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    利用SSR和ISSR分子標記分析崇明白扁豆種質(zhì)資源的遺傳多樣性

    2020-05-06 12:08:26顧立君潘俊松
    上海農(nóng)業(yè)學(xué)報 2020年2期
    關(guān)鍵詞:白扁豆利馬崇明

    沈 千,陳 岳,顧立君,潘俊松*

    (1上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院,上海 200240,2 崇明區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心,上海202150,3上海市崇明區(qū)蔬菜科學(xué)技術(shù)推廣站,上海202150)

    崇明白扁豆,學(xué)名利馬豆(PhaseoluslunatusL.),起源于墨西哥南部和中美洲,引入我國時間不詳[1]。崇明白扁豆是崇明地區(qū)重要的特色蔬菜品種之一,細嫩酥糯、清香味美、營養(yǎng)豐富,于2008年獲得國家地理標志注冊商標,具有十分良好的發(fā)展前景。但現(xiàn)階段對崇明白扁豆研究較少,且主要集中在栽培和生理生化方面[2-4],缺少有關(guān)崇明白扁豆的分類及親緣關(guān)系的鑒定研究。此外,傳統(tǒng)的通過株型、花色等形態(tài)學(xué)標記進行分類的方法,雖然能夠在田間直接觀察和統(tǒng)計,但形態(tài)學(xué)標記受到環(huán)境的限制,部分性狀不能表達,以致不能發(fā)現(xiàn)確實存在的某些性狀,使觀測中的一些重要性狀被隱藏或忽略。另外,田間性狀調(diào)查所需的周期長,數(shù)據(jù)不穩(wěn)定。而利用分子標記技術(shù)可以彌補形態(tài)學(xué)研究的短板,進一步體現(xiàn)種質(zhì)的遺傳多樣性狀況。

    本試驗所用材料為崇明白扁豆、云南大白蕓豆和白扁豆。很多消費者誤以為崇明白扁豆即為白扁豆,其實崇明白扁豆是俗稱。崇明白扁豆,即利馬豆,屬于豆科(Leguminosae)菜豆屬(Phaseolus)。云南大白蕓豆(PhaseoluslunatusL.)在一些地方也被稱為白扁豆,與崇明白扁豆是同屬(菜豆屬)同一個種,而白扁豆(LablabpurpureusL.)屬于豆科(Leguminosae)扁豆屬(Lablab)。本研究利用大豆SSR(Simple sequence repeat,簡單重復(fù)序列)和ISSR(Inter-simple sequence repeat,簡單重復(fù)序列中間區(qū)域)分子標記對64份種質(zhì)材料進行遺傳多樣性分析,希望能揭示崇明不同地區(qū)崇明白扁豆之間的親緣關(guān)系,并區(qū)分因俗稱而被混淆的豆類名稱,為今后崇明白扁豆的種質(zhì)資源分類、鑒定以及品種保護提供理論依據(jù)和實踐參考。

    1 材料與方法

    1.1 植物材料

    參試的59份崇明白扁豆樣本均由崇明區(qū)港西鎮(zhèn)北雙村暉遠蔬菜園藝場提供;采購1份江蘇海門的利馬豆、1份云南麗江的大白蕓豆和3份分別來自山東青島、廣西巴馬、河南洛陽的白扁豆作對照(表1);所有材料均為蔓生型。因為崇明白扁豆研究很少,相關(guān)SSR分子標記沒有開發(fā),所以采用同科的大豆SSR分子標記進行研究。

    注:1—59號材料來源于上海崇明不同鎮(zhèn)。數(shù)值均為平均值±標準差

    1.2 試劑

    試驗所用的2×HieffTMPCR Master Mix購于上海翊圣生物科技有限公司;過硫酸銨、NaOH、硝酸銀、98%去離子甲酰胺、二甲苯青、溴酚藍、丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺購于上海生工生物工程股份有限公司;無水乙醇、甲醛等購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司;瓊脂糖購于北京沃比森科技有限公司。所用DNA引物由上海華津生物科技有限公司合成。

    1.3 崇明白扁豆基因組DNA的提取

    采用CTAB法[5]提取崇明白扁豆三出復(fù)葉時期的嫩葉片基因組DNA,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA溶液的質(zhì)量,DNA純度和濃度利用NanoDrop 2000紫外可見光譜儀(Thermo)進行測定。DNA溶液貯藏于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

    1.4 SSR-PCR

    PCR反應(yīng)體系如下:5 μL 2×HieffTMPCR Master Mix,DNA模板1 μL(50 ngμL);上下游引物(10 μmolL)各0.5 μL;添加ddH2O至10 μL。PCR擴增反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸30 s,30個循環(huán);72℃延伸5 min。

    1.5 ISSR-PCR

    采用加拿大哥倫比亞大學(xué)(UBC)公布的100條ISSR引物,選取6個供試材料(樣品3、11、25、36、48、63),對引物進行多態(tài)性篩選。

    PCR反應(yīng)體系如下:5 μL 2×HieffTMPCR Master Mix,DNA模板1 μL(50 ngμL);引物(10μmolL) 0.5 μL;添加ddH2O至10 μL體系。PCR擴增反應(yīng)程序:預(yù)變性94℃ 3 min;變性94℃ 30 s,52℃退火30 s,72℃延伸1 min,35個循環(huán);72℃延伸5 min。

    1.6 數(shù)據(jù)分析

    PCR產(chǎn)物首先用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測有無產(chǎn)物,有產(chǎn)物的再用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測,硝酸銀銀染顯色。白熾燈下觀察電泳結(jié)果,進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和掃描照相。

    擴增產(chǎn)物有帶型記為“1”,無帶型記為“0”,缺失數(shù)據(jù)記為“-”。采用NTSYSpc V2.11軟件進行數(shù)據(jù)分析,以Jaccard計算遺傳相似系數(shù),利用非加權(quán)組平均法(UPGMA)對64份白扁豆種質(zhì)資源進行聚類分析,構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。多態(tài)性信息(PIC)值計算方法參照Botstein等[6]。

    表2 大豆SSR分子標記的引物信息及其多態(tài)性

    2 結(jié)果與分析

    2.1 崇明白扁豆材料間多態(tài)性SSR和ISSR引物篩選

    從48對大豆SSR引物中,篩選出11對帶型清晰、多態(tài)性較好的引物,多態(tài)性比率為22.9%;從100條ISSR引物中篩選出19條擴增穩(wěn)定、多態(tài)性好的引物,多態(tài)性比率為19.0%(表2和表3),用篩選到的多態(tài)性引物分別對64份白扁豆材料進行PCR擴增。11對SSR引物共擴增出84條多態(tài)性條帶,每個位點的等位基因數(shù)為3—12個,平均為7.6個(表2);19條ISSR引物共擴增出151條多態(tài)性條帶,每條引物擴增條帶為5—13條,平均為7.9條(表3)。多態(tài)信息量(PIC)可以評估引物多態(tài)性信息量水平。本試驗所篩選的11對SSR引物中,PIC值的范圍為0.71(Satt385)到0.94(Satt520);19條ISSR引物中,PIC值的范圍為0.82(UBC827)到0.94(UBC834),表明所篩選的引物具有較高的多態(tài)性,可以有效地用于白扁豆遺傳多樣性分析。圖1和圖2為SSR和ISSR分子標記的引物分別對2份崇明白扁豆進行PCR擴增后得到的電泳圖譜。

    表3 ISSR分子標記的引物信息及其多態(tài)性

    2.2 崇明白扁豆材料聚類分析

    2.2.1 利用SSR和ISSR分子標記聚類分析構(gòu)建的樹狀圖

    采用NTSYSpc V2.11軟件,分別利用大豆SSR和ISSR分子標記數(shù)據(jù)構(gòu)建相應(yīng)的樹狀圖(圖3和圖4)。大豆SSR分子標記遺傳相似系數(shù)介于0.39—0.99,其中材料5和19、38和46、60和62的相似系數(shù)最大,為0.9855。在相異系數(shù)0.74處,可將64份種質(zhì)材料分成4類,材料64獨自為第I類;材料60、62和63為第II類;材料27和61為第III類;剩下的材料均來自崇明,為第IV類,包括材料1—26和28—59(圖3)。ISSR分子標記遺傳相似系數(shù)介于0.33—1.00,其中材料51和54,44、45和46相似系數(shù)最大,為0.9968。ISSR分子標記在相異系數(shù)0.86處,也可將64份種質(zhì)材料分成4類,材料64獨自為第I類;材料60、62和63為第II類;材料59和61為第III類;剩下的材料均來自崇明,為第IV類,包括材料1—58(圖4)。比較圖3和圖4,SSR和ISSR兩種分子標記獲得了相似但不完全相同的聚類樹,說明兩種分子標記之間存在一定的差異,但都能較好地分析崇明白扁豆的遺傳差異。圖3中材料27與61為一類;而圖4中材料59與61為一類,表明不同分子標記技術(shù)所能檢測到的多態(tài)性比率不同。

    2.2.2 綜合SSR和ISSR分子標記構(gòu)建的樹狀圖

    將兩種分子標記分析的數(shù)據(jù)一起用NTSYSpc V2.11軟件進行聚類分析,得出64份供試材料的聚類樹狀圖(圖5),遺傳相似系數(shù)范圍為0.37—1.00。在相似系數(shù)0.82處,可將材料分為4個類群。材料64獨自成為第I類;材料60、62和63為第II類;材料27和61為第III類;剩下的材料均來自崇明,為第IV類,包括材料1—26和28—59。其中,相似系數(shù)最大的是材料45和46,為0.9957,表明其遺傳相似度較高,親緣關(guān)系較近;相似系數(shù)最小的是材料44和63,為0.2808,表明其遺傳相似度較低,親緣關(guān)系較遠。

    由兩種分子標記綜合聚類(圖5)與SSR分子標記聚類(圖3)、ISSR分子標記聚類(圖4)比較可知,兩種分子標記綜合聚類與SSR分子標記聚類和ISSR分子標記聚類基本一致。兩種分子標記綜合聚類和SSR分子標記聚類大體一致,而ISSR分子標記和前面兩者差異性體現(xiàn)在第III類。ISSR分子標記聚類圖中第III類是材料59與61,而綜合聚類圖和SSR分子標記聚類圖中第III類是材料27與61,其主要原因可能是兩種分子標記所檢測的基因座位不同,SSR分子標記檢測的是重復(fù)序列,而ISSR分子標記檢測的是重復(fù)序列中間區(qū)域。

    2.3 崇明白扁豆性狀與SSR和ISSR分子標記的相關(guān)性分析

    綜合參試材料的性狀(表1)和聚類結(jié)果(圖5),崇明白扁豆大多數(shù)聚類在一起,單一性狀基本呈聚集式分布。在花色上,類群IV和類群III呈淡黃色;類群I呈淡紫色;類群II為紫色。在種莢顏色上,除類群IV的材料26和53呈淡綠色外,其他材料均呈綠色。在豆色上,類群I呈乳白色;類群II呈黃白色;類群III呈淡綠色;類群IV除了材料26和53呈紫色,其余呈淡綠色。在鮮百粒重方面,材料1—63基本接近一致。綜上所述,類群III和類群IV親緣關(guān)系最近。

    3 討論

    3.1 ISSR和大豆SSR分子標記在植物中的應(yīng)用

    目前,在開放的基因組信息中,關(guān)于利馬豆的基因組信息相對較少,針對利馬豆開發(fā)SSR分子標記的成本費用相對較高。但是已有研究發(fā)現(xiàn),豆科植物中的SSR分子標記具有通用性[7-8]。相比于利馬豆,大豆植物的基因組已經(jīng)開發(fā)出了相當多的SSR分子標記。姚陸銘等[9]對源自中國、美國、泰國及印度的31份扁豆資源樣本進行SSR分子標記分析,發(fā)現(xiàn)大豆的SSR分子標記能很好地適用于扁豆的遺傳多樣性分析;扁豆資源主要可以分為3組且相互間無地域特異性差異,這表明扁豆資源中遺傳多樣性相對較低。相比于SSR分子標記,ISSR分子標記的標記效率較高,在指紋圖譜構(gòu)建時可用較少的引物區(qū)分不同的品種,但在試驗的重復(fù)性方面差于SSR分子標記[10-12]。肖志娟[13]對不同核桃品種遺傳多樣性的研究表明,在多態(tài)位點數(shù)的有效性方面,ISSR分子標記略高于SSR分子標記;在遺傳差異性方面,SSR分子標記略高于ISSR分子標記。SSR分子標記的多態(tài)性程度高,且呈共顯性遺傳,符合孟德爾遺傳規(guī)律。李永祥等[14]通過SSR和ISSR分子標記對12份披堿草屬植物進行遺傳多樣性比較分析,發(fā)現(xiàn)兩種分子標記效率和相關(guān)性在不同親緣關(guān)系水平上有所不同,說明不同的標記具有不同的多態(tài)性檢測范圍。綜合上述考慮,本研究利用大豆的SSR分子標記和ISSR分子標記對利馬豆的遺傳多樣性進行分析。從本研究結(jié)果可以看出,大豆的SSR分子標記比ISSR分子標記更能有效地區(qū)分崇明白扁豆的親緣關(guān)系。

    3.2 崇明白扁豆種質(zhì)資源分析

    本研究顯示,64份種質(zhì)材料的SSR分子標記多態(tài)性比率為22.9%,ISSR分子標記多態(tài)性比率為19.0%。所收集的利馬豆材料間的遺傳相似系數(shù)變幅較小,在0.84—1.00,表明其差異性不明顯,相似性較大。綜合分析表明,崇明白扁豆親緣關(guān)系十分相近,遺傳背景狹窄,區(qū)別較小,同一來源地的材料趨于聚為一類。這可能是由于崇明白扁豆長期改良、優(yōu)質(zhì)栽培并應(yīng)用推廣,導(dǎo)致所收集的種質(zhì)材料趨于接近,從而使崇明白扁豆親緣關(guān)系接近。來自江蘇海門的材料61利馬豆與崇明白扁豆的親緣關(guān)系最接近,江蘇海門與上海崇明島僅一江之隔,可以看出,相鄰的材料來源地存在親緣關(guān)系接近的現(xiàn)象。來自廣西的白扁豆(60)、河南的白扁豆(62)、山東的白扁豆(63)聚為一類;來自云南的大白蕓豆(64)單獨聚為一類,分子標記分析很容易區(qū)分白扁豆、大白蕓豆與崇明和江蘇海門利馬豆之間的關(guān)系,準確揭示崇明白扁豆(利馬豆)、白扁豆、大白蕓豆的親緣關(guān)系。

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