàn)檫M(jìn)一步研究玉米ERF基因的抗逆功能和調(diào)控機(jī)制提供線索。

1 材料與方法

1.1 ZmERF1和ZmERF2在鹽堿脅迫下的表達(dá)模式分析

利用100 mM NaHCO3處理三葉一心時(shí)期玉米幼苗，于處理不同時(shí)間點(diǎn)（0、12、24、72 h）對(duì)根系進(jìn)行取樣，液氮速凍，-80℃保存用于提取RNA。利用TRIzol試劑（Invitrogen）提取總的RNA。使用Rever－Tra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover（TOYOBO）反轉(zhuǎn)錄。

使用Bio-Rad Chromo4 real-time PCR系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。反應(yīng)混合液含有2×SYBR Green Realtime PCR Master Mix（Toyobo）12.5 μL，上下游引物 0.5 μM，cDNA 模板 2 μL（相當(dāng)于 100 ng的RNA），總體積為 25 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃，30 s；45循環(huán)：94 ℃，12 s；58 ℃，30 s；72 ℃，30 s。最后 80 ℃，1 s。玉米 Actin1（GRMZM2G126010）作為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)。相對(duì)表達(dá)水平利用2-△△CT方法計(jì)算[25]。ERF在0 h根中的表達(dá)水平設(shè)為1，其他的處理相應(yīng)進(jìn)行計(jì)算。每一個(gè)樣品進(jìn)行三次獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)，每次進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。所有的引物顯示在表1中。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物序列Table1 The primer sequences in real time RT-PCR

1.2 ZmERF1和ZmERF2系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)、保守序列預(yù)測(cè)及基因結(jié)構(gòu)分析

利 用 phytozome 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https：//phytozome.jgi.doe.gov）下載ZmERF1和ZmERF2的蛋白序列，篩選與二者同源的來(lái)自不同物種的75條ERF蛋白，如表2所示，包括擬南芥52條ERF，水稻8條，玉米4條ERF，番茄6條，大豆1條，小麥1條，大麥3條。利用MEGA6.0軟件對(duì)這些ERF蛋白進(jìn)行序列比對(duì)[26]，并用鄰位（Neighbor-Joining）算法對(duì)77條ERF構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，通過(guò)Bootstrap測(cè)試，重復(fù)設(shè)置1 000來(lái)保證進(jìn)化樹(shù)的可靠性。保守序列預(yù)測(cè)采用在線軟件MEME（http：//meme-suite.org/）進(jìn)行預(yù)測(cè)，設(shè)置參數(shù)如下：預(yù)測(cè)數(shù)目：20；氨基酸數(shù)目：6～50；位點(diǎn)：2～600。

表2 擬南芥、玉米、水稻、番茄、大豆、小麥、大麥基因信息Table 2 Genetic information of Arabidopsis，maize，rice，tomato，soybean，wheat and barley

續(xù)表2 擬南芥、玉米、水稻、番茄、大豆、小麥、大麥基因信息Continued table 2 Genetic information of Arabidopsis，maize，rice，tomato，soybean，wheat and barley

續(xù)表2 擬南芥、玉米、水稻、番茄、大豆、小麥、大麥基因信息Continued table 2 Genetic information of Arabidopsis，maize，rice，tomato，soybean，wheat and barley

1.3 ZmERF1和ZmERF2的啟動(dòng)子分析

在 phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//phytozome.jgi.doe.gov）下載ZmERF1和ZmERF2轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1 500 bp的啟動(dòng)子序列，利用在線數(shù)據(jù)庫(kù)plantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預(yù)測(cè)ZmERF1和ZmERF2啟動(dòng)子包含的逆境相關(guān)順式作用元件，運(yùn)用IBS軟件繪制啟動(dòng)子分析圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmERF1和ZmERF2基因的表達(dá)模式分析

圖1 NaHCO3脅迫下 ZmERF1和ZmERF2基因在根中的表達(dá)模式分析Fig.1 Gene expression pattern analysis of ZmERF1 and ZmERF2 in root under NaHCO3stress

利用實(shí)時(shí)定量PCR，我們研究了ZmERF1和ZmERF2這兩個(gè)基因在鹽堿處理?xiàng)l件下在玉米根中的表達(dá)模式。如圖1所示，在根中，鹽堿脅迫后ZmERF1和ZmERF2基因總體表達(dá)趨勢(shì)上升，當(dāng)鹽堿脅迫處理12 h，ZmERF1和ZmERF2的表達(dá)量達(dá)到最高峰，隨后二者表達(dá)量逐漸減少，但仍然高于未處理對(duì)照（0 h）。以上結(jié)果表明ZmERF1和ZmERF2在玉米根中均能被鹽堿脅迫誘導(dǎo)，且具有極為相似的表達(dá)模式。

2.2 ZmERF1和ZmERF2進(jìn)化關(guān)系和保守結(jié)構(gòu)域分析

圖2 ZmERF1和ZmERF2與其他已知NAC蛋白的進(jìn)化關(guān)系分析Fig.2 Phylogenetic relationship analysis of ZmERF1 and ZmERF2 with other known NAC proteins

為了鑒定ZmERF1和ZmERF2的進(jìn)化關(guān)系，選取75條（擬南芥52條，水稻8條，玉米4條，番茄6條，大豆1條，小麥1條，大麥3條）已經(jīng)明確進(jìn)化關(guān)系的ERF蛋白作為標(biāo)尺，利用MEGA6.0軟件對(duì)77條ERF蛋白進(jìn)行序列比對(duì)。結(jié)果顯示ZmERF1和ZmERF2同屬于ERF-B4亞家族（圖2）。

從進(jìn)化關(guān)系上看，ZmERF1的直系同源基因?yàn)镺s01g64790，ZmERF2的直系同源基因?yàn)镺s04g32620（圖2），可見(jiàn)相比于擬南芥ERF，玉米ERF基因與水稻的ERF同源性更強(qiáng)。

為了鑒定ZmERF1和ZmERF2蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，利用MEME在線預(yù)測(cè)了11條ERF-B4亞家族成員蛋白序列中的保守元件（圖3）。關(guān)于氨基酸序列保守性的詳細(xì)信息以及20個(gè)保守元件的序列組成見(jiàn)表3。

圖3 ZmERF1和ZmERF2保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.3 Conserved domauns analysis of ZmERF1 and ZmERF2

表3 ERF蛋白的特異性保守氨基酸基序Table 3 Specific conserved amino acids motifs in ERF proteins

ZmERF1 僅含有 Motif 1，Motif 2，Motif 3，且這三個(gè)元件在其他ERF中均有分布，其中Motif 1和Motif 2一起構(gòu)成了ERF家族基因高度保守的DNA結(jié)合域，用于與靶基因啟動(dòng)子中的GCC-box等元件結(jié)合。Motif 1，Motif 2，Motif 3在擬南芥、水稻和玉米的ERF中均有分布，表明這三個(gè)結(jié)構(gòu)域在物種間具有高度保守性。

ZmERF2結(jié)構(gòu)域較ZmERF1復(fù)雜，除含有Motif 1，Motif 2，Motif 3等保守結(jié)構(gòu)域外還含有Motif 5，Motif 7～13和Motif 18等9個(gè)可變結(jié)構(gòu)域。這些可變結(jié)構(gòu)域中的一些與擬南芥間存在保守性，如Motif 5，Motif 9，Motif 10，Motif 11，Motif 12，Motif 18。Motif 9 和Motif 18在ERF蛋白上的存在位置較為靈活，可以位于ERF保守DNA結(jié)合域前，也可以位于其后。另一些可變域則與水稻存在保守性如Motif 5，Motif 7，Motif 8，Motif 10，Motif 13，這 5 個(gè)保守元件在水稻和玉米的ERF蛋白中存在位置相對(duì)一致，均位于ERF保守DNA結(jié)合域之后，表明C端為ERF蛋白的可變區(qū)域，可能與ERF的轉(zhuǎn)錄激活或抑制功能相關(guān)。

2.3 ZmERF1和ZmERF2啟動(dòng)子分析

為了進(jìn)一步證實(shí)ERF在逆境下的角色，利用PlantCARE數(shù)據(jù)庫(kù)分析ZmERF1和ZmERF2的啟動(dòng)子區(qū)域（轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1 500 bp），鑒定假定的順式作用元件（圖4）。ZmERF1啟動(dòng)子中含有五種類(lèi)型的元件，包括1個(gè)GCC-box（ERF binding element，ERF結(jié)合元件），1個(gè) MBS（Drought responsive element，旱響應(yīng)元件），2 個(gè) W-box（WRKY binding element，WRKY 結(jié)合元件），2 個(gè) ARE （Anaerobic responsive element，厭氧響應(yīng)元件）和 6 個(gè) ABRE（Abscisic acid responsive element，脫落酸響應(yīng)元件）。ABRE元件在ZmERF1啟動(dòng)子中的高頻出現(xiàn)表明該元件在玉米應(yīng)答逆境過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。ZmERF2啟動(dòng)子中含有三種類(lèi)型的元件，包括3個(gè)ARE（Anaerobic responsive element，厭氧響應(yīng)元件），1 個(gè) MBS（Drought responsive element，旱響應(yīng)元件）和1 個(gè) LTR（Low temperature responsive element，低溫響應(yīng)元件）。

圖4 ZmERF1和ZmERF2基因啟動(dòng)子序列分析Fig.4 Promoters analysis of ZmERF1 and ZmERF2

3 結(jié)論與討論

植物抵御逆境是一個(gè)極其復(fù)雜的調(diào)控過(guò)程，包括ERF在內(nèi)的許多轉(zhuǎn)錄因子同時(shí)參與其中。然而，不同轉(zhuǎn)錄因子之間存在著怎樣的分工合作關(guān)系尚不清楚。已有的報(bào)道顯示一些ERF轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控下游靶標(biāo)基因表達(dá)需要其他轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)調(diào)互作。如煙草ORC1正向調(diào)控?zé)焿A合成途徑基因的表達(dá)，過(guò)量表達(dá)ORC1可以提高煙堿合成，但是ORC1調(diào)控?zé)焿A合成途徑基因表達(dá)需要在啟動(dòng)子中同時(shí)含有GCC盒和G盒元件（bHLH轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別的順式作用元件），bHLH轉(zhuǎn)錄因子可以增強(qiáng)ORC1的轉(zhuǎn)錄活性，而阻斷bHLH轉(zhuǎn)錄因子活性后則降低ORC1的轉(zhuǎn)錄活性[27]。因此，ORC1需要ERF與bHLH的協(xié)同作用以達(dá)到對(duì)靶標(biāo)基因表達(dá)調(diào)控的最大轉(zhuǎn)錄活性。香蕉轉(zhuǎn)錄抑制因子MaDof23通過(guò)與MaERF9轉(zhuǎn)錄激活因子互作協(xié)同調(diào)控果實(shí)成熟基因的表達(dá)[28]。水稻MYC蛋白OsBP-5可以和ERF蛋白OsEBP-89互作進(jìn)而調(diào)控Wx基因的表達(dá)[29]?？梢?jiàn)，ERFs調(diào)控下游基因表達(dá)，不是完全獨(dú)立行使功能的，往往是需要與其他轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用，控制調(diào)控的效率。然而，目前關(guān)于能與ERF互作的轉(zhuǎn)錄因子的報(bào)道很有限，鹽堿脅迫條件下玉米ERF蛋白與其他轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同調(diào)控下游靶基因啟動(dòng)子中元件的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，因此，有必要發(fā)現(xiàn)更多玉米ERF類(lèi)蛋白的互作轉(zhuǎn)錄因子，并明確互作在下游靶基因表達(dá)調(diào)控中的重要作用，從而加深對(duì)轉(zhuǎn)錄因子參與的植物鹽堿脅迫分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)。研究顯示ZmERF1和ZmERF2在根中鹽堿脅迫處理?xiàng)l件下表達(dá)的總體趨勢(shì)是上調(diào)的且表達(dá)模式極為相似，說(shuō)明這兩個(gè)基因可以被鹽堿脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，二者很可能處于同一信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中。然而，逆境條件下二者是否存在互作關(guān)系，形成異源二聚體（同家族的不同成員之間的互作）從而調(diào)控靶基因的表達(dá)有待進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

進(jìn)化樹(shù)分析顯示ZmERF1和ZmERF2基因同屬于ERF-B4亞家族成員（圖2）。已有的報(bào)道表明ERF-B4亞家族成員在調(diào)控植物的抗逆反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。擬南芥ERF-B4亞家族中的7個(gè)基因有3個(gè)已被報(bào)道與非生物脅迫相關(guān)，分別是RAP2.6L（At5g13330）、RAP2.6（At1g43160）和 ABR1（At5g64750）。過(guò)表達(dá)RAP2.6L的擬南芥顯示出提高的鹽和旱耐受性[30]；過(guò)表達(dá)RAP2.6的擬南芥株系在種子萌發(fā)和幼苗發(fā)育早期階段顯示出對(duì)外源ABA和非生物脅迫的高度敏感性[31]；ABR1能夠響應(yīng)ABA和冷、高鹽和旱等逆境條件。鑒于同一亞家族成員通常具有相似的功能，因此有必要在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中鑒定ZmERF1和ZmERF2在參與調(diào)控植物逆境應(yīng)答過(guò)程中的潛在功能。

啟動(dòng)子分析發(fā)現(xiàn)ZmERF1啟動(dòng)子中含有GCC-box、MBS、W-box、ARE 和 ABRE 五種逆境響應(yīng)元件，ZmERF2啟動(dòng)子中含有ARE，MBS和LTR三種逆境響應(yīng)元件（圖4），表明ZmERF1和ZmERF2能夠響應(yīng)各種非生物逆境。此外，同一基因啟動(dòng)子中含有三種或三種以上的逆境響應(yīng)元件說(shuō)明ZmERF1和ZmERF2可能在多種逆境下同時(shí)發(fā)揮著重要作用。

植物體內(nèi)有兩種逆境信號(hào)途徑，一種是依賴(lài)于ABA的，一種是不依賴(lài)與ABA的信號(hào)途徑。相應(yīng)的，逆境誘導(dǎo)基因的啟動(dòng)子中就有兩種主要的順式作用元件ABRE和DRE/CRT。ABRE被認(rèn)為是調(diào)控依賴(lài)ABA途徑的[31-32]，而DRE/CRT元件是不依賴(lài)于ABA的[17]。值得注意的是ABRE元件在ZmERF1啟動(dòng)子中出現(xiàn)6次（圖4），這一出現(xiàn)頻率表明ZmERF1是ABA響應(yīng)基因，其參與調(diào)控的玉米抗逆反應(yīng)途徑很可能受激素ABA調(diào)節(jié)，屬于依賴(lài)于ABA途徑的調(diào)控。相反，ZmERF2啟動(dòng)子中不含ABRE元件，表明它所參與的抗逆反應(yīng)不依賴(lài)于ABA途徑。

轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控下游靶基因表達(dá)的同時(shí)，自身也可以作為靶基因，被其上游調(diào)控因子激活而獲得活性。已有的報(bào)道顯示GCC-box可以被ERF轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別[14]，MBS可以被MYB轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別[33]，W-box可以被WRKY轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別[34]，ABRE可以被bZIP轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別[35-36]，這些轉(zhuǎn)錄因子在植物的非生物脅迫抗性方面發(fā)揮著重要作用[37-40]。GCC-box，MBS，W-box和ABRE在ZmERF1啟動(dòng)子中的出現(xiàn)表明ZmERF1參與的玉米逆境應(yīng)答中，AREB，MYB，WRKY或ERF等轉(zhuǎn)錄因子可能作為其上游調(diào)控因子，結(jié)合ZmERF1啟動(dòng)子中相應(yīng)結(jié)合位點(diǎn)從而激活或抑制其表達(dá)。此外MBS在ZmERF2啟動(dòng)子中的出現(xiàn)也同樣暗示了MYB轉(zhuǎn)錄因子可能作為ZmERF2的上游調(diào)控因子調(diào)控其對(duì)逆境的應(yīng)答。因此，ZmERF1和ZmERF2啟動(dòng)子中的逆境響應(yīng)順式作用元件的鑒定有助于我們深入探索其上游調(diào)控機(jī)制。

4 結(jié)論

研究利用實(shí)時(shí)RT-PCR鑒定了兩條鹽堿響應(yīng)玉米ERF轉(zhuǎn)錄因子基因ZmERF1和ZmERF2，借助生物信息學(xué)方法對(duì)這兩條ERF基因的進(jìn)化關(guān)系、蛋白保守結(jié)構(gòu)域、啟動(dòng)子元件組成等進(jìn)行了系統(tǒng)分析。研究的結(jié)果將為進(jìn)一步利用轉(zhuǎn)基因手段培育玉米抗/耐品種提供理論依據(jù)。