乳酸鏈球菌肽的應(yīng)用及研究進(jìn)展

張陽(yáng)玲，吳昊，喬建軍，李艷妮

1(天津大學(xué) 化工學(xué)院，天津，300072)2(系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津，300072) 3(天津化學(xué)化工協(xié)同創(chuàng)新中心合成生物學(xué)平臺(tái)，天津，300072)

乳酸鏈球菌肽(Nisin)是由乳酸鏈球菌產(chǎn)生的一種小分子抗菌肽[1]，具有廣譜抑菌作用，對(duì)致病性病原體如李斯特菌、金黃色葡萄球菌、芽孢桿菌等革蘭氏陽(yáng)性菌有抗菌活性。微生物引起的食品腐敗變質(zhì)造成大量食物浪費(fèi)問(wèn)題，防腐劑可以減緩食品腐敗變質(zhì)，延長(zhǎng)產(chǎn)品保質(zhì)期。然而大多數(shù)消費(fèi)者考慮到化學(xué)合成食品防腐劑的安全性問(wèn)題，對(duì)天然食品防腐劑的關(guān)注越來(lái)越多。Nisin具有抑菌效果好、熱穩(wěn)定性好及安全無(wú)毒等優(yōu)點(diǎn)，可用于食品防腐保鮮，既可確保食品質(zhì)量及安全性，又能滿足消費(fèi)者對(duì)天然健康食品的需求，而且不改變最終產(chǎn)品的感官特性。1969年，Nisin被世界衛(wèi)生組織(WHO)批準(zhǔn)用作食品防腐劑，并于1988年被美國(guó)食品藥品管理局(FDA)列入GRAS(一般認(rèn)為安全)名單，批準(zhǔn)用于食品防腐劑[2]。

Nisin作為一種國(guó)際公認(rèn)的安全無(wú)毒的天然防腐劑，已被商業(yè)化廣泛應(yīng)用[3]。但Nisin對(duì)革蘭氏陰性菌、酵母及霉菌抑制作用較弱，2種或更多種抗菌劑組合使用可增強(qiáng)其對(duì)病原體的抗菌作用，拓展抗菌譜，同時(shí)可降低各種抗菌劑的濃度[4]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究人員對(duì)Nisin與一種或多種抗菌劑組合使用開(kāi)展了廣泛研究。2019年，MARA等[3]研究發(fā)現(xiàn),Nisin和有機(jī)酸鹽聯(lián)用具有協(xié)同抗菌作用，可顯著提高對(duì)硬質(zhì)奶酪中李斯特菌的抗菌能力。楊雯舸等[5]制備了含有Nisin和植物乳桿菌素的復(fù)合抗菌薄膜，與只含有Nisin的抗菌薄膜相比，其對(duì)冷鮮豬肉的保鮮作用至少延長(zhǎng)了4 d。

雖然像Nisin這樣的細(xì)菌素幾十年來(lái)一直用做食品防腐劑，但近些年來(lái)研究人員開(kāi)始關(guān)注其醫(yī)藥價(jià)值。鑒于抗生素耐藥性問(wèn)題的日益嚴(yán)重，因此迫切需要新的策略來(lái)阻止耐藥菌株的進(jìn)一步蔓延。已有報(bào)道Nisin可以抑制耐藥菌株如耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌及耐萬(wàn)古霉素的艱難梭菌、腸球菌等的生長(zhǎng)[6-7]，因此，Nisin可以作為已有抗生素的有前途的替代品。另外，癌癥的傳統(tǒng)化學(xué)治療方法對(duì)正常身體細(xì)胞具有非特異性毒性，引發(fā)一系列毒副作用，并且癌細(xì)胞在治療過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)化療耐藥性，因此迫切需要開(kāi)發(fā)具有低毒副作用的替代抗癌策略。使用Nisin來(lái)治療癌癥是一種很有前途的新方法，2019年，PRINCE等[8]研究發(fā)現(xiàn),Nisin可在不同癌細(xì)胞系中選擇性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并減少細(xì)胞增殖;還可以與傳統(tǒng)化療藥物聯(lián)合使用，獲得更好治療效果的同時(shí)可減小傳統(tǒng)化療藥物的副作用及耐藥性[9]。此外，Nisin也具有治療腹瀉、口腔保健和免疫調(diào)節(jié)等方面的潛力。本文對(duì)Nisin的生物合成、抑菌機(jī)制及其應(yīng)用進(jìn)行了總結(jié)，詳細(xì)介紹了它在食品和生物醫(yī)藥等方面的應(yīng)用，并對(duì)其未來(lái)的研究方向進(jìn)行了展望。

1 Nisin結(jié)構(gòu)及生物合成過(guò)程

1971年，GROSS和MORELL[10]報(bào)道了Nisin的分子結(jié)構(gòu)，分子式為C143H228N42O37S7。分子質(zhì)量為3 500 Da，常常形成二聚體或四聚體結(jié)構(gòu)，分子質(zhì)量分別為7 000 Da和14 000 Da。成熟的Nisin由34個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，分子結(jié)構(gòu)中含有羊毛硫氨酸(lanthionine，Ala-S-Ala)、β-甲基羊毛硫氨酸(β-methyllanthionine，Abu-S-Ala)、脫氫丙氨酸(dehydroalanine，Dha)和脫氫丁氨酸(dehydrobutyrine，Dhb)等稀有氨基酸，它們通過(guò)硫醚鍵連接成五環(huán)結(jié)構(gòu)。目前，已經(jīng)報(bào)道的天然Nisin有NisinA，NisinZ，NisinF，NisinQ，NisinH，NisinP，NisinU，NisinU2等8種變體(圖1)。NisinA和NisinZ的研究最為廣泛，二者區(qū)別在于結(jié)構(gòu)中第27位氨基酸不同，NisinA為組氨酸，NisinZ為天冬氨酸[11]。這種結(jié)構(gòu)不同導(dǎo)致2種Nisin的熱穩(wěn)定性，抗pH能力，對(duì)蛋白水解酶的敏感性和抗菌作用譜有所不同。Nisin的溶解度和穩(wěn)定性與溶液pH值有關(guān)，相同條件下，NisinZ的溶解性高于NisinA，而抗菌性幾乎無(wú)差別。

圖1 乳酸鏈球菌肽的8種變體結(jié)構(gòu)[11]

NisinA由nisABTCIPRKFEG基因簇編碼產(chǎn)生，其中，結(jié)構(gòu)基因nisA編碼Nisin前體，該前體通過(guò)核糖體翻譯合成后經(jīng)過(guò)一系列的修飾才能形成成熟且有活性的Nisin分子。Nisin前體中的絲氨酸和蘇氨酸在脫水酶NisB的催化下脫水生成Dha和Dhb殘基[12]。隨后產(chǎn)生的脫氫殘基在環(huán)化酶NisC的催化下與半胱氨酸偶聯(lián)，形成甲基羊毛硫氨酸環(huán)。完全修飾的Nisin前體在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NisT的作用下可以跨膜運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外，最后在體外需要蛋白酶NisP對(duì)Nisin前體進(jìn)行前導(dǎo)肽的切割才能形成成熟且有活性的抗菌肽[13]。雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)NisRK調(diào)控Nisin的生物合成。當(dāng)細(xì)胞外出現(xiàn)成熟的Nisin分子時(shí)，它會(huì)與組氨酸激酶NisK結(jié)合，引發(fā)NisK上的組氨酸磷酸化，隨后通過(guò)特定信號(hào)傳輸通道將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至轉(zhuǎn)錄激活因子NisR上，NisR磷酸化后結(jié)合到nisABTCIPRK和nisFEG的啟動(dòng)子區(qū)，激活相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控(圖2)。

由于Nisin具有強(qiáng)烈的抑菌性，特定的自我保護(hù)機(jī)制是必不可少的。脂蛋白NisI和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NisFEG是Nisin生產(chǎn)菌株的免疫系統(tǒng)，2者協(xié)同表達(dá)保護(hù)菌株免受其對(duì)自身的攻擊。脂蛋白NisI位于細(xì)胞質(zhì)膜的外部，會(huì)在細(xì)胞質(zhì)膜表面直接結(jié)合Nisin，防止其與脂質(zhì)體Ⅱ分子結(jié)合在細(xì)胞膜上形成小孔[14]，保護(hù)自身免受Nisin的損害。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NisFEG能夠把入侵細(xì)胞膜的Nisin分子排出到細(xì)胞外，減少已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞膜的數(shù)量[13]，從而防止了Nisin分子局部濃度過(guò)高形成孔洞。

圖2 乳酸鏈球菌肽生物合成示意圖[14]

2 Nisin抑菌性及抑菌機(jī)制

Nisin具有廣譜抑菌作用，在納摩爾濃度下對(duì)食源致病性病原體如李斯特菌、金黃色葡萄球菌、芽孢桿菌等革蘭氏陽(yáng)性菌有抗菌活性，由于革蘭氏陰性菌具有外膜屏障，因此對(duì)其沒(méi)有顯著抑菌活性。研究發(fā)現(xiàn)，Nisin與破壞外膜穩(wěn)定性的方法[乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)]、高壓或熱處理或冷凍)聯(lián)合使用時(shí)可以抑制一些革蘭氏陰性菌[15]。

MATARACI等[7]研究發(fā)現(xiàn)，Nisin與抗生素聯(lián)合使用24 h內(nèi)均表現(xiàn)出對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生物膜形成的顯著抑制活性，其聯(lián)合使用產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，抗生物膜活性顯著提高，可預(yù)防或延遲抗生素耐藥性的出現(xiàn)。金屬螯合劑可以螯合微量過(guò)渡金屬并控制模型系統(tǒng)中的氧化降解，還可以增強(qiáng)抗菌劑的功效[16]。研究發(fā)現(xiàn)食品級(jí)螯合劑(如EDTA,六偏磷酸鈉)可以克服細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)的膜滲透屏障，使大腸桿菌、腸道沙門(mén)氏菌等革蘭氏陰性菌對(duì)乳鏈菌肽的敏感度增加[15,17]。

Nisin抑菌作用機(jī)制主要是在細(xì)胞膜中形成孔道，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)小分子物質(zhì)(例如三磷酸腺苷、氨基酸、核苷酸和離子等)快速流出，細(xì)胞質(zhì)膜的離子梯度和質(zhì)子動(dòng)力被破壞，細(xì)胞的生物合成過(guò)程受阻，導(dǎo)致細(xì)胞裂解死亡[18]。主要有以下2種模式，第一種是“楔形”模型(見(jiàn)圖3-a)，Nisin與細(xì)胞膜相互作用緊密結(jié)合，其C端與脂質(zhì)的靜電吸引力使Nisin慢慢插入到脂質(zhì)雙分子層，在膜上形成孔道復(fù)合物[19]。微摩爾濃度Nisin即可形成這種孔道模型；另一種是Nisin的N端雙環(huán)系統(tǒng)能夠與細(xì)胞壁的合成前體脂質(zhì)Ⅱ相結(jié)合[20](見(jiàn)圖3-b)，在納摩爾濃度下具有活性主要是因?yàn)镹isin將脂質(zhì)Ⅱ作為后續(xù)孔形成的對(duì)接分子，阻止前體參與聚合肽聚糖中，破壞細(xì)胞壁的合成并形成高度特異性的孔。該孔道比第一種模式形成的孔孔徑更大且更穩(wěn)定。

a- Nisin與細(xì)胞膜脂質(zhì)相互作用形成孔道b- Nisin與脂質(zhì)Ⅱ相互作用形成孔道

3 提高Nisin產(chǎn)量的技術(shù)研究

Nisin作為一種安全無(wú)毒的天然防腐劑，需求量持續(xù)增長(zhǎng)，但仍有許多因素限制其廣泛應(yīng)用?，F(xiàn)階段Nisin主要通過(guò)微生物發(fā)酵生產(chǎn)，尚存在發(fā)酵活力低、產(chǎn)量較低及生產(chǎn)成本高等問(wèn)題。目前，研究人員主要通過(guò)改造工程菌株和優(yōu)化發(fā)酵系統(tǒng)等方法提高Nisin產(chǎn)量。

在利用基因工程技術(shù)構(gòu)建高產(chǎn)菌株方面，研究發(fā)現(xiàn)在乳酸乳球菌LS01中共過(guò)表達(dá)某些參與Nisin生物合成的多拷貝基因(nisA，nisRK和nisFEG)，可顯著提高Nisin產(chǎn)量[21]。發(fā)酵液中乳酸的積累會(huì)抑制菌株生長(zhǎng)，抑制Nisin產(chǎn)量，因此提高菌株的耐受性對(duì)提高其產(chǎn)量有促進(jìn)作用。本課題組張健等[22]將17個(gè)耐酸基因在乳酸乳球菌F44中異源表達(dá)或過(guò)表達(dá)。其中，過(guò)表達(dá)hdeAB、ldh和murG基因的工程菌株在發(fā)酵過(guò)程中，菌株的耐酸能力顯著提高，細(xì)胞內(nèi)pH值更穩(wěn)定且可有效提高Nisin產(chǎn)量。同時(shí)，利用轉(zhuǎn)錄因子和非編碼小RNA分別從轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后修飾水平提高菌株耐酸能力，可間接提高菌株的Nisin產(chǎn)量[23-24]。

同時(shí)，研究人員對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了改造，并基于培養(yǎng)基設(shè)計(jì)改造工程菌株。劉家亨等人選擇農(nóng)業(yè)廢棄物脫脂米糠作為培養(yǎng)基碳源，利用脫脂米糠水解液作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源和部分氮源，通過(guò)強(qiáng)化木糖轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的表達(dá)及馴化培養(yǎng)，得到可有效利用木糖以及米糠中葡萄糖木糖混合碳源的乳酸乳球菌[25]。同時(shí)，以豆粕酶解液為唯一氮源進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化，得到適合培養(yǎng)乳酸乳球菌的豆粕培養(yǎng)基，通過(guò)協(xié)同表達(dá)蛋白水解酶、多肽水解酶和多肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，強(qiáng)化了乳酸乳球菌的蛋白利用能力，進(jìn)一步提高了菌體對(duì)氮源的利用率[26]。

此外，對(duì)Nisin發(fā)酵分離方法進(jìn)行了優(yōu)化，以更有效地解除Nisin的反饋抑制。如GAO等[27]設(shè)計(jì)利用κ-角叉菜膠和絲瓜海綿載體來(lái)固定乳酸乳球菌懸浮液，連續(xù)發(fā)酵耦合泡沫分離技術(shù)與固定化細(xì)胞相結(jié)合生產(chǎn)Nisin，與常規(guī)分批發(fā)酵相比，Nisin產(chǎn)量增加了66.1%。

4 Nisin在食品工業(yè)中的應(yīng)用

Nisin具有較好的抑菌防腐性能，安全無(wú)毒，目前被廣泛應(yīng)用于肉制品、乳制品和酒精飲料的防腐保鮮中。

4.1 在肉制品中的應(yīng)用

肉制品保藏中常添加硝酸鹽或亞硝酸鹽來(lái)抑制肉毒梭狀芽胞桿菌的生長(zhǎng)，而亞硝酸鹽在肉制品中與二級(jí)胺結(jié)合會(huì)產(chǎn)生有致癌性的亞硝胺。在肉制品中添加安全無(wú)毒的防腐劑如Nisin可以降低亞硝酸鹽的添加量。研究發(fā)現(xiàn)在新鮮的瘦牛肉里添加Nisin可有效抑制單核細(xì)胞增生李斯特菌及芽胞桿菌等的生長(zhǎng)[28]，延長(zhǎng)肉制品的貯存期。

近年來(lái)，研究者重點(diǎn)開(kāi)發(fā)了Nisin與其他制劑聯(lián)合使用的策略。研究發(fā)現(xiàn)螯合劑EDTA可有效控制氧化引起的腐敗反應(yīng)，Nisin與EDTA聯(lián)合使用有助于肉制品的保存，防止食品腐敗[17-18]。此外，納米材料也應(yīng)用于Nisin抗菌劑的開(kāi)發(fā)。研究發(fā)現(xiàn)負(fù)載Nisin的殼聚糖-單甲基富馬酸納米顆?？捎行б种迫饽┲薪瘘S色葡萄球菌和李斯特菌的生長(zhǎng)[29]。

4.2 在乳制品中的應(yīng)用

Nisin作為防腐劑在乳制品中的應(yīng)用十分廣泛。乳制品經(jīng)過(guò)巴氏殺菌后冷藏仍有致病菌存活，加工奶酪仍然存在被單核細(xì)胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌污染的風(fēng)險(xiǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，添加Nisin可以有效抑制奶酪中李斯特菌、金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)[30-31]。

研究者們?cè)絹?lái)越多地通過(guò)將2種或更多種抗菌藥物組合使用增強(qiáng)對(duì)病原體的抗菌作用，拓展抗菌譜，同時(shí)可降低各種抗菌劑的濃度[4]。MARA等[3]研究了Nisin和有機(jī)酸鹽聯(lián)用對(duì)硬質(zhì)奶酪中李斯特菌的抑制作用，發(fā)現(xiàn)Nisin與山梨酸鉀、丙酸鈣和乳酸鈉具有協(xié)同抗菌作用。同時(shí)，添加乳桿菌素AL705后顯著提高了二元混合物的抗菌能力，這是首次在乳制品中使用含乳桿菌素的三元混合物來(lái)有效抑制李斯特菌的生長(zhǎng)。

4.3 在酒精飲料中的應(yīng)用

在啤酒釀造過(guò)程中很容易受到革蘭氏陽(yáng)性菌侵染，Nisin可以廣泛抑制啤酒中存在的革蘭氏陽(yáng)性菌，同時(shí)不會(huì)影響酵母的活性。研究發(fā)現(xiàn)添加Nisin可以延長(zhǎng)啤酒、葡萄酒等酒精飲品的貨架期[32]。

殼聚糖納米顆粒在食品工業(yè)中常用作食品防腐劑，也可以用作遞送載體。LEE等[33]研究發(fā)現(xiàn)載有Nisin的殼聚糖納米顆粒對(duì)橙汁中食源性病原體的體外抗菌活性更高，包埋Nisin的殼聚糖納米顆粒在食品的抗菌保鮮中具有良好的應(yīng)用前景。

5 Nisin在醫(yī)藥行業(yè)的應(yīng)用

目前，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)Nisin有潛力應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)，有利于解決抗生素耐藥性問(wèn)題，符合未來(lái)醫(yī)藥行業(yè)的發(fā)展要求。已發(fā)現(xiàn)Nisin具有抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)、治療腹瀉、口腔保健及免疫調(diào)節(jié)等潛力。

5.1 抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)

細(xì)菌素作為抗癌新型治療劑是一種非常有前途的治療方法。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)Nisin作用于神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞時(shí)，導(dǎo)致細(xì)胞膜的流動(dòng)性增強(qiáng)和偶極電位降低，進(jìn)而抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[8]。KAMARAJAN等[34]研究發(fā)現(xiàn)了Nisin可作為治療頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC)的新型潛在治療藥物。Nisin利用其陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)一種促凋亡調(diào)節(jié)因子的蛋白同系物1(cation transport regulator homolog 1，CHAC1)，同時(shí)伴隨細(xì)胞外鈣流入對(duì)HNSCC發(fā)揮作用，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期停滯，減少HNSCC中的細(xì)胞增殖。

此外，Nisin對(duì)肝臟癌、胃腸道癌、乳腺癌以及皮膚癌細(xì)胞等均有毒性作用。在Nisin濃度高于IC50處理后觀察到細(xì)胞活力降低，并出現(xiàn)細(xì)胞收縮、細(xì)胞質(zhì)空泡化、細(xì)胞核收縮及細(xì)胞脫離現(xiàn)象，一定濃度下會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[35-37]。表1總結(jié)了近年來(lái)報(bào)道的各種癌細(xì)胞系用Nisin處理24 h后 IC50值。多種藥物聯(lián)合使用治療癌癥是臨床常采用的治療方法，與單一藥物治療相比，可以獲得更好的治療效果同時(shí)減小副作用和耐藥性。研究發(fā)現(xiàn)Nisin與DOX聯(lián)合使用具有協(xié)同抗癌作用，當(dāng)添加2 μg/mL的Nisin時(shí)，DOX的IC50值減半[9]，降低達(dá)到顯著抗癌作用所需的最低DOX化療劑量，從而降低其相關(guān)副作用。由于Nisin在消化系統(tǒng)中可被蛋白酶分解，研究人員開(kāi)發(fā)了利用納米顆粒材料控制Nisin的釋放和遞送技術(shù)[37-38]。GOUDARZI等[38]研究發(fā)現(xiàn)載有Nisin的聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸納米顆粒對(duì)AGS，KYSE-30，HepG2和K562癌細(xì)胞系的細(xì)胞毒性大于游離Nisin。這是第一個(gè)報(bào)道的Nisin及其包裹形式對(duì)胃腸道、肝和血液癌細(xì)胞系的細(xì)胞毒性作用的研究。

表1 癌細(xì)胞用Nisin處理24 h后 IC50值

5.2 治療腹瀉

艱難梭菌是抗生素相關(guān)性腹瀉和假膜性結(jié)腸炎患者中最常發(fā)現(xiàn)的引起腸道感染的病原體。甲硝唑和萬(wàn)古霉素是治療艱難梭菌相關(guān)性腹瀉(Clostridiumdifficileassociated diarrhea，CDAD)比較有效的方法，但由于具有多重耐藥性的艱難梭菌的出現(xiàn)，抗生素治療失敗和感染復(fù)發(fā)的人數(shù)正在逐年增加，迫切需要開(kāi)發(fā)新的抗菌藥物。研究人員模擬人類(lèi)的結(jié)腸模型，發(fā)現(xiàn)Nisin生產(chǎn)菌株乳酸乳球菌UL719能夠在人結(jié)腸模型中存活和增殖，Nisin濃度為76 μmol/L(MIC的20倍)時(shí)可有效殺死艱難梭菌病原體[40]。BARTOLONI等[41]從醫(yī)院中患有CDAD的受試者收集了60種艱難梭菌菌株，測(cè)試甲硝唑、萬(wàn)古霉素和Nisin對(duì)產(chǎn)毒菌株的體外活性，發(fā)現(xiàn)Nisin相對(duì)于甲硝唑、萬(wàn)古霉素對(duì)艱難梭菌具有更強(qiáng)的殺菌作用，并且它對(duì)腸道其他菌群的抑制作用相對(duì)較小。Nisin可能是治療CDAD的有前途的抗菌藥物。

豬斷奶后腹瀉(post-weaning diarrhea，PWD)給全球養(yǎng)豬行業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，它通常是由豬腸道產(chǎn)腸毒素的大腸桿菌的增殖引起的。目前的控制策略通常是使用多粘菌素，大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)和氟喹諾酮類(lèi)抗生素。研究發(fā)現(xiàn)Nisin、腸球菌素DD14細(xì)菌素和多粘菌素的組合使用可提高藥物對(duì)豬源大腸桿菌的抗菌活性[42]，這種組合對(duì)多粘菌素抗性表型的豬源大腸桿菌浮游菌也是有效的。該項(xiàng)研究表明可以通過(guò)細(xì)菌素與多粘菌素組合使用來(lái)減少抗生素所需的有效劑量，以此阻止或延緩抗性的出現(xiàn)。此外，F(xiàn)IELD等[43]也研究發(fā)現(xiàn)Nisin、EDTA和肉桂醛等聯(lián)合使用治療PWD比單獨(dú)使用任一種抗菌劑具有更高的抗大腸桿菌活性。以上研究為治療PWD提供了新的思路。

5.3 口腔保健

口腔內(nèi)含有的微生物共同構(gòu)成了一個(gè)復(fù)雜的微生態(tài)環(huán)境。齲齒和牙周炎是2種最常見(jiàn)的口腔疾病，與口腔微生物菌群密切相關(guān)。齲齒是一種由致齲微生物如乳桿菌，鏈球菌，放線菌等引起的慢性傳染病，口腔致齲微生物主要是革蘭氏陽(yáng)性菌，因此，Nisin被認(rèn)為是預(yù)防和治療齲齒的合適的抗菌劑。體外研究發(fā)現(xiàn)Nisin在齲齒發(fā)展的早期、中期和晚期對(duì)9種常見(jiàn)致齲微生物具有抗菌活性[44]。變異鏈球菌、沙門(mén)氏菌和嗜酸乳桿菌等致齲菌代謝糖類(lèi)產(chǎn)生酸性物質(zhì)，使牙菌斑保持在低pH。Nisin在低pH下具有高抗菌活性和穩(wěn)定性，同時(shí)低毒無(wú)臭、無(wú)色無(wú)味，唾液中的成分不影響其抗菌活性，因此，Nisin被認(rèn)為是有效的抗齲劑。

此外，由于Nisin易被蛋白酶水解且自身不易溶解，限制其應(yīng)用范圍，而利用脂質(zhì)體等材料包埋Nisin可提高其抑菌活力。研究發(fā)現(xiàn)載有Nisin的陽(yáng)離子脂質(zhì)體可以對(duì)變形鏈球菌發(fā)揮持續(xù)抗菌作用，并在體外抑制不溶性葡聚糖的合成[45]，改善口腔健康問(wèn)題。同時(shí)，CUNHA等[46]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用瓜耳膠將Nisin局部遞送給藥時(shí)，Nisin對(duì)口腔致病的腸球菌的抗菌活性提高了52.2%；在牙膏中添加Nisin至100 μg/mL時(shí)，抗菌活性由10%提高到95%。以上研究對(duì)進(jìn)一步評(píng)估Nisin的潛在臨床應(yīng)用至關(guān)重要。

5.4 免疫調(diào)節(jié)

宿主防御肽(host-defence peptides，HDPs)在生物體的先天免疫應(yīng)答中起著至關(guān)重要的作用。Nisin和HDPs都是兩親性陽(yáng)離子抗菌肽，具有相似的理化特性，因此可能也具有HDPs相關(guān)的免疫調(diào)節(jié)特性[47]。研究發(fā)現(xiàn)Nisin能夠通過(guò)誘導(dǎo)趨化因子合成和抑制細(xì)菌脂多糖誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子來(lái)調(diào)節(jié)先天免疫應(yīng)答[48]。JOANNA等[49]研究了添加Nisin對(duì)豬外周血白細(xì)胞的體外免疫作用，發(fā)現(xiàn)Nisin質(zhì)量濃度為50 μg/mL時(shí)，刺激白細(xì)胞介素(interleukin，IL)的產(chǎn)生，并增加了CD4+CD8+T細(xì)胞的百分比。用大腸桿菌刺激血液吞噬細(xì)胞后，Nisin具有抗增殖活性，并抑制IL-6的合成，降低了細(xì)菌刺激的細(xì)胞炎癥反應(yīng)強(qiáng)度。因此，Nisin可能是潛在的具有附加抗菌特性的免疫調(diào)節(jié)劑。

利用這一特性，Nisin也可以用于治療難愈性傷口。研究發(fā)現(xiàn)Nisin可以增加皮膚細(xì)胞的流動(dòng)性，抑制脂多糖和促炎細(xì)胞因子的作用，促進(jìn)豬皮膚傷口的再上皮化[50]。Nisin的免疫調(diào)節(jié)功能拓展了其在醫(yī)藥行業(yè)的應(yīng)用，該領(lǐng)域值得進(jìn)一步研究。

6 前景與展望

目前，Nisin已在全球50多個(gè)國(guó)家和地區(qū)廣泛使用，作為一種國(guó)際公認(rèn)的安全無(wú)毒的天然防腐劑，需求量持續(xù)增長(zhǎng)，但仍有許多因素限制其廣泛應(yīng)用?，F(xiàn)階段Nisin主要通過(guò)微生物發(fā)酵生產(chǎn)，尚存在發(fā)酵活力低、產(chǎn)量較低及生產(chǎn)成本高等問(wèn)題，因此，在研究應(yīng)用的同時(shí)，應(yīng)該更多地關(guān)注于開(kāi)發(fā)高產(chǎn)Nisin的優(yōu)良工程菌株和優(yōu)化發(fā)酵系統(tǒng)，提高產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本。Nisin作為生物防腐劑和醫(yī)學(xué)治療劑具有巨大的潛力，與其他藥物聯(lián)合使用可以增強(qiáng)對(duì)病原體的抗菌作用，拓展抗菌譜，同時(shí)減少藥物副作用，但添加藥物的最適比例仍有待研究，并且很多研究仍處于在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行理論研究階段，需要進(jìn)行臨床研究以評(píng)估其功效。正常條件下Nisin溶解性和穩(wěn)定性較差，開(kāi)發(fā)Nisin不同變體和形式使其更好應(yīng)用于食品工業(yè)和臨床也是未來(lái)研究的重點(diǎn)。Nisin以它獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)吸引了越來(lái)越多研究者的關(guān)注，具有非常好的發(fā)展前景。