大連典型灘涂養(yǎng)殖區(qū)沉積物中抗生素協(xié)同重金屬和環(huán)境因素對(duì)抗性基因分布的影響

劉萱，趙慧敏，王華，劉璐，王詩(shī)慧，孫琦

(1.大連理工大學(xué) 環(huán)境學(xué)院，遼寧 大連 116024；2.大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連116023；3.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院，北京 100141)

為了預(yù)防水產(chǎn)動(dòng)物病害，抗生素在近海的集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中被普遍施用[1-2]。截至2016年，據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部統(tǒng)計(jì)，每年在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)施用的抗生素超過20萬t，并且使用量還呈逐漸增加的趨勢(shì)[3]。有研究顯示，養(yǎng)殖過程中大量施用的抗生素不能被養(yǎng)殖的水產(chǎn)動(dòng)物完全吸收，其中大部分以母化合物和代謝物的形式在水環(huán)境中殘留，呈現(xiàn)出“假持久性”[4-5]。因而，有超過20種抗生素及其代謝物(如氟喹諾酮類、磺胺類和氯霉素類)在中國(guó)近海的水產(chǎn)養(yǎng)殖主產(chǎn)區(qū)普遍檢出[6-8]。如在渤海養(yǎng)殖區(qū)附近的海水中有21種抗生素被檢出，其總濃度高達(dá)7722 ng/L[6-7]；在中國(guó)南方水產(chǎn)養(yǎng)殖主產(chǎn)區(qū)，有11種抗生素的平均濃度范圍為72～480 ng/L[8]。隨著對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)抗生素殘留的關(guān)注，人們逐漸認(rèn)識(shí)到養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)的存在和散布，可能對(duì)人類健康產(chǎn)生更嚴(yán)重的威脅[9-10]。ARGs具有不易消亡，可復(fù)制或傳播，能夠在環(huán)境中長(zhǎng)期存在的特征，對(duì)環(huán)境生態(tài)和人類健康造成巨大的潛在威脅。因此，水環(huán)境中的ARGs已成為人們關(guān)注的新興環(huán)境污染物[11-12]。

水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境已經(jīng)是世界公認(rèn)的ARGs儲(chǔ)存庫(kù)[13-14]。研究顯示，有多種ARGs已在水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境及其受納水體中被普遍檢出[14-19]。如山東東營(yíng)養(yǎng)殖區(qū)周圍的沉積物中17種ARGs的豐度顯著高于非養(yǎng)殖區(qū)[16]；中國(guó)南方養(yǎng)殖主產(chǎn)區(qū)海水中9種四環(huán)素類、磺胺類抗生素ARGs和2種整合子持久存在[8]；在珠江三角洲沿岸的養(yǎng)殖蝦池中，氟喹諾酮類、磺胺類、氯霉素ARGs和2種整合子普遍檢出，且發(fā)現(xiàn)ARGs可在養(yǎng)殖過程中不斷增殖、傳播[15]。越來越多的研究顯示，即使在缺乏抗生素篩選壓力的條件下，ARGs仍可在水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中持續(xù)檢出[17-20]。如在無抗生素使用的珠江沿岸生態(tài)魚塘的沉積物中發(fā)現(xiàn)，高豐度的磺胺類ARGs持續(xù)存在，家禽糞便是ARGs增殖的重要原因[17]；四環(huán)素、磺胺類耐藥細(xì)菌和ARGs被發(fā)現(xiàn)于無抗生素施用歷史的魚場(chǎng)，這可能與養(yǎng)殖活動(dòng)中投喂的魚粉或其他外源輸入有關(guān)[18-19]。Han等[20]研究了養(yǎng)殖水環(huán)境中添加魚粉對(duì)沉積物中ARGs的影響，揭示魚粉中包含的大量氮磷改變了沉積物的細(xì)菌族群組成，間接促進(jìn)了沉積物中ARGs的增殖。Zhao等[16]和He等[21]的研究顯示，養(yǎng)殖環(huán)境中重金屬和營(yíng)養(yǎng)鹽也對(duì)ARGs的存在和散布具有協(xié)同篩選影響?？梢?，養(yǎng)殖環(huán)境中影響ARGs存在、分布和傳播的因素非常復(fù)雜。因此，針對(duì)不同養(yǎng)殖模式/養(yǎng)殖品種的水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)，ARGs污染水平及其環(huán)境影響因素的相關(guān)研究仍需進(jìn)一步開展，以便更好地了解和評(píng)價(jià)養(yǎng)殖水環(huán)境中ARGs的存在和散布風(fēng)險(xiǎn)。

近海灘涂養(yǎng)殖區(qū)是海洋系統(tǒng)中最易受到人類活動(dòng)污染的區(qū)域之一[22-23]。近年來，典型灘涂養(yǎng)殖沉積物中重金屬和抗性細(xì)菌的污染已有報(bào)道[18,24]，但目前仍缺乏針對(duì)典型灘涂養(yǎng)殖區(qū)中ARGs污染情況的報(bào)道。本研究中，選取大連皮口的典型灘涂養(yǎng)殖區(qū)為研究區(qū)域，對(duì)15種ARGs和2種整合子的存在和豐度進(jìn)行評(píng)價(jià)，同時(shí)考察了該養(yǎng)殖區(qū)沉積物中抗生素、重金屬和理化指標(biāo)(鹽度、溶解性有機(jī)質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)鹽)對(duì)ARGs的影響，以期為養(yǎng)殖水環(huán)境中ARGs的生態(tài)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 調(diào)查區(qū)域及樣品的采集

2016年3月、6月、9月和11月四個(gè)季節(jié)，選取黃海北部大連皮口的典型灘涂貝類養(yǎng)殖區(qū)作為研究區(qū)域(122°40′39″～122°44′04″E、39°39′59″～39°41′08″N)，研究區(qū)域內(nèi)設(shè)置4個(gè)采樣點(diǎn)(C1、C2、C3和C4(圖1)。從每個(gè)采樣點(diǎn)采集沉積物3份，共計(jì)48個(gè)樣品，將所采集的沉積物樣品(100 g)用已滅菌的鋁箔紙包好放到無菌自封袋中，于4 ℃下保存(用冰塊降溫)并帶回大連海洋大學(xué)水環(huán)境化學(xué)實(shí)驗(yàn)室。用于DNA提取的沉積物樣品，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后保存于-80 ℃冰箱中；用于抗生素和其他理化指標(biāo)測(cè)定的沉積物樣品，用無菌自封袋分裝后于4 ℃下避光保存。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采用Fast DNA SPIN Kit for Soil(MP Biomedical,美國(guó))試劑盒，按照說明書對(duì)保存的沉積物樣品進(jìn)行DNA提取，最終得到體積為40 μL的DNA樣品。提取后的DNA通過10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳(Bio-Rad, 美國(guó))檢測(cè)其完整性，于-20 ℃下保存。采用超微量分光光度計(jì)(Nanodrop, ND1000, Thermo, 美國(guó))對(duì)DNA進(jìn)行濃度和純度的檢測(cè)。最后，配制每個(gè)樣品的部分DNA提取物為終濃度40 ng/μL，用于后續(xù)的ARGs定性和定量分析。

1.2.2 沉積物中ARGs的定性和定量分析 利用9902 普通PCR儀(ABI，美國(guó))對(duì)15種ARGs(qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、qepA、aac(6′)-Ib、su11、su12、su13、cmlA、floR、fexA、fexB、cfr)、2 種整合子(int1、int2)和16S rRNA基因進(jìn)行定性分析。PCR反應(yīng)體系(25 μL)包括：DNA 提取物模板2.5 μL，正、反向引物各2.5 μL，dNTPs 2 μL，10× Ex Taq buffer(Mg2+Plus)2.5 μL，qTaq DNA 聚合酶1.25 μL，無菌水11.75 μL。本研究中所用引物詳細(xì)信息見表1。PCR反應(yīng)程序：95 ℃下預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，退火30 s，退火溫度見表1，72 ℃延伸30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃延伸1 min，采用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證PCR產(chǎn)物的大小和特異性。驗(yàn)證后的PCR產(chǎn)物經(jīng)過切膠回收并純化后連接至pMD-18T載體(TaKaRa,日本)，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行克隆?？寺〕晒螅瑧?yīng)用SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒(TaKaRa,日本)對(duì)包含目的基因的質(zhì)粒進(jìn)行提取。提取的質(zhì)粒送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，所得的序列與NCBI網(wǎng)站中的目的基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)(一致性高于98%)。至此，經(jīng)生物公司驗(yàn)證含有目的基因的質(zhì)?？勺鳛橘|(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度為1.23×1013～7.82×1013copies/μL，稀釋標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為102～1013。應(yīng)用質(zhì)粒外標(biāo)法制備18個(gè)目的基因標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)沉積物樣品中ARGs進(jìn)行定量分析。

表1 PCR定量抗性基因表達(dá)引物序列與擴(kuò)增參數(shù)

利用7500快速熒光定量PCR儀(ABI, 美國(guó))測(cè)定沉積物中ARGs的絕對(duì)濃度。定量PCR反應(yīng)體系(20 μL)包括：DNA提取物模板2 μL，正、反向引物各0.6 μL，SYBR Premix Dimer Eraser 10 μL，無菌水6.8 μL。定量PCR運(yùn)行的程序設(shè)置條件與普通PCR一致，定量PCR儀所附帶的程序在擴(kuò)增后自動(dòng)進(jìn)行溶解曲線分析。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2值均超過0.971，定量PCR的效率為92.0%～106.0%。為了保證沉積物樣品測(cè)定的有效性，每組試驗(yàn)均設(shè)置陰性對(duì)照，且每組樣品進(jìn)行3次平行擴(kuò)增。僅當(dāng)每組3次均出現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增時(shí)，認(rèn)為沉積物樣品中的目的基因被有效檢測(cè)。普通PCR、定量PCR的反應(yīng)體系和瓊脂糖凝膠電泳所用試劑均購(gòu)于日本TaKaRa。

1.2.3 化學(xué)分析 采用pH計(jì)和電導(dǎo)鹽度計(jì)(Thermo, P310/EC500, 美國(guó))分別測(cè)定沉積物樣品中的pH值和鹽度；采用顯色法測(cè)定沉積物樣品中的總氨氮(TAN)、總氮(TN)和總磷(TP)含量；應(yīng)用元素分析儀(Elementar, 德國(guó))測(cè)定沉積物樣品中的總有機(jī)碳(TOC)含量；應(yīng)用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS 7500, Agilent, 美國(guó))測(cè)定沉積物樣品中的重金屬銅(Cu)、鋅(Zn)、鎘(Cd)、鉻(Cr)、汞(Hg)和鉛(Pb)含量。所有的檢測(cè)過程均參照GB 17378.5—2007《海洋檢測(cè)規(guī)范》第五部分：沉積物分析方法和Lu等[25]報(bào)道的方法。

采用HPLC-MS/MS質(zhì)譜聯(lián)用法(Agilent,6470, 美國(guó))對(duì)三大類抗生素進(jìn)行分析，包括：6種氟喹諾酮類抗生素FQs(諾氟沙星NOR、環(huán)丙沙星CIP、恩諾沙星EFC、洛美沙星LFC、氧氟沙星(OFC)和沙氟沙星SFC)；13種磺胺類抗生素(SAs)(磺胺醋酰SAAM、磺胺地索辛SDM、磺胺多辛SDX、磺胺嘧啶SDZ、磺胺異噁唑SIX、磺胺對(duì)甲氧嘧啶SM、磺胺二甲氧嘧啶SM2、磺胺間甲氧嘧啶SMM、磺胺甲氧噠嗪SMP、磺胺甲基嘧啶SMR2、磺胺甲噁唑SMZ、磺胺甲噻二唑SMTZ和磺胺噻唑STZ)；2種氯霉素類抗生素(CAPs)(氯霉素CAP、氟苯尼考FF)。將上述待測(cè)抗生素的標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇制成質(zhì)量濃度為1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，保存于-20 ℃冰箱中。所有標(biāo)準(zhǔn)品及溶劑乙腈均購(gòu)于德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司。

樣品的前處理依據(jù)杜娟等[26]的方法并進(jìn)行優(yōu)化。沉積物樣品經(jīng)冷凍干燥后過孔徑為0.3 mm篩，準(zhǔn)確稱取1.0 g，加入回收率標(biāo)準(zhǔn)品氘代磺胺甲惡唑50 ng，在暗處?kù)o置1 h后，加入10 mL甲醇∶乙腈(體積比為1∶1，下同)的提取液。以200 r/min振蕩20 min，然后超聲15 min，重復(fù)兩次合并提取液，并用鹽酸調(diào)節(jié)其pH至2.5。選取Oasis HLB SPE小柱(500 mg/6 mL)作為萃取柱進(jìn)行富集。上樣前，SPE柱依次用30 mL的甲醇、9 mL的超純水和9 mL的鹽酸溶液(pH 2.5)活化，上樣流速為10 mL/min，然后用10 mL超純水進(jìn)行淋洗，用氮?dú)獯? min，最后用100%甲醇洗脫。洗脫液經(jīng)過40 ℃水浴并旋蒸至近干，用甲醇∶乙腈提取液溶解殘?jiān)?，定容? mL，過0.22 μm有機(jī)濾膜，待測(cè)。以0.1%甲酸∶1 g/L甲酸銨水溶液和甲醇∶乙腈體系分別作為流動(dòng)相A和流動(dòng)相B，經(jīng)過梯度洗脫對(duì)待測(cè)的抗生素含量進(jìn)行定性定量分析。儀器檢測(cè)方法、精度及質(zhì)量控制均依照葉賽等[27]和Ye等[28]的方法進(jìn)行。所有樣品的抗生素定量范圍均在0.05～0.20 ng/L。每種沉積物樣品的前處理和抗生素檢測(cè)均設(shè)置3組平行。甲醇和乙腈(色譜級(jí))購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，甲酸和甲酸銨(分析純)購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行ARGs豐度與沉積物環(huán)境指標(biāo)的相關(guān)性分析，以及不同沉積物樣品間ARGs的豐度差異分析；采用Canoco 4.5對(duì)沉積物樣品進(jìn)行典范對(duì)應(yīng)分析(CCA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大連皮口典型灘涂養(yǎng)殖區(qū)沉積物中ARGs檢出種類和濃度

從圖2可見：除qnrC和fexB外，13種ARGs和2種整合子在養(yǎng)殖區(qū)沉積物中普遍存在，其中包括6種喹諾酮類ARGs、3種磺胺類ARGs和4種氯霉素類ARGs；qnrS和sul1是4個(gè)站位沉積物中最常檢出的ARGs，檢出頻率為100%，其他ARGs檢出頻率依次為sul2、floR(95%)>qnrA、qnrB、qepA、fexA、int1(83.3%)>aac(6′)-Ib、cmlA、sul3、int2(60%)>qnrD(50%)>cfr(25%)；沉積物中ARGs濃度范圍的對(duì)數(shù)[lg(copies/g)，下同]為1.57～5.94；在檢出的ARGs中，qnrS的平均濃度最高，其對(duì)數(shù)值達(dá)到5.27，其次是sul1，平均濃度的對(duì)數(shù)值為5.15，cfr濃度最低，平均濃度的對(duì)數(shù)值僅為2.03。另外，本研究中對(duì)沉積物中細(xì)菌族群的總濃度(16S rRNA)也進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示，其年季濃度范圍的對(duì)數(shù)值為5.80～6.87。為了更準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)ARGs的豐度水平，避免細(xì)菌總豐度變化引起環(huán)境因素對(duì)ARGs的影響，后續(xù)研究中ARGs豐度均采用經(jīng)16S rRNA標(biāo)準(zhǔn)化后的常用對(duì)數(shù)值來表示。圖3為大連皮口典型灘涂養(yǎng)殖區(qū)沉積物中ARGs的年季分布熱圖，其中ARGs豐度范圍的對(duì)數(shù)[lg(copies/g)]為-5.08～-1.22，qnrA、qnrB、qnrS、sul1、sul2、floR和fexA是沉積物中優(yōu)勢(shì)的ARGs類型。

2.2 大連皮口典型灘涂養(yǎng)殖區(qū)沉積物的理化特征、重金屬和抗生素的年季含量

從表2可見：2016年，沉積物年季的pH和鹽度范圍分別為8.10～8.69和24.7～26.7，pH和鹽度的平均值在春季(3月)和冬季(11月)顯著高于夏季(6月)和秋季(9月)(P<0.05);沉積物中年季的TN、TP、TAN和TOC的濃度范圍分別為8.602～10.580、0.335～0.482、1.659～1.792、16.447～16.666 g/kg，且TP、TAN和TOC含量各季節(jié)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但夏季和秋季的TN含量顯著高于春季和冬季(P<0.05)，表明夏季和秋季灘涂養(yǎng)殖區(qū)的水產(chǎn)養(yǎng)殖活動(dòng)對(duì)沉積物中TP、TAN和TOC含量的影響很小，但對(duì)TN含量的影響顯著。

表2 典型灘涂養(yǎng)殖區(qū)沉積物的年季理化特征

從表3可見：2016年年季沉積物中Cu、Zn、Cr、Cd、Pb和Hg的濃度范圍分別為16.456～23.509、60.141～93.478、1.140～1.740、0.120～0.143、23.274～27.075、0.019～0.037 mg/kg；夏季和秋季Cu和Zn濃度顯著高于春季和冬季(P<0.05)，其他金屬濃度未見有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，表明季節(jié)性的人類養(yǎng)殖活動(dòng)對(duì)沉積物中Cu和Zn的存在和分布影響較大，但對(duì)其他金屬未表現(xiàn)出明顯影響。

從表4和圖4可見：沉積物中共檢出15種抗生素，F(xiàn)Qs是最優(yōu)勢(shì)的檢出類型，其中6種特性的FQs全部檢出，檢出總濃度范圍為4.682～78.368 ng/g，表明FQs可能是該灘涂養(yǎng)殖區(qū)主要施用的抗生素類型，NOR、LFC、OFC和SFC為優(yōu)勢(shì)檢出的FQs類型，檢出頻率分別為100%、75%、75%、77%；SAs和CAPs的檢出總濃度范圍分別為4.312～26.463、0.953～1.436 ng/g，共有7種SAs被檢出，其濃度范圍為ND～7.066 ng/g，STZ、SDZ、SM和SAAM為SAs中優(yōu)勢(shì)的檢出類型，檢出頻率大于50%，而2種CAPs的檢出頻率為100%，但其檢出濃度范圍僅為0.382～0.716 ng/g。由圖4所示，夏季和秋季沉積物中抗生素的檢出濃度顯著高于春季和冬季(P<0.05)，揭示了頻繁的夏季和秋季養(yǎng)殖活動(dòng)中，施用抗生素的頻繁程度可能對(duì)沉積物中抗生素的累積具有一定影響[3,7]。

2.3 大連皮口典型灘涂養(yǎng)殖區(qū)沉積物中ARGs與理化特征、重金屬、抗生素的相關(guān)性分析

基于皮爾森相關(guān)性的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，本研究中分析了沉積物中理化指標(biāo)、重金屬和抗生素對(duì)ARGs的影響。首先，將所測(cè)定的沉積物中各種環(huán)境變量分為兩個(gè)組別，分別為抗生素和其他環(huán)境因素，其他環(huán)境因素中包含沉積物的基礎(chǔ)理化特征(TOC、TN、TP、TAN)和重金屬因子(Cu、Zn、Cr、Cd、Hg和Pb)。其次，應(yīng)用皮爾森相關(guān)性分析抗生素、環(huán)境因素與ARGs之間的相關(guān)性，結(jié)果如表5所示。其中，Cu和Zn與ARGs的豐度呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)(r=0.676～0.784,P<0.01)，而pH、鹽度、Cr和Pb則與ARGs呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.897～-0.696,P<0.05或P<0.01)。5種抗生素NFC、SAAM、STZ、CAP和FF分別與其相應(yīng)的ARGs類型呈顯著正相關(guān)(r=0.590～0.853,P<0.05或P<0.01)，表明抗生素對(duì)其相應(yīng)的ARGs存在和分布具有直接篩選作用。值得注意的是，NFC、SAAM也分別對(duì)sul3(r=0.722，P<0.05)和aac(6′)-Ib(r=0.845,P<0.01)表現(xiàn)出相關(guān)性，揭示抗生素對(duì)其他類型的ARGs存在和分布也提供了間接的篩選作用。

表3 典型灘涂養(yǎng)殖區(qū)沉積物中重金屬年季檢出含量

Tab.3 Annual detected contents of heavy metals in sediments of typical intertidal mudflat culture area mg/kg

月份month銅Cu鋅Zn鉻Cr鎘Cd鉛Pb汞Hg范圍range平均值mean范圍range平均值mean范圍range平均值mean范圍range平均值mean范圍range平均值mean范圍range平均值mean316.635^18.26717.45161.530^65.88063.7051.425^1.5151.4700.121^0.1240.12323.984^27.07525.530.021^0.0270.024619.635^20.90720.21764.229^67.55965.9141.140^1.7401.4400.137^0.1430.14023.475^26.71525.0950.029^0.0370.033922.178^23.50922.84364.567^83.47874.0231.442^1.4711.4560.120^0.1390.13023.369^26.56124.9650.026^0.0370.0311116.456^21.92519.19160.141^63.31261.7271.403^1.4931.4480.120^0.1310.12523.274^24.54623.9100.019^0.0240.022年季annual16.456^23.50919.92660.141^93.47866.3421.140^1.7401.4530.120^0.1430.13023.274^27.07524.8750.019^0.0370.028

表4 灘涂養(yǎng)殖區(qū)沉積物中抗生素濃度范圍和檢出頻率(n=16)

Tab.4 Concentration range and detected frequency of antibiotics in sediments of culture area(n=16)

檢出類型detectedtype抗生素濃度/(ng·g-1)concentrationofantibiotics最大值max最小值min平均值mean檢出頻率/%frequency環(huán)丙沙星CIP2.330ND1.09054恩諾沙星EFC32.552ND14.31848洛美沙星LFC10.130ND6.61875諾氟沙星NOR22.3654.68215.978100氧氟沙星OFC5.437ND3.93775啥氟沙星SFC5.554ND4.20377醋酸酰胺SAAM4.006ND2.12754磺胺嘧啶SDZ0.949ND0.47575磺胺地索辛SDM1.236ND0.23821磺胺對(duì)甲氧嘧啶SM5.048ND2.79650磺胺二甲氧嘧啶SM27.066ND2.93446磺胺甲基嘧啶SMR21.092ND0.38840磺胺甲噁唑STZ7.0664.3125.717100氯霉素CAP0.6750.3820.462100氟苯尼考FF0.7610.5710.639100

注：ND(未檢出)代表平均濃度低于檢出限

Note：ND(not detected)represents that the average concentration is below the detection limit

另外，基于上述的皮爾森相關(guān)性分析結(jié)果，在灘涂養(yǎng)殖區(qū)沉積物中篩選出5種抗生素(NFC、SAAM、STZ、CAP和FF)和6種環(huán)境理化指標(biāo)(pH、鹽度、Cu、Zn、Cr和Pb)作為環(huán)境因素，進(jìn)一步解析環(huán)境因素對(duì)ARGs的存在和豐度影響。首先，應(yīng)用Canoco軟件對(duì)ARGs組成與環(huán)境因素進(jìn)行排序，結(jié)果顯示排序的長(zhǎng)度梯度大于4，適用于單峰模型的CCA分析。因此，選取CCA分析對(duì)物種組成與環(huán)境因素之間的關(guān)系進(jìn)行限制性排序，結(jié)果如圖5所示。其中，抗生素協(xié)同對(duì)ARGs組成和豐度的貢獻(xiàn)率為51.2%。沿第一象限軸，SAAM、FF、Cu和Zn與ARGs呈顯著的線性關(guān)聯(lián)，其總貢獻(xiàn)率為43.7%，說明這兩種抗生素協(xié)同重金屬Cu和Zn對(duì)微生物群落中ARGs的增殖和傳播影響較大；而沿著第二象限軸，pH、鹽度、Cr和Pb與大多數(shù)檢出的ARGs呈顯著的負(fù)相關(guān)，此結(jié)果與皮爾森相關(guān)性分析結(jié)果一致，但其對(duì)形成此ARGs分布的總貢獻(xiàn)率僅為7.5%，表明這些因素對(duì)微生物群落中ARGs的影響較小。

表5 大連皮口典型灘涂養(yǎng)殖區(qū)沉積物中ARGs與抗生素、環(huán)境因素的皮爾森相關(guān)性分析(n=16)

Tab.5 Pearson correlation analysis among ARGs, antibiotics, and environmental factors in sediments of Pikou typical intertidal mudflat culture area in Dalian(n=16)

因子factorqnrBqnrSqepAaac(6′)-Ibsul1sul2sul3floRfexAint1int2恩諾沙星NFC0.737?0.772?0.747?0.6610.5580.6770.722?0.7960.0270.4610.544醋酸酰胺SAAM0.5480.038-0.2040.845??0.824??0.704-0.4460.178-0.1540.0540.503磺胺甲噁唑STZ0.0900.2110.2080.3880.3050.792?0.3940.3050.0070.4770.068氯霉素CAP0.5500.3440.1550.604?0.637?-0.405-0.0340.638?-0.1350.590?0.537氟苯尼考FF0.1350.559-0.0360.4490.376-0.416-0.275-0.1110.853??0.1560.176pH-0.881-0.787-0.371-0.696??-0.892-0.909-0.918-0.8070.857-0.163-0.764鹽度salinity-0.722-0.851-0.491-0.920-0.891??-0.809-0.764-0.599-0.783?0.009-0.905銅Cu0.7700.8850.4210.9390.676??0.8520.8070.6550.766??0.0720.920鋅Zn0.7080.7570.5860.9310.784??0.7780.7610.5920.768??-0.0950.813鎘Cr0.828-0.897??-0.0520.8210.7650.9030.8190.746-0.7630.483-0.760?鉛Pb0.8790.7100.373-0.783?0.8400.8870.9190.820-0.7960.1580.672

注: *表示顯著相關(guān)(P<0.05), **表示極顯著相關(guān)(P<0.01)

Note: * means significant correlation(P<0.05), **means very significant correlation(P<0.01)

3 討論

3.1 灘涂養(yǎng)殖區(qū)沉積物中ARGs的多樣性和豐度

本研究中分析了大連近岸典型灘涂養(yǎng)殖區(qū)沉積物中ARGs的存在種類和豐度水平，13種ARGs和2種整合子在沉積物中廣泛存在。其中qnrA、qnrB、qnrS、sul1、sul2、floR和fexA的總豐度占所有檢出ARGs的64.3%，是沉積物中優(yōu)勢(shì)的ARGs類型。在珠江附近的養(yǎng)蝦池塘環(huán)境沉積物中也發(fā)現(xiàn)sul1、qnrD、floR和cmlA為檢出的優(yōu)勢(shì)ARGs類型[15]。在中國(guó)南方水產(chǎn)養(yǎng)殖主產(chǎn)區(qū)沉積物中，四環(huán)素類、磺胺類ARGs被發(fā)現(xiàn)與賦予其抗性的抗生素濃度顯著相關(guān)[8]。值得注意的是，本研究中的抗生素檢測(cè)結(jié)果顯示，磺胺類抗生素檢出的種類和濃度都顯著高于氯霉素類抗生素，且濃度變化呈現(xiàn)明顯的季節(jié)特征。然而，本研究區(qū)域的沉積物中僅檢出了4種氯霉素類ARGs(cmlA、floR、fexA和cfr)，且其檢出率和總豐度明顯高于磺胺類ARGs。另外，統(tǒng)計(jì)分析顯示，不同季節(jié)的沉積物中ARGs豐度未見顯著性差異(P>0.05)?？梢?，灘涂養(yǎng)殖環(huán)境沉積物中抗生素殘留對(duì)ARGs存在和分布僅具有一定影響，而其他的環(huán)境因素如營(yíng)養(yǎng)鹽和重金屬也可能起到了協(xié)同篩選作用[10,16,29]。因此，在典型的灘涂養(yǎng)殖區(qū)沉積物中影響ARGs存在和分布的環(huán)境因素需進(jìn)一步探究。

3.2 灘涂養(yǎng)殖區(qū)沉積物中環(huán)境因素、重金屬協(xié)同抗生素對(duì)ARGs存在和分布的影響

抗生素對(duì)本土微生物產(chǎn)生的直接和間接的篩選作用是養(yǎng)殖環(huán)境中ARGs存在和分布的重要原因[8,21]，然而越來越多的研究證實(shí)，環(huán)境因素和重金屬對(duì)環(huán)境中ARGs的出現(xiàn)和傳播具有共選擇的機(jī)制[16,30-31]。本研究中通過皮爾森相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，pH和鹽度對(duì)ARGs在沉積物中的存在和豐度呈現(xiàn)顯著的抑制作用。Bergeron等[30]也報(bào)道了沼澤水環(huán)境中濃度為6 mg/L的鹽度最適合ARGs的存在和散布，而鹽度水平高于或低于6 mg/L則對(duì)ARGs增殖呈現(xiàn)明顯的抑制作用。Chen等[32]發(fā)現(xiàn)，環(huán)境中TOC可以與抗生素(如佛喹諾酮類和磺胺類抗生素)發(fā)生作用，形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，這可能影響抗生素在環(huán)境細(xì)菌的生物有效性，進(jìn)而可能降低對(duì)ARGs表達(dá)和增殖。在養(yǎng)豬場(chǎng)池塘和河口環(huán)境中，水質(zhì)指標(biāo)COD、TN、TAN和有效磷被證實(shí)與ARGs的存在和豐度顯著相關(guān)，這間接揭示了其對(duì)ARGs的分布和傳播起到協(xié)同篩選作用[25,31]。更值得注意的是，養(yǎng)殖過程中大量的餌料通常不能被養(yǎng)殖生物完全吸收或代謝，一部分直接進(jìn)入海水和沉積物，使得其中氮磷的含量顯著升高，因而養(yǎng)殖水體常呈現(xiàn)富營(yíng)養(yǎng)化狀態(tài)[33]。Zhao等[16]在山東東營(yíng)水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)周邊的沉積物中發(fā)現(xiàn)，營(yíng)養(yǎng)鹽可聯(lián)合細(xì)菌族群和重金屬共同影響ARGs檢出的輪廓。Han等[20]研究了魚飼料添加對(duì)沉積物中ARGs的影響，揭示沉積物中營(yíng)養(yǎng)鹽的含量顯著增加引發(fā)的微生物族群變化是ARGs增殖的根本原因。因此，灘涂養(yǎng)殖區(qū)沉積物中鹽度、營(yíng)養(yǎng)鹽和TOC等環(huán)境因素對(duì)ARGs的存在和分布影響不容忽視。

先前的研究顯示，在污水處理廠、養(yǎng)殖場(chǎng)的土壤和沉積物中重金屬含量與ARGs豐度存在著極顯著的相關(guān)性[16,34-35]，這與本研究結(jié)果一致。Cu和Zn是畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物生長(zhǎng)所必需的微量元素，因而在畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖的飼料中被普遍添加[20-21]，這可能是本研究沉積物中Cu和Zn含量在養(yǎng)殖活動(dòng)頻繁的夏季和秋季顯著增加的原因之一。在肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境中，He等[21]基于皮爾森相關(guān)性分析間接揭示了重金屬對(duì)ARGs的存在和分布起到聯(lián)合篩選作用。Zhao等[16]應(yīng)用冗余分析直接證實(shí)了營(yíng)養(yǎng)物和重金屬的協(xié)同篩選對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中ARGs動(dòng)力學(xué)變化起到重要作用。本研究中，皮爾森相關(guān)性分析和CCA結(jié)果顯示，Cu和Zn協(xié)同5種抗生素(NFC、SAAM、STZ、CAP和FF)共同影響了ARGs的分布輪廓，證實(shí)了高濃度Cu和Zn能夠聯(lián)合養(yǎng)殖過程中殘留的抗生素對(duì)本土微生物提供協(xié)同篩選壓力，進(jìn)而促進(jìn)ARGs和相關(guān)移動(dòng)基因元件的增殖和散布[10,21,34-35]。綜上所述，環(huán)境因素協(xié)同抗生素的聯(lián)合篩選是大連典型灘涂養(yǎng)殖區(qū)沉積物中ARGs存在和分布的重要因素。

3.3 大連典型灘涂養(yǎng)殖區(qū)ARGs潛在污染指示基因

有研究顯示，環(huán)境中部分ARGs能作為污染指示基因，可以有效地反映該地區(qū)ARGs的污染水平。由圖6可見，基于線性回歸分析的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，灘涂養(yǎng)殖區(qū)沉積物中頻繁檢出的qnrS、sul1與3種主要檢出ARGs的總豐度顯著相關(guān)(P<0.05)。Su等[15]應(yīng)用線性回歸分析發(fā)現(xiàn)，檢出豐度最高的sul1與主要檢出四大類ARGs總豐度均顯著相關(guān)，其可作為養(yǎng)殖蝦池環(huán)境中ARGs的污染指示基因。Huang等[17]也闡明tetA對(duì)∑tet、∑ARGs和int1的豐度呈現(xiàn)出極其顯著的相關(guān)性(P<0.01)，這可作為判斷tetA是該生態(tài)養(yǎng)殖池塘中四環(huán)素類ARGs污染指示基因的依據(jù)。另外，在代表性的養(yǎng)雞環(huán)境中，檢出頻率高、豐度高的ARGs(如fexA、tetW和sul1)也作為示蹤人為來源ARGs的污染指示基因被報(bào)道[21]。在本研究中，qnrS和sul1是檢出最多、豐度最高的兩種ARGs類型，且其與3類主要檢出的ARGs總豐度(∑qnr、∑sul和∑cml)顯著相關(guān)(P<0.05)。綜上所述，本研究中認(rèn)為，qnrS和sul1可作為示蹤灘涂養(yǎng)殖沉積物中ARGs的潛在污染指示基因。

4 結(jié)論

(1)對(duì)大連皮口典型灘涂養(yǎng)殖區(qū)沉積物中的ARGs存在種類和豐度進(jìn)行了年季監(jiān)測(cè)，結(jié)果表明，養(yǎng)殖區(qū)沉積物中普遍存在13種ARGs和2種整合子，主要的檢出類型為喹諾酮類、磺胺類和氯霉素類。其中qnrA、qnrB、qnrS、sul1、sul2、floR和fexA是優(yōu)勢(shì)的ARGs。不同養(yǎng)殖季節(jié)，沉積物中ARGs豐度的差異不顯著(P>0.05)。

(2)典型灘涂養(yǎng)殖區(qū)沉積物中氟喹諾酮類抗生素是主要的抗生素污染類型。沉積物中TN和重金屬Cu、Zn含量較高，呈現(xiàn)明顯的季節(jié)變化(P<0.05)?？股亍⒅亟饘?、環(huán)境因素與ARGs的相關(guān)分析表明，在大連皮口典型灘涂養(yǎng)殖區(qū)沉積物中抗生素協(xié)同重金屬和環(huán)境因素(NFC、FF、SAAM、STZ、CAP、Cu、Zn、pH、鹽度、Cr和Pb)提供的協(xié)同篩選是誘導(dǎo)ARGs持久存在和傳播的重要因素。

(3)qnrS和sul1是典型灘涂養(yǎng)殖區(qū)沉積物中優(yōu)勢(shì)的ARGs，其與主要檢出的喹諾酮類、磺胺類和氯霉素類ARGs總豐度均呈顯著相關(guān)，揭示qnrS和sul1可作為灘涂養(yǎng)殖區(qū)沉積物中ARGs的污染指示基因。