超聲破碎和胰蛋白酶酶解奶牛胎盤制備還原性多肽方法的建立與優(yōu)化

沈留紅 朱潁琨 張 鉞 尤留超 錢柏霖 石 湉 董 可 張帥杰 吳禹熹 余樹民 曹隨忠 王 婭*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院/動物疫病與人類健康四川省重點實驗室/奶牛疾病研究中心，成都 611130；2.成都市動物疫病預(yù)防控制中心,成都 611130；3.四川育強本草生物技術(shù)有限公司,成都 611130)

胎盤組織含有激素、免疫球蛋白、多肽、環(huán)肽、甾體、膠原蛋白和多種氨基酸等大量生物活性成分[1-2]，具有抗氧化、抗疲勞和促進恢復(fù)等作用[3]，廣泛用于治療慢性疾病[4-6]。中醫(yī)臨床傳統(tǒng)利用方法是采集新鮮胎盤，蒸煮干燥后碾碎入藥。也有研究通過改變蒸煮條件，增加炮制材料等方式有效提高胎盤制品生物學(xué)活性和總物質(zhì)含量[7]。多肽是目前胎盤成分研究的熱點之一，豬、牛、羊和鹿等動物胎盤組織均含有或可提取多種具有抗癌、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)活性等功能的多肽分子[8-12]。酶解法可獲得成分和種類較為明晰，作用方式相對確定的活性多肽[8,13-15]。目前酶解工藝的優(yōu)化多針對于提升活性，但未必可取得較高提取率[16-17]。因此，為有效利用酶解產(chǎn)物，需對其提取率和活性進行綜合優(yōu)化。奶牛胎盤是奶牛分娩后副產(chǎn)物，其含有多種天然生物活性多肽[18]，來源廣泛，因酶解制備奶牛胎盤多肽技術(shù)尚未成熟多被直接丟棄。因此，本研究擬通過超聲破碎法和胰蛋白酶酶解法提取奶牛胎盤還原性多肽，分析各因素對胎盤還原性多肽制備中提取率和還原力的影響，建立奶牛胎盤還原性多肽的最佳提取方法，并以綜合提取率作為響應(yīng)值對各因素水平進一步優(yōu)化，以期同時獲得具有較高還原活性和提取率的奶牛胎盤多肽，為其臨床開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選擇四川省某規(guī)?；膛霭敕忾]統(tǒng)一舍飼，體重600 kg左右，2～4胎，體況良好、妊娠足月、自然分娩的健康中國荷斯坦奶牛新鮮胎盤組織，立即使用生理鹽水清洗，除去胎盤內(nèi)殘留血液及污物，至胎盤子葉呈粉紅色后，于-20 ℃冷凍保存。

1.2 試驗試劑及儀器

XC-CDS650超聲細胞破碎儀(寧波先倡電子科技有限公司)；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)；LYOQUEST 冷凍干燥機(阿自倍爾泰事達機電設(shè)備上海有限公司)；SorvallTMLegendTMXT冷凍離心機、Varioskan LUX全波長多功能酶標(biāo)儀、BarnsteadTMGenPureTMPro 超純水機(賽默飛世爾科技中國有限公司)。

胰蛋白酶(250 u/mg，生產(chǎn)批號920T041，索萊寶生物科技有限公司)；磷酸二氫鉀(KH2PO4)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、三氯乙酸(Cl3COOH)、三氯化鐵(FeCl3)、鐵氰化鉀(K3[Fe(CN)6])、維生素C(VitC)等(均為分析純，成都科隆化學(xué)品有限公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1奶牛胎盤組織預(yù)處理

將冷凍保存的奶牛胎盤組織切割，稱量后置于由封口膜密閉燒杯中以免質(zhì)量損失，37 ℃水浴復(fù)溫融化，剪刀初步剪碎胎盤組織，為保證其原有分子不致因組織勻漿機產(chǎn)熱而分解[19]，在冰浴條件下使用組織勻漿機以12 000 r/min破碎至無明顯組織碎塊。

1.3.2超聲破碎法制備奶牛胎盤多肽

冰浴條件下，選擇勻漿濃度(50%、40%、30%，M底物∶M總)、超聲功率(900、1 350、1 800 W)和破碎時間(2.50、5.00、7.50 min)為因素[20]，基于L934正交表對1.3.1所制備勻漿進行超聲破碎后，以 6 000 r/min 離心5 min，收集上清，冷凍干燥24 h，所得凍干粉即奶牛胎盤多肽，稱量并計算提取率RE(RE=(凍干粉回收質(zhì)量/胎盤組織勻漿質(zhì)量)×100%。

1.3.3酶解法制備奶牛胎盤多肽

參照胰蛋白酶(Trypsin)說明書所述最適條件(37 ℃，pH=8.0)以1.3.1所制備勻漿為底物酶解，酶解后沸水浴10 min滅活。將酶解液以 6 000 r/min 離心5 min，收集上清，冷凍干燥24 h，稱量凍干粉質(zhì)量并計算提取率RE。

以Design expert 8.0.6軟件，基于Box-Behenken中心響應(yīng)法設(shè)計響應(yīng)面試驗，以酶解時間、底物濃度(M底物∶M總)和酶底質(zhì)量比(酶底比，M酶∶M底物)為自變量，做三因素三水平共17個試驗點，包括5個中心點和12個析因點。參考山羊胎盤酶解條件設(shè)計試驗[21, 22]，分別對各因素編碼：記酶解時間(h)，底物濃度和酶底比為因素A、B和C，酶解時間3.00、5.00、7.00 h；底物濃度10.00%、30.00%、50.00%；酶底比1.00%、3.00%、5.00%分別對應(yīng)A、B、C因素水平為-1、0、1。

1.3.4普魯士藍法標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及奶牛胎盤多肽還原能力測定

參照參考文獻[23]，分別將VitC配制為100.000、50.000、25.000、12.500、6.250、3.125 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液；另配制10.0%三氯乙酸溶液、10.0%鐵氰化鉀溶液、0.1%三氯化鐵溶液和pH 6.6磷酸鹽緩沖液。分別向75 μL各濃度VitC標(biāo)準(zhǔn)溶液先后加入75 μL pH 6.6磷酸緩沖液和1.0%鐵氰化鉀溶液，充分震蕩后50 ℃水浴20 min，加入75 μL 10%三氯乙酸溶液，3 000 r/min離心1 min，制得待測液。取200 μL待測液置于96孔板中，加入 20 μL 0.1%三氯化鐵溶液，測定其A700。以標(biāo)準(zhǔn)溶液VitC濃度為橫坐標(biāo)，以A700為縱坐標(biāo)，使用SPSS 24.0以線性回歸方式建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將胎盤凍干粉用pH 6.6磷酸鹽緩沖液稀釋為1.0 mg/mL待測液，后續(xù)操作同上，測定A700后將其代入標(biāo)準(zhǔn)曲線以獲得待測液相當(dāng)?shù)腣itC溶液濃度，記為VitC當(dāng)量(μg/mg)。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

分別以提取率和還原力為響應(yīng)值，應(yīng)用 Design 8.0.6 以酶解時間、底物濃度和酶底比為因素建立響應(yīng)面回歸模型，并驗證其擬合度和可靠性。

1.5 奶牛胎盤多肽高效提取方法的建立及優(yōu)化

基于響應(yīng)面模型，分析各因素對提取率和還原力的影響，依照模型所確定的最優(yōu)化條件進行平行試驗(重復(fù)6次)，并對實際結(jié)果和模型期望值進行對比以驗證響應(yīng)面模型有效性。

對所制備多肽提取率與還原力進行相關(guān)性分析，并以每克胎盤所提取多肽的還原能力作為綜合提取率E(μg/g)。以E為響應(yīng)值，建立響應(yīng)面回歸模型，分析其擬合度和可靠性后，基于該模型優(yōu)化多肽制備條件，并進行平行試驗(重復(fù)6次)，以確認優(yōu)化結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 普魯士藍法標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

制備100.000、50.000、25.000、12.500、6.250和3.125 μg/mL的VitC標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用普魯士藍法測得的A700為1.670、0.802、0.367、0.187、0.150和0.097。以VitC濃度為自變量，A700為因變量，使用SPSS 24.0進行線性回歸分析，建立截距為0.008(SE=0.002 5)，自變量因數(shù)為0.0164(SE=0.001)的線性回歸模型，即：A700=0.016 4×VitC當(dāng)量+0.008。相關(guān)系數(shù)為99.6%，預(yù)測效果可靠，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

2.2 不同超聲破碎條件對奶牛胎盤多肽提取效果的影響

超聲破碎法制備多肽的提取率測量和Vitc當(dāng)量檢測結(jié)果見表1，A、B和C三因素對提取率和Vitc當(dāng)量的極差分別為0.18、0.26、0.37和0.54、0.85、3.16，表示三因素中，超聲破碎時間對提取率的影響最大，超聲功率次之，底物濃度最低。

2.3 不同胰蛋白酶酶解條件對制備奶牛胎盤多肽的影響

基于1.3.3所述試驗方法對奶牛胎盤勻漿進行酶解，各酶解體系實際底物質(zhì)量、加酶量、多肽回收量如表2所示。當(dāng)A因素水平為-1，B因素水平為0，C因素水平為-1和1及A因素為-1，C因素0，B因素水平為-1和1時，提取率為3.15%、4.03%、4.65%和4.83%，VitC當(dāng)量為14.82、34.96、11.22和17.83 μg/mg；A因素為0，B因素為-1，C因素水平為-1和1及A因素為0，B因素為1，C因素為-1和1時，提取率分別為3.20%、3.72%、3.03%和4.06%，Vitc當(dāng)量分別為12.75、12.27、12.44和32.06 μg/mg；三因素均為0時，提取率分別為5.44%、5.50%、5.42%、5.47%和5.67%，VitC當(dāng)量分別為38.50、36.17、35.24、37.78和38.45 μg/mg；A因素水平為1，B因素水平為0、C因素水平為-1和1，及A因素水平為1，C因素水平為0，B因素水平為-1和1時，提取率分別為3.83%、4.75%、4.89%和4.41%，VitC當(dāng)量分別為36.42、29.95、11.82和29.87 μg/mg。

圖1 維生素C的普魯士藍法標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 超聲破碎法提取奶牛胎盤多肽正交試驗結(jié)果

2.3.1不同胰蛋白酶酶解條件對奶牛胎盤多肽提取率的影響

對表2進行以提取率(RE)為響應(yīng)值的響應(yīng)面回歸分析，所得二次回歸方程為：

RE=5.50+0.15A+0.026B+0.38C-0.8AB-0.075AC+0.13BC-0.18A2-0.54B2-1.46C2

式中：A、B、C分別為1.3.3所編碼的時間、底物濃度和酶底比。

方差分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)響應(yīng)面回歸模型極顯著(P<0.01)，失擬項不顯著(P>0.05)。模型R2與校正系數(shù)R2分別為98.85%與97.37%，即響應(yīng)值有98.85%可能性與各因素相關(guān)，模型描述性較好。其中一次項A、C和二次項B2、C2均極顯著影響響應(yīng)值(P<0.01)。各因素對提取率影響力(F值)為C>A>B(表3)。

表2 胰蛋白酶酶解法制備奶牛胎盤多肽響應(yīng)面試驗結(jié)果

注：A、B和C為時間、底物濃度和酶底比。下同。

Note:A,BandCrepresent time, substrate concentration and enzyme-substrate weight ratio.The same below.

表3 以提取率為響應(yīng)值的胰蛋白酶酶解奶牛胎盤的回歸模型方差分析結(jié)果

注：*和**表示該因素對模型有顯著和極顯著影響，下同。

Note: *and**indicate that the factor has a significant effect and extreme significant effect on the model， respectively.The same below.

酶解結(jié)果的響應(yīng)面曲線見圖2：隨酶解時間延長，提取率提升速度隨之變緩，這說明奶牛胎盤組織幾乎被完全酶解(圖2(a))；隨底物濃度上升，同一反應(yīng)時間的提取率隨酶底比上升先上升后下降(圖2(b))；酶底比隨酶底比上升，同一反應(yīng)時間的提取率先上升后下降，但高酶底比組響應(yīng)值仍高于低酶底比組，這表明酶解反應(yīng)在試驗區(qū)間內(nèi)某一值達到了飽和，并可能伴有胰蛋白酶的自身酶解現(xiàn)象(圖2(c))。

以最大化提取率為目標(biāo)，獲取胰蛋白酶酶解奶牛胎盤理論最佳條件為：反應(yīng)時間5.78 h，底物濃度30.21%，酶底質(zhì)量比3.24%，此時的理論提取率為5.55%。為驗證模型有效性，以優(yōu)化結(jié)果進行六次平行試驗，實際試驗條件為：反應(yīng)時間5.75 h，底物濃度30.00%，酶底比3.00%，實測平均提取率為5.48%，與理論值接近且重復(fù)性較好，說明響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果可靠。

2.3.2不同胰蛋白酶酶解條件對奶牛胎盤多肽還原力的影響

對表2進行以VitC當(dāng)量為響應(yīng)值的回歸分析，所得二次響應(yīng)面回歸方程為：

VitC當(dāng)量=37.23+3.65A+5.53B+4.09C+2.88AB-6.67AC+5.02BC-3.94A2-5.58B2-4.27C2

式中：A、B、C分別為1.3.3所編碼的時間、底物濃度和酶底比。

方差分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，響應(yīng)面回歸模型極顯著(P<0.01)，失擬項不顯著(P>0.05)。模型R2與校正系數(shù)R2分別為99.14%與98.04%，模型描述性較好。一次項A、B、C，交互項AB、BC、AC，二次項A2、B2、C2因素均極顯著影響響應(yīng)值(P<0.01)。各因素對VitC當(dāng)量影響力(F值)為B>C>A(表4)。

表4 以Vitc當(dāng)量為響應(yīng)值的胰蛋白酶酶解奶牛胎盤回歸模型方差分析結(jié)果

酶解結(jié)果的響應(yīng)面曲線見圖3，酶解過程中隨底物濃度提高，相同酶底比下響應(yīng)值隨時間先上升后下降(圖3(a))；隨酶底比提高，相同酶解時間情況下，響應(yīng)值呈現(xiàn)上升趨勢，且底物濃度越高，響應(yīng)值先上升后下降(圖3(b))；固定底物濃度時，酶底比與酶解時間的交互作用對響應(yīng)值呈極顯著負相關(guān)(P<0.01)(圖3(c))。

圖3 各因素交互作用對胰蛋白酶酶解奶牛胎盤還原能力的影響

以最大化還原力為目標(biāo)，獲取胰蛋白酶酶解奶牛胎盤理論最佳條件為：反應(yīng)時間5.13 h，底物濃度35.59%，酶底比4.19%，此時理論VitC當(dāng)量為39.32 μg/mg。為驗證模型有效性，以優(yōu)化結(jié)果進行6次平行試驗，實際試驗條件為：反應(yīng)時間5.20 h，底物濃度35.60%，酶底比4.20%，實測平均VitC當(dāng)量為39.67 μg/mg，與理論值接近且重復(fù)性較好，說明響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果可靠。

2.4 奶牛胎盤還原性活性多肽提取方法的優(yōu)化

2.4.1不同提取方法制備胎盤還原性多肽提取率與還原力的相關(guān)性分析

超聲破碎法和胰蛋白酶酶解法提取率與VitC當(dāng)量的相關(guān)性分別為0.785(P=0.012)和0.498(P=0.042)。表明超聲破碎法和胰蛋白酶酶解奶牛胎盤制備多肽過程中，VitC當(dāng)量和提取率均呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，因奶牛胎盤組織多肽還原力受酶解條件的影響極顯著(P<0.01)，為同時獲取較高提取率和還原力，需以綜合提取率對酶解條件進一步優(yōu)化。

2.4.2胰蛋白酶酶解奶牛胎盤制備還原性多肽的優(yōu)化

以綜合提取率(E)為響應(yīng)值，對胰蛋白酶酶解法制備胎盤還原性多肽條件進一步優(yōu)化。結(jié)果如下：在A因素水平為-1，B因素水平為0，C因素水平為-1和1，及A因素為-1，C因素為0，B因素為-1和1時，響應(yīng)值分別為466.83、1 272.54、521.73和861.19 μg/g，A因素為0，B因素為1，C因素為-1和1，及A因素為0，B因素為-1，C因素為-1和1時，響應(yīng)值分別為376.93、1 301.64、408.00和456.44 μg/g；三因素均為0時，響應(yīng)值分別為1457.65、1 910.01、2 066.57、2 094.40和2 180.11 μg/g；A因素為1，B因素為0，C因素為 -1 和1時，及C因素為0，B因素為-1和1時響應(yīng)值分別為1 394.89、1 317.27、578.00和1 612.63 μg/g。建立回歸模型，所得二次響應(yīng)面回歸方程為：

E=1 941.75+222.56A+273.53B+212.66C+173.79AB-220.83AC+219.06BC-285.62A2-762.75B2-543.25C2

式中：A、B和C分別為1.3.3所編碼的時間、底物濃度和酶底比。

方差分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，響應(yīng)面回歸模型極顯著(P<0.01)，失擬項不顯著(P>0.05)，模型R2為94.29%，校正系數(shù)R2為86.95%，模型描述性較好。模型的一次項A、B、C，二次項A2、B2、C2對奶牛胎盤酶解產(chǎn)物的綜合提取率影響極顯著(P<0.01)。各因素對提取率影響力(F值)為B>A>C(表5)。

固定酶底比情況下，高底物濃度時，響應(yīng)值隨酶解時間延長而上升(圖4(a))；固定酶解時間情況下，響應(yīng)值隨酶底比升高呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，且酶底比越高，底物濃度對響應(yīng)值的影響越大(圖4(b))；底物濃度固定情況下，酶解時間較短時，酶底比越低響應(yīng)值越低，隨酶解時間延長，低酶底比組響應(yīng)值上升，而高酶底比組響應(yīng)值先上升后下降，(圖4(c))。

以最大化綜合提取率為目標(biāo)，獲取胰蛋白酶酶解奶牛胎盤理論最佳條件為：反應(yīng)時間5.80 h，底物濃度34.96%(M底物∶M總)，酶底比3.33%(M酶∶M底物)，此時理論綜合提取率為2 037.92 μg/g。為驗證模型有效性，以優(yōu)化結(jié)果進行6次平行試驗，實際試驗條件為：反應(yīng)時間5.80 h，底物濃度35.00%，酶底比3.30%，實測平均VitC當(dāng)量為2 040.00 μg/g，與理論值接近且重復(fù)性較好，說明響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果可靠。

表5 以綜合提取率為響應(yīng)值的胰蛋白酶酶解胎盤試驗回歸模型方差分析結(jié)果

3 討 論

3.1 不同條件超聲破碎對奶牛胎盤組織還原性多肽制備的影響

超聲破碎法是通過超聲波激活液體中微小泡核，多次震蕩后高速崩潰，將其所聚集的能量以高溫、高壓、高速空化微射流形式釋放的方法[24]，已被廣泛用于提取生物活性分子(如可溶性多肽、多糖、酶、蛋白質(zhì)和脂肪等)。研究報道超聲破碎時間對提取率影響不顯著，而超聲破碎次數(shù)和破碎前溶劑浸泡時間對提取率影響更大[20,25]。然而，本試驗結(jié)果表明超聲破碎時間對提取率影響較大，可能由于本試驗在勻漿化后立即進行超聲破碎，即超聲破碎和溶劑浸提同時發(fā)生，導(dǎo)致超聲時間因素對提取效果的影響力更大。奶牛胎盤組織中成分復(fù)雜，可能被超聲波釋放的熱量破壞[26]，因此，本試驗為保證奶牛胎盤組織成分穩(wěn)定性，在冰浴條件下破碎，發(fā)現(xiàn)其最佳條件為底物濃度50.00%，功率1 800 W，破碎7.50 min，提取率為9.50 mg/g，VitC當(dāng)量為2.91 μg/mg，與張維等[25]的結(jié)果相近。過高超聲功率會導(dǎo)致樣品中部分分子化學(xué)鍵產(chǎn)生斷裂，易導(dǎo)致提取物生物活性改變[27]，而本試驗超聲破碎法最高收率條件與最高還原性條件一致，均為勻漿濃度50.00%、超聲功率1 800 W破碎7.50 min，且提取率與還原力呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。

3.2 不同胰蛋白酶酶解條件對奶牛胎盤組織還原性多肽制備的影響

胰蛋白酶是一種胃腸道消化酶，具有較強特異性，可切斷肽鏈中賴氨酸和精氨酸殘基羧基側(cè)。胰蛋白酶的高度特異性，常用于酶解制備多肽。多種動植物組織的胰蛋白酶酶解產(chǎn)物均表現(xiàn)出較強的抗氧化活性[28-30]。胰蛋白酶對組織蛋白的酶解過程中，水解度與抗氧化能力并非呈正相關(guān)[17,31]， 原因是天然蛋白質(zhì)分子量大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，在同一蛋白中可能存在多個酶切位點，隨酶解進行，大分子蛋白被水解為較小肽段，而肽段亦可能被進一步酶解，導(dǎo)致生物活性多肽失活[32]。因此，水解度一般只用于酶解程度監(jiān)測，不用于多肽活性評估。本試驗為綜合分析各因素對提取率和活性的影響，以響應(yīng)面分析法設(shè)計試驗[33]，采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，建立回歸模型分析各因素及其之間的交互作用對試驗結(jié)果的影響，并尋求最優(yōu)酶解條件。模型方差分析表明：酶解時間和酶底比對胰蛋白酶法制備胎盤多肽的提取率具有極顯著的影響(P<0.01)；各因素及其交互作用均對胰蛋白酶法制備胎盤多肽的還原力有極顯著影響(P<0.01)。響應(yīng)面模型顯示：以胰蛋白酶酶解奶牛胎盤制備還原性多肽在反應(yīng)時間5.78 h，底物濃度30.21%，酶底比3.24%時，可獲取最高理論提取率，為5.55%；在反應(yīng)時間5.13 h，底物濃度35.59%，酶底比4.19%時，可獲取最高理論VitC當(dāng)量，為39.32 μg/mg。本研究結(jié)果均遠高于超聲破碎法的最高提取率(0.95%)和最高VitC當(dāng)量(2.80 μg/mg)。本試驗提取率隨酶解時間上升趨勢逐漸減緩，表明酶解物中可溶性多肽隨酶解時間延長而增加，且設(shè)計時間內(nèi)底物酶解較完全，與鞠興榮等[30]對使用多種蛋白酶水解菜籽時水解曲線相符。與提取率不同，各因素及其交互作用對奶牛胎盤多肽還原力呈現(xiàn)復(fù)雜的影響，在反應(yīng)時間 5.13 h，底物濃度35.59%，酶底比4.19%時獲取最高理論VitC當(dāng)量(39.32 μg/mg)，且酶底比與酶解時間的交互作用對胎盤多肽還原能力呈現(xiàn)極顯著負相關(guān)(P<0.01)，表明酶解程度是影響胎盤多肽還原力的重要因素，與向澤敏等[17]和易余艷[31]的結(jié)果相符。

3.3 不同胰蛋白酶酶解條件對奶牛胎盤還原性多肽綜合提取率的影響

在酶解蛋白制備活性多肽過程中，酶解產(chǎn)物活性受溫度、pH、底物濃度、酶底比和酶解時間等眾多因素影響，往往呈現(xiàn)復(fù)雜的變化規(guī)律。由于奶牛胎盤組織中蛋白質(zhì)含量較高，且具有一定的不溶性蛋白，導(dǎo)致本試驗不僅是多底物反應(yīng)，且是固相-液相之間的酶解反應(yīng)，由固態(tài)蛋白酶解的可溶性肽段若具有酶切位點，則會進一步的被蛋白酶水解。在酶解進程中，不同蛋白與多肽對酶的親和度差異形成酶解體系中競爭關(guān)系，從而對酶解制備多肽的收率和還原力造成較大影響[34]。本試驗為通過胰蛋白酶酶解法獲取較高活性和提取率的奶牛胎盤多肽，以綜合提取率E(μg/g)為響應(yīng)值，基于Box-Behenken中心響應(yīng)法進行優(yōu)化，在反應(yīng)時間5.8 h，底物濃度34.98%，酶底比3.33%時，獲得最高理論綜合提取率(2 037.92 μg/g)，將其代入提取率與VitC當(dāng)量曲線，對應(yīng)值為5.52%和39.08 μg/mg，仍高于向澤敏等[17]對其他動物胎盤的酶解結(jié)果，表明以綜合提取率E評估酶解奶牛胎盤制備還原性多肽具有一定可靠性。響應(yīng)面顯示，酶解時間-酶底比、底物濃度-酶解時間和酶底比-底物濃度相互作用的F值分別為3.58、2.22和3.52，表明各因素相互作用對綜合提取率均有一定影響，且呈現(xiàn)較為復(fù)雜關(guān)系。此外，酶解實際條件較最佳理論條件差距越大，多肽生物學(xué)活性越低，而提取率則與各因素均呈正相關(guān)，這可能是本試驗中酶解時間與酶底比對綜合提取率影響較為復(fù)雜的原因。與胎盤多肽還原力不同，隨酶解時間和酶底比增加，其綜合提取率下降并不明顯，可能是由于胰蛋白酶酶切位點具有較強特異性，減少了還原性多肽進一步酶解的結(jié)果[35]。此外，本研究對胰蛋白酶酶解法優(yōu)化結(jié)果表明：較高底物濃度在酶底質(zhì)量比固定時會降低酶解產(chǎn)物對奶牛組織蛋白的競爭作用，從而提高綜合提取率；當(dāng)酶解時間固定的情況下，酶底比可對底物濃度和響應(yīng)值的相關(guān)性造成較大影響，說明較高酶底質(zhì)量比可加快酶解反應(yīng)速率，從而加速還原性多肽進一步酶解；在底物濃度固定的情況下，酶解時間較短時，綜合提取率隨酶底比降低，隨酶解時間延長，低酶底比下綜合提取率上升，而高酶底比組先上升后下降，說明酶底比決定酶解速率，進而影響相同時間內(nèi)胎盤多肽的提取率與還原力，對綜合提取率影響較大。

4 結(jié) 論

超聲破碎法和胰蛋白酶酶解法制備奶牛胎盤組織多肽的提取率和還原力均呈顯著正相關(guān)。超聲破碎法提取奶牛胎盤多肽最佳條件為50%底物濃度、超聲功率1 800 W，破碎時間7.5 min，此時的提取率為0.95%，VitC當(dāng)量為2.91 μg/mg；胰蛋白酶酶解法最高提取率的條件為反應(yīng)時間5.78 h，底物濃度30.21%，酶底比3.24%，此時的理論提取率為5.55%；最佳還原力的條件為5.13 h，底物濃度35.59%，酶底比4.19%，此時的理論VitC當(dāng)量為39.32 μg/mg；經(jīng)綜合提取率優(yōu)化后，獲取的最佳提取條件為反應(yīng)時間5.8 h，底物濃度34.98%，酶底比3.33%，此時的理論綜合提取率為2037.92 μg/g，將其代入提取率與VitC當(dāng)量曲線，對應(yīng)值為5.52%和56.35 μg/mg。