基于SSR標(biāo)記的燕山板栗種質(zhì)資源遺傳多樣性分析

張馨方 張樹(shù)航 李 穎 郭 燕 王廣鵬

(河北省農(nóng)林科學(xué)院 昌黎果樹(shù)研究所，河北 昌黎 066600)

板栗(CastaneamollissimaBL.)是我國(guó)的重要經(jīng)濟(jì)林樹(shù)種，廣泛分布在大江南北的24個(gè)省(自治區(qū)、直轄市)。中國(guó)北方的燕山區(qū)既是我國(guó)板栗的主要產(chǎn)區(qū)，又是世界上糖炒型板栗的最佳產(chǎn)區(qū)，該區(qū)域主要包括北京市的懷柔、密云區(qū)和河北省的遵化、遷安、遷西、興隆、青龍和寬城等縣(市)[1]，其出產(chǎn)的栗果在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上被統(tǒng)稱(chēng)為燕山板栗。得益于得天獨(dú)厚的地理?xiàng)l件和資源優(yōu)勢(shì)，燕山板栗以口味甘甜、肉質(zhì)細(xì)糯、品質(zhì)優(yōu)良以及適宜糖炒而享譽(yù)國(guó)際市場(chǎng)，是我國(guó)極少數(shù)具有出口優(yōu)勢(shì)的經(jīng)濟(jì)林產(chǎn)品。

經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的種子實(shí)生繁殖、自然和人工選擇，燕山區(qū)擁有極其豐富的板栗種質(zhì)資源，這些資源具有不同的變異類(lèi)型和獨(dú)特的農(nóng)藝性狀，其中更是蘊(yùn)含著許多有待進(jìn)一步發(fā)掘的優(yōu)異基因，是育種工作良好的資源材料，因此，對(duì)燕山種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性研究十分必要。目前，利用DNA分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)栗屬植物進(jìn)行遺傳多樣性的研究報(bào)道越來(lái)越多，周連第等[2]采用AFLP技術(shù)對(duì)86個(gè)板栗品種進(jìn)行遺傳多樣性研究，證明了以AFLP-熒光法分析板栗品種資源分子水平遺傳多樣性是可行的方法。向暉等[3]和龔榜初等[4]分別采用SRAP和ISSR分子標(biāo)記對(duì)我國(guó)錐栗自然居群進(jìn)行了遺傳多樣性分析，并提出了湘西地區(qū)可能是錐栗的次生分布中心和現(xiàn)代遺傳多樣性分布中心。項(xiàng)艷等[5]利用RAPD分子標(biāo)記手段對(duì)14個(gè)安徽省板栗品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，建立了板栗品種的分子檢索表，并提出了重點(diǎn)保存品種。艾呈祥等[6]利用SSR引物對(duì)26份山東省主栽板栗品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，探討了魯中南地區(qū)和泰沂山區(qū)不同板栗品種的起源問(wèn)題。以往的研究，或選用燕山板栗材料數(shù)量有限，或取樣范圍沒(méi)有涵蓋燕山板栗的主產(chǎn)區(qū)，整體而言前人對(duì)燕山板栗分子水平上的遺傳多樣性研究相對(duì)較粗淺。SSR分子標(biāo)記技術(shù)早被證實(shí)具有共顯性遺傳、操作便捷和結(jié)果穩(wěn)定而準(zhǔn)確等優(yōu)良特點(diǎn)，是遺傳多樣性分析的重要工具?；谌毡纠鹾蜌W洲栗[7-10]遺傳多樣性評(píng)價(jià)開(kāi)發(fā)的SSR引物在國(guó)外早有報(bào)道，這批引物在中國(guó)板栗、茅栗、錐栗也獲得了良好的擴(kuò)增效果[11]，說(shuō)明它們?cè)诶鯇僦参镩g具有較高通用性。本研究擬通過(guò)篩選多態(tài)性較好的SSR引物，對(duì)燕山地區(qū)7個(gè)縣域群體以及1個(gè)外來(lái)群體共151份板栗種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，并構(gòu)建聚類(lèi)樹(shù)狀圖和主坐標(biāo)分析圖，以期為燕山板栗種質(zhì)資源的遺傳背景明晰和以遺傳距離為參考的親本選擇利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用151份板栗種質(zhì)資源(均是由實(shí)生大樹(shù)選育的地方種系)來(lái)自燕山地區(qū)的7個(gè)不同縣域群體，包括青龍縣(25份)、遵化市(17份)、昌黎縣(14份)、遷西縣(29份)、寬城縣(23份)、興隆縣(26份)和懷柔區(qū)(8份)，以及1個(gè)太行山區(qū)的邢臺(tái)板栗資源9份，全部定植于河北省農(nóng)林科學(xué)院昌黎果樹(shù)研究所板栗種質(zhì)資源圃。2018年5—6月，選取板栗新鮮健康嫩葉，放于裝有硅膠的自封袋中干燥，在室溫下保存?zhèn)溆谩９┰嚥牧霞霸a(chǎn)地位置信息見(jiàn)表1 和表2。

1.2 基因組DNA的提取

采用改良的CTAB法[12]提取板栗葉片基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳及微量分光光度計(jì)進(jìn)行DNA質(zhì)量和濃度檢測(cè)，合格的DNA樣品放置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SSR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件

PCR反應(yīng)體系20 μL，包括雙蒸水13.35 μL，10×Buffer 2.0 μL，MgCl22.0 μL(25 mmol/L)，dNTP 1.2 μL(濃度2.5 mmol/L)，TaqDNA聚合酶0.2 μL(濃度5 units/μL)，引物0.25 μL(20 μmol/L)，DNA模板30 ng。擴(kuò)增條件如下：94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s；55 ℃(因引物不同而定)退火50 s；72 ℃延伸50 s，循環(huán)30次；后72 ℃延伸7 min。

1.4 SSR引物篩選及產(chǎn)物檢測(cè)

為了得到清晰的SSR指紋圖譜，從220對(duì)引物中篩選出條帶清晰、多態(tài)性較好的21對(duì)引物用于全部樣品分析，220對(duì)引物來(lái)源主要包括板栗及薔薇科模式植物已公開(kāi)發(fā)表的SSR引物序列，供試引物具體信息見(jiàn)表3[13-19]。

表1 供試板栗材料

表1(續(xù))

注：①④屬河北省秦皇島市；②③屬河北??；⑤屬河北省唐山市；⑥⑦屬河北省承德市；⑧屬北京市。

Note: ①④ belongs to Qinhuangdao, Hebei.② and ③ belong to Hebei Province.⑤ belongs to Tangshan, Hebei.⑥ and ⑦ belong to Chengde, Heibei.⑧ belongs to Beijing.

表2 供試材料原產(chǎn)地位置信息

表3 篩選出的21對(duì)SSR引物

擴(kuò)增產(chǎn)物用6%聚丙烯酰胺凝膠分離，在90 W恒功率下電泳40～50 min，銀染法[20]染色，待出現(xiàn)清晰條帶后置于燈箱上拍照。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

以0、1統(tǒng)計(jì)SSR擴(kuò)增帶型，并建立由“0、1”組成的原始數(shù)據(jù)矩陣。在相同遷移位置上，有條帶記為“1”，無(wú)帶記為“0”，構(gòu)建二元數(shù)據(jù)矩陣。使用POPGENE Version 1.32軟件計(jì)算觀(guān)測(cè)等位基因數(shù)目(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)、Shannon’s信息指數(shù)(I)、多態(tài)位點(diǎn)數(shù)目(Np)和多態(tài)位點(diǎn)百分率(PPB)，基因流(Nm)和遺傳一致度等參數(shù)。通過(guò)軟件PIC-CALC計(jì)算引物多態(tài)性信息含量(PIC, polymorphism information content)。根據(jù)遺傳一致度，利用NTSYS Version 2.10軟件中的SAHN模塊和UPGMA方法進(jìn)行聚類(lèi)分析，使用EIGEN模塊進(jìn)行主坐標(biāo)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR分子標(biāo)記遺傳多樣性

采用SSR標(biāo)記對(duì)8個(gè)群體151份板栗資源遺傳多樣性進(jìn)行分析。21對(duì)SSR引物共檢測(cè)到71個(gè)等位基因，其中全部為多態(tài)性等位基因，多態(tài)率達(dá)100%，每對(duì)引物獲得的等位基因數(shù)目為2～6，平均3.38個(gè)，擴(kuò)增產(chǎn)物大小在100～300 bp。SSR引物的多態(tài)性信息含量(PIC)變幅為0.614 5～0.972 3，平均為0.866 8。部分?jǐn)U增產(chǎn)物的電泳掃描照片見(jiàn)圖1。

圖1 引物KT009擴(kuò)增結(jié)果

2.2 不同板栗群體間遺傳多樣性比較

計(jì)算8個(gè)板栗群體各遺傳多樣性參數(shù)(表4)。其中，各群體資源份數(shù)為8～29份不等，遷西群體包含資源份數(shù)最多，但各項(xiàng)遺傳多樣性參數(shù)均不是最高，而懷柔群體資源量最小，Nei’s多樣性指數(shù)H=0.309 9，Shannon’s信息指數(shù)I=0.468 0均最大，從分子水平證明了資源份數(shù)多，遺傳多樣性不一定最大的論斷[21]。多態(tài)位點(diǎn)數(shù)和多態(tài)位點(diǎn)百分率是反映遺傳多態(tài)性的重要指標(biāo)，遵化群體多態(tài)位點(diǎn)數(shù)目(Np=69)、多態(tài)位點(diǎn)百分率(PPB=97.18%)及觀(guān)測(cè)等位基因數(shù)(Na=1.971 8)、有效等位基因數(shù)(Ne=1.521 9)均最大，邢臺(tái)群體多態(tài)位點(diǎn)數(shù)目(Np=61)、多態(tài)位點(diǎn)百分率(PPB=85.92%)及觀(guān)測(cè)等位基因數(shù)(Na=1.859 2)、有效等位基因數(shù)(Ne=1.456 3)最小。其中，有7個(gè)群體多態(tài)性位點(diǎn)百分率>90%，說(shuō)明調(diào)查各群體的遺傳多態(tài)性普遍較高。有效等位基因數(shù)Ne是反映群體遺傳變異大小的一個(gè)指標(biāo)，與等位基因的頻率有關(guān)，與觀(guān)測(cè)等位基因數(shù)Na相比，青龍和興隆群體的有效等位基因數(shù)較小，說(shuō)明青龍和興隆板栗資源具有的極端頻率的等位基因相對(duì)較多；而懷柔和邢臺(tái)群體的有效等位基因數(shù)Ne更接近觀(guān)測(cè)等位基因數(shù)Na，表明等位基因在這些群體中分布較均勻。Nei’s 多樣性指數(shù)和 Shannon’s 信息指數(shù)都是反映群體遺傳多樣性水平的重要參數(shù)，8個(gè)群體中懷柔和遵化板栗群體遺傳多樣性水平高，而邢臺(tái)群體遺傳多樣性水平相對(duì)較低；供試板栗資源總的 Nei’s 多樣性指數(shù)H=0.302 9，Shannon’s 信息指數(shù)I=0.465 5，說(shuō)明燕山板栗種質(zhì)資源遺傳多樣性水平普遍較高。其中懷柔區(qū)和遵化市是燕山板栗資源遺傳多樣性最豐富的地區(qū)。

表4 21對(duì)SSR引物在8個(gè)板栗群體中檢測(cè)到的遺傳多樣性參數(shù)

2.3 板栗群體遺傳分化

供試板栗群體總遺傳多樣性Ht=0.306 2，群體內(nèi)遺傳多樣性Hs=0.291 2，群體間遺傳分化系數(shù)Gst=0.049 0，即群體間的遺傳變異占總變異的4.90%，群體內(nèi)的遺傳變異占總變異的95.10%，表明板栗資源群體內(nèi)遺傳分化大于群體間分化。由于自然或人工選擇、隨機(jī)漂變等原因，板栗群體會(huì)出現(xiàn)遺傳分化，并且板栗雌雄同株、風(fēng)媒異花授粉的植物學(xué)特性，使得其遺傳變異的大多數(shù)來(lái)自居群內(nèi)部。板栗群體基因流Nm=9.696 4，說(shuō)明8個(gè)群體間存在豐富的基因交流，防止了因遺傳漂變而引起的群體間的遺傳分化。

2.4 聚類(lèi)分析

8個(gè)群體間的遺傳一致度和遺傳距離如表5。遺傳一致度和遺傳距離分別是從相同和相反方面度量群體間遺傳關(guān)系的指標(biāo)。由表5可以看出，各群體間遺傳一致度的變化范圍為0.959 0(懷柔與邢臺(tái)群體)～0.987 9(寬城與遷西群體)，燕山產(chǎn)區(qū)內(nèi)各群體間的遺傳一致度普遍較高，可能與地區(qū)之間相互引種有關(guān)。遺傳距離反映居群間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，遺傳距離越小，在一定程度上表明二者親緣關(guān)系越近。由表可知，遷西和寬城群體之間的遺傳距離最小(為0.012 2)，與興隆種群之間的遺傳距離次之(為0.014 9)，寬城和興隆之間遺傳距離也很小(為0.016 6)，說(shuō)明遷西、寬城和興隆群體之間的遺傳相似性更趨于一致。邢臺(tái)和懷柔、邢臺(tái)和興隆群體之間的遺傳距離相對(duì)較大(分別為0.041 9和0.041 0)，表明它們之間的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。

表5 8個(gè)群體間的遺傳一致度和遺傳距離

注：右上三角為遺傳一致度，左下三角為遺傳距離。

Note: Nei’s genetic identity (the upper right triplet) and genetic distance (the lower left triplet).

根據(jù)遺傳一致度利用NTSYS(2.10)軟件進(jìn)行聚類(lèi)(圖2)。8個(gè)群體間分子遺傳相似系數(shù)為0.967～0.988，群體的整體相似系數(shù)高，說(shuō)明遺傳距離較近。如圖2，在遺傳相似系數(shù)0.977處，可將8個(gè)群體分為3個(gè)組。其中，第1組包括青龍、遷西、寬城、興隆、遵化和懷柔群體，而昌黎和邢臺(tái)群體各為一組。在第1組中，遷西、寬城、興隆群體遺傳距離更近，它們?cè)诘乩砦恢蒙蟽蓛上噜?，此外，河北省承德市寬城縣與秦皇島市青龍縣相鄰，唐山市遷西縣、承德市興隆縣都與遵化市相鄰，它們位于燕山山脈附近，相似的氣候條件和地理環(huán)境使這些群體的遺傳組成趨于一致，遺傳距離更近。第2組包括昌黎群體，位于燕山山脈東南方向沿海地區(qū)，與第1組遺傳距離較遠(yuǎn)。第3組邢臺(tái)群體位于太行山脈，地理位置和氣候環(huán)境與其他兩組的群體都不同，所以遺傳距離更遠(yuǎn)，在聚類(lèi)上也單獨(dú)一組。

青龍、遷西、寬城、興隆、遵化、懷柔、昌黎、邢臺(tái)指來(lái)自這些地方的板栗資源組成的群體。

2.5 主坐標(biāo)分析

根據(jù)遺傳一致度，作主坐標(biāo)分析圖(圖3)。從圖3中可以看出8個(gè)群體可以分成3個(gè)部分，其中，興隆、遷西、寬城3個(gè)群體距離較近，懷柔與興隆、遵化與遷西、青龍與遷西群體位置靠近，共同組成第1部分。第2部分包括位置稍遠(yuǎn)的昌黎群體，更遠(yuǎn)的邢臺(tái)群體單獨(dú)組成第3部分。可見(jiàn)，主坐標(biāo)分析圖與聚類(lèi)圖的大體趨勢(shì)是相一致的。

圖3 8個(gè)板栗群體的主坐標(biāo)分析三維圖

2 討 論

我國(guó)板栗具有較高的遺傳多樣性水平，已被諸多研究證實(shí)[22-23]。王同坤等[24-25]對(duì)36份燕山板栗種質(zhì)資源和8份外來(lái)品種進(jìn)行了AFLP和RAPD分析，結(jié)果表明所檢測(cè)材料中存在著明顯的遺傳多樣性。本研究得到8個(gè)板栗群體的有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s 多樣性指數(shù)(H)、Shannon’s 信息指數(shù)(I)分別為1.498 6、0.302 9、0.465 5，表明燕山板栗在居群水平上存在豐富的遺傳變異度和較高的遺傳多樣性水平，這可能與板栗異花授粉的生物學(xué)特性有關(guān)[26]。本研究統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，燕山板栗群體間基因流Nm為9.696 4，表明群體間存在頻繁的基因交流，群體遺傳多樣性豐富，并且種級(jí)水平上有95.10%的遺傳變異存在于群體內(nèi)部。有文獻(xiàn)報(bào)道，異交植物的遺傳多樣性水平比自交(近交)植物更高[27]；并且當(dāng)基因流Nm值>1時(shí)，基因流可以抵制住遺傳漂變的影響，防止發(fā)生遺傳分化[28-29]。板栗具有風(fēng)媒、蟲(chóng)媒的異交授粉特性，以及人為引種或鳥(niǎo)類(lèi)遷徙過(guò)程中都可能攜帶種子，減少了地理隔離的影響，使得頻繁的基因交流成為可能[3]。

本研究采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)151份種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，共擴(kuò)增出71個(gè)SSR位點(diǎn)，多態(tài)性位點(diǎn)百分率為100%，高于王同坤等[24-25]對(duì)燕山板栗AFLP分析得到的56.5%多態(tài)率和RAPD分析得到的62.9%，造成差異的原因可能有三方面：一是本研究中8個(gè)不同群體的151份資源均是來(lái)自于燕山各產(chǎn)區(qū)由單株實(shí)生大樹(shù)選育而來(lái)的地方農(nóng)家品種、審定品種以及具有特殊性狀或潛在價(jià)值的實(shí)生樹(shù)材料，本身來(lái)源范圍廣闊、遺傳多樣性豐富；二是采用人工讀取條帶的方法進(jìn)行條帶統(tǒng)計(jì)，結(jié)果較機(jī)讀更為準(zhǔn)確；三是不同的分子標(biāo)記手段產(chǎn)生的不同試驗(yàn)結(jié)果。目前，SSR技術(shù)已廣泛應(yīng)于蘋(píng)果、梨、桃、葡萄、杏、柑橘和櫻桃等果樹(shù)的品種鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建及遺傳多樣性研究中[30-36]。房守敏等[37]通過(guò)對(duì)家蠶RAPD、AFLP和SSR標(biāo)記的比較分析，認(rèn)為SSR分子標(biāo)記由幾個(gè)堿基對(duì)組成核苷酸重復(fù)序列，通過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄區(qū)的序列變異，進(jìn)一步反映功能上的多樣性，能真實(shí)說(shuō)明種質(zhì)之間的遺傳多樣性，更適用于種質(zhì)資源的遺傳多樣性評(píng)價(jià)。本研究結(jié)果也表明SSR比AFLP和RAPD的信息含量高，更適合用于板栗種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析。

在本研究所分析的8個(gè)板栗群體中，遺傳距離為0.012 2～0.041 9，遺傳距離較小，遺傳相似系數(shù)高，說(shuō)明群體間的親緣關(guān)系較近。供試的8個(gè)群體位于我國(guó)臨近的燕山山脈和太行山山脈周邊，所在地理位置相接，相似的自然環(huán)境和栽培條件以及頻繁的品種交流，都會(huì)使這些地區(qū)的群體在遺傳組成上大體趨于一致；此外，長(zhǎng)期的人工干預(yù)選擇，也會(huì)使燕山板栗的遺傳基礎(chǔ)趨于單一[24]。聚類(lèi)圖和主坐標(biāo)分析圖顯示8個(gè)板栗群體被分成三類(lèi)，燕山板栗主產(chǎn)區(qū)青龍、遷西、寬城、興隆、遵化和懷柔群體劃為1類(lèi)，而處于燕山區(qū)的昌黎群體和處于太行山區(qū)邢臺(tái)群體各為1類(lèi)，其原因可能是河北省秦皇島市昌黎縣雖處于燕山山脈，但其位于燕山山脈東南方向沿海地區(qū)，氣候類(lèi)型和環(huán)境條件與燕山山脈北部燕山板栗主產(chǎn)區(qū)縣市有明顯差異，導(dǎo)致該群體資源在長(zhǎng)期的環(huán)境適應(yīng)和進(jìn)化過(guò)程中形成了適應(yīng)當(dāng)?shù)丨h(huán)境的一些基因性狀；而邢臺(tái)群體位于太行山山脈一帶，與供試燕山板栗群體在地理位置上有明顯距離，空間距離上的阻隔是造成這一群體和燕山板栗群體具有明顯遺傳上的差異的主要原因。