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    甜瓜種子細(xì)菌性果斑病菌PCR檢測(cè)方法的研究

    2020-05-06 12:13:40李菊芬馬國(guó)斌
    關(guān)鍵詞:甜瓜條帶細(xì)菌性

    李菊芬,林 濤,馬國(guó)斌

    (上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院設(shè)施園藝研究所,上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 201106)

    細(xì)菌性果斑病(Bacteiral fruit blotch,簡(jiǎn)稱BFB)是一種嚴(yán)重危害葫蘆科植物的世界性病害,其病原為西瓜嗜酸菌(Acidovorascitrulli)[1],是一種活體營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌,屬于革蘭氏染色陰性菌。近些年,隨著我國(guó)瓜類作物種植規(guī)模的不斷擴(kuò)大,果斑病時(shí)有發(fā)生,曾給部分瓜類產(chǎn)區(qū)造成過(guò)較大損失。該病已被列為我國(guó)對(duì)內(nèi)、對(duì)外的植物檢疫性病害。瓜類細(xì)菌性果斑病為典型的種傳細(xì)菌性病害[2],建立一套快速、簡(jiǎn)便、靈敏的檢測(cè)方法是當(dāng)務(wù)之急。目前,隨著PCR技術(shù)的廣泛應(yīng)用,國(guó)內(nèi)外已有許多應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)西瓜、甜瓜種子細(xì)菌性果斑病菌的相關(guān)報(bào)道[3-5]。在傳統(tǒng)PCR的基礎(chǔ)上,免疫富集PCR[6-7]、免疫磁性分離PCR[8-9]、實(shí)時(shí)熒光定量PCR[10-13]等方法的應(yīng)用大大提高了檢測(cè)的靈敏度,但這些方法操作程序復(fù)雜、前期準(zhǔn)備工作量大、所需儀器、試劑較為昂貴,不適合一般實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行快速檢測(cè)。本研究在傳統(tǒng)PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上,對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行篩選優(yōu)化,以期形成一套簡(jiǎn)單實(shí)用,并能在甜瓜種子實(shí)際生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的果斑病菌快速檢測(cè)方法。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    供試甜瓜(CucumismeloL.)種子:新疆繁育的自然攜帶瓜類細(xì)菌性果斑病菌的甜瓜種子。供試菌株:由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹(shù)研究所提供的細(xì)菌性果斑病標(biāo)準(zhǔn)菌株(Acidovorasavenaesubsp.citrulli,簡(jiǎn)稱Ac)。

    1.2 試劑與儀器

    普通PCR所需試劑均購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司。PCR儀為BIO-Rad T100TMThermal Cycler。實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用日本TaKaRa公司的SYBR green熒光染料,儀器為Bio-Rad CFX96TMReal-Time PCR System。使用核算蛋白檢測(cè)儀(Bio-Rad)測(cè)定OD600 nm值。

    1.3 引物篩選

    選用3對(duì)特異引物BX-L1BX-S-R2[4]、HB2F2HB2R2[5]和SEQID4mSEQID5[3]分別進(jìn)行PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè),引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列及PCR反應(yīng)條件(略有改動(dòng))詳見(jiàn)表1。

    PCR反應(yīng)體系(25 μL):10×buffer 2.5 μL,MgCl22 mmolL,dNTPs 0.2 mmolL,Taq DNA 聚合酶 1 U,正反向引物各0.2 μmolL,模板為1 μL種子提取液,無(wú)菌三蒸水補(bǔ)齊。以標(biāo)準(zhǔn)Ac菌株為模板作為陽(yáng)性對(duì)照,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后觀察并拍照。

    表1 檢測(cè)細(xì)菌性果斑病菌的3對(duì)特異引物及PCR擴(kuò)增條件

    實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系按照TaKaRa SYBR?Premix Ex TaqTM說(shuō)明書進(jìn)行,擴(kuò)增程序采用Bio-Rad CFX實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀默認(rèn)程序,即95℃ 30s;95℃ 5s,60℃ 30s, 40個(gè)循環(huán);每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)收集熒光信號(hào)。

    Acidovorasavenaesubsp.Citrulli菌株接種在液體KB培養(yǎng)基[14]中,28℃、220rmin振蕩培養(yǎng)過(guò)夜,離心收集菌體,加入1mL無(wú)菌水至懸浮狀態(tài),根據(jù)測(cè)得的OD600 nm值,用無(wú)菌水分別配成1×107CFUmL、1×106CFUmL、1×105CFUmL、1×104CFUmL、1×103CFUmL、1×102CFUmL 6個(gè)濃度梯度的菌懸液。以不同濃度的菌懸液為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè),根據(jù)Ct值繪制每對(duì)特異引物的標(biāo)準(zhǔn)曲線。試驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.4 種子的不同處理方式

    分別取帶菌種子100粒,進(jìn)行以下3種處理。處理A:完整種子直接放入滅菌三角瓶中。處理B:種子去殼后,將種殼和種仁一起放入滅菌三角瓶中。處理C:將種子放入滅菌研缽中研磨至粉碎后,移入滅菌三角瓶中。分別向三角瓶中加入10mL滅菌雙蒸水,于28℃、220rmin搖培12h,取1 μL提取液作為PCR模板,以標(biāo)準(zhǔn)Ac菌株為模板作為陽(yáng)性對(duì)照,分別進(jìn)行PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。各處理重復(fù)3次。

    1.5 不同的提取液處理

    分別取帶菌種子100粒放入滅菌三角瓶中,進(jìn)行以下不同處理。處理a:加入10mL滅菌雙蒸水。處理b:加入10mL 磷酸緩沖液(PBS Buffer;137 mmolL NaCl,2.7 mmolL KCl,10 mmolL Na2HPO4∶2H2O,2mmolL KH2PO4)。處理c:加入10mL KB液體培養(yǎng)基。將三角瓶于28℃、220rmin搖培12h,取1 μL提取液作為PCR模板,以標(biāo)準(zhǔn)Ac菌株為模板作為陽(yáng)性對(duì)照,分別進(jìn)行PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。各處理重復(fù)3次。

    1.6 不同的提取時(shí)間處理

    取帶菌種子100粒放入滅菌三角瓶中,加入10mL滅菌雙蒸水,于28℃、220rmin分別振蕩培養(yǎng)3 h、6 h、12 h、24h,取1 μL提取液作為PCR模板,以標(biāo)準(zhǔn)Ac菌株為模板作為陽(yáng)性對(duì)照,分別進(jìn)行PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。各處理重復(fù)3次。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同引物對(duì)PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的影響

    普通PCR擴(kuò)增結(jié)果表明(圖1),3對(duì)特異引物均能擴(kuò)出各自的特異條帶,均可用于檢測(cè)甜瓜種子攜帶的果斑病菌。但經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)綜合比較發(fā)現(xiàn):引物HB2F2HB2R2的擴(kuò)增產(chǎn)物易形成二聚體;引物SEQID4mSEQID5擴(kuò)增的特異條帶亮度較弱;引物BX-L1BX-S-R2的擴(kuò)增產(chǎn)物不易形成二聚體,且條帶較亮,效果相對(duì)較佳,因此后續(xù)試驗(yàn)的普通PCR擴(kuò)增均采用此引物。

    以1×102—1×107CFUmL 6個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)菌株菌懸液為模板,分別用3對(duì)特異引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增,根據(jù)Ct值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,引物SEQID4mSEQID5在進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)菌液的實(shí)時(shí)熒光定量PCR時(shí),檢測(cè)到的Ct值與相應(yīng)菌液濃度的對(duì)數(shù)值呈較好的線性相關(guān)(R2=0.9917)(圖2),而且PCR產(chǎn)物的特異性好,熔解曲線顯示產(chǎn)物只有特異性的一個(gè)峰(圖3)。對(duì)引物HB2F2HB2R2和引物BX-L1BX-S-R2的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析,未獲得特異性單峰,且Ct值與菌液濃度的對(duì)數(shù)值沒(méi)有很好的線性相關(guān)。綜上結(jié)果,引物SEQID4mSEQID5適合用于Ac的菌落實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè),因此后續(xù)試驗(yàn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR均采用該引物。

    2.2 不同種子處理方式對(duì)PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的影響

    帶菌甜瓜種子經(jīng)過(guò)3種不同方式處理后,其PCR檢測(cè)結(jié)果也有所不同。由圖4可以看出,以處理C為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,沒(méi)有擴(kuò)增出特異條帶(279bp)。而處理A和處理B均能擴(kuò)增出目的條帶,且條帶亮度差異不明顯,處理A較B稍亮。但處理A無(wú)需研磨或去殼,操作簡(jiǎn)便。綜上比較可知,處理A,即以完整帶菌種子直接加水搖培后得到的提取液進(jìn)行PCR擴(kuò)增,效果相對(duì)較佳。

    實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示:3種不同處理方式中,以完整種子浸提液為模板檢測(cè)到的Ac濃度最高,“種殼+種仁”處理次之,而以磨碎種子浸提液為模板,則無(wú)檢測(cè)數(shù)據(jù)。這與普通PCR的檢測(cè)結(jié)果一致。

    2.3 不同提取液對(duì)PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的影響

    帶菌甜瓜種子用3種不同的浸提液提取后,其PCR檢測(cè)結(jié)果差異較大(圖5)。處理c PCR擴(kuò)增后無(wú)特異條帶(279bp)出現(xiàn)。處理a和處理b均可擴(kuò)增出目的條帶,但處理a的條帶較亮,檢測(cè)效果最佳。

    實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明:以無(wú)菌水為浸提液檢測(cè)到的Ac濃度最高,PBS為浸提液次之,以液體KB培養(yǎng)基為浸提液,則無(wú)檢測(cè)數(shù)據(jù)。這與普通PCR的檢測(cè)結(jié)果一致。

    2.4 不同提取時(shí)間對(duì)PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的影響

    如圖6所示,帶菌甜瓜種子加無(wú)菌水分別搖培3 h、6 h、12h后,PCR均能擴(kuò)增出明顯的特異條帶(279bp);但搖培24h時(shí),則無(wú)目的條帶出現(xiàn)。

    實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示:經(jīng)3h、6h和12h搖培處理后,均能檢測(cè)到較高的Ac含量,而搖培24h,則無(wú)檢測(cè)數(shù)據(jù)。這與普通PCR的檢測(cè)結(jié)果一致,表明搖培時(shí)間在3—12h為宜,至24h后,檢測(cè)結(jié)果受到極大影響。

    3 討論

    在傳統(tǒng)PCR檢測(cè)技術(shù)的基礎(chǔ)上,本研究對(duì)甜瓜種子細(xì)菌性果斑病菌的檢測(cè)方法進(jìn)行了篩選優(yōu)化。任毓忠等[15]研究表明,種皮的帶菌量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于種仁。為了獲得帶菌量較多的浸提液模板,本研究對(duì)帶菌種子進(jìn)行了不同處理。結(jié)果表明,處理A(完整帶菌種子加水搖培)和處理B(帶菌種子去殼后,種殼和種仁一起加水搖培)均能通過(guò)PCR擴(kuò)增出目的條帶,條帶亮度差異不明顯,其實(shí)時(shí)熒光定量PCR均能檢測(cè)到較高的Ac濃度。這說(shuō)明用完整種子搖培后浸提液中的帶菌量和種殼+種仁搖培后的帶菌量接近,表明細(xì)菌性果斑病菌主要附著在種子表皮,這與任毓忠等[15]的研究結(jié)果一致。處理C(以磨碎種子浸提液為模板)的PCR擴(kuò)增效果較差,可能是由于種子研碎后,大量蛋白、油脂等雜質(zhì)混入浸提液,嚴(yán)重影響了PCR的擴(kuò)增效率。綜合比較,可直接用完整種子進(jìn)行搖培檢測(cè)。

    本研究表明,帶菌甜瓜種子經(jīng)搖培3—12h,其PCR檢測(cè)結(jié)果基本不受影響,均能擴(kuò)增出明顯的目的條帶;但搖培至24h,卻無(wú)目的條帶出現(xiàn)。這可能與搖培24h后,部分甜瓜種子開(kāi)始萌發(fā),造成大量雜質(zhì)混入浸提液影響PCR結(jié)果有關(guān),其原因有待于進(jìn)一步深入探討。

    不同引物的PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示,引物BX-L1BX-S-R2的擴(kuò)增效果最佳。而杜艷媚等[16]參照Bahar等[4]的方法,以西瓜果斑病菌菌液為模板,BX-L1BX-S-R2引物卻不能擴(kuò)增出目的片段,這可能是由于國(guó)內(nèi)Taq DNA 聚合酶(Sigma-Aldrich)等PCR試劑與國(guó)外不同,因此反應(yīng)條件也應(yīng)做相應(yīng)的改變,以獲得最佳結(jié)果。本試驗(yàn)對(duì)BX-L1BX-S-R2引物擴(kuò)增條件中的退火溫度進(jìn)行了優(yōu)化調(diào)整,當(dāng)退火溫度降至60℃時(shí),即可擴(kuò)增出明顯的目的條帶。而對(duì)于實(shí)時(shí)熒光定量PCR,引物SEQID4mSEQID5則是最佳選擇。因此對(duì)Ac進(jìn)行檢測(cè)時(shí),應(yīng)根據(jù)實(shí)際需求選用相應(yīng)的引物。

    綜上,本研究?jī)?yōu)化得到的PCR檢測(cè)方法簡(jiǎn)單快捷,不需要提取細(xì)菌的DNA,只需將完整種子用無(wú)菌水搖培3h后,以浸提液為模板,即可擴(kuò)增出特異性的DNA片段。定性檢測(cè)時(shí),應(yīng)首選引物BX-L1BX-S-R2進(jìn)行普通PCR即可;若需要精準(zhǔn)的定量檢測(cè),則可選用引物SEQID4mSEQID5進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。

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