甲基綠雙波長吸收光譜法測定面制食品中甜蜜素

劉艷，龐向東，陳明朗，江虹

(長江師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，重慶,408100)

食品添加劑的作用主要在于增強(qiáng)食品營養(yǎng)價值、改善食品感官性狀、抑制食品中微生物的生長繁殖、防止食品腐敗等[1]。隨著食品毒理學(xué)研究的不斷深入，人們對某些食品添加劑可能產(chǎn)生的慢性毒性、致畸、致突變及致癌等危害有了新的認(rèn)識，這些問題引起了人們的廣泛關(guān)注[1]。目前，國內(nèi)外在使用化學(xué)制品作為食品添加劑時都非常謹(jǐn)慎。甜蜜素是人工合成的增強(qiáng)甜味功能的食品添加劑，在食品業(yè)應(yīng)用廣泛，但過量使用會對人體造成危害[1]。美國和日本明確規(guī)定禁止在食品中添加甜蜜素，而中國、歐盟等國雖然準(zhǔn)許添加，但對使用量作了嚴(yán)格規(guī)定。我國在食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)(GB 2760—2014 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn))中明確規(guī)定，面包和蛋糕中甜蜜素含量不得超過1.6 g/kg，餅干中甜蜜素含量不得超過0.65 g/kg。近年，國內(nèi)外對甜蜜素的檢測方法主要有高效液相色譜法[2-5]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[6-14]、氣相色譜法[15-17]、氣-質(zhì)聯(lián)用法[18]、電化學(xué)法[19-21]及少量分光光度法[22-23]。其中，前4種方法除前處理較麻煩外，日常運(yùn)行費(fèi)用較高；電化學(xué)法需特殊的電極材料，實(shí)驗(yàn)條件要求較為苛刻。分光光度法因所用儀器價格便宜、操作簡便，有較好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，并有較高靈敏度，廣受分析工作者的喜愛。本試驗(yàn)通過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了一種檢測甜蜜素的雙波長可見吸收光譜(dual-wavelength visible absorption spectroscopy, DWO-VIS)技術(shù)，用于面制食品中甜蜜素的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試材料為桃酥餅干(1#)、甜薄脆餅干(2#)、老面包(3#)、無夾心面包(4#)，重慶某超市及面包店。

甲基綠(純度99%)，山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；甜蜜素(純度99.3%)(GBW(E)100066)，中國食品藥品檢定研究院；HCl(分析純)，重慶川東(化工)集團(tuán)有限公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)(分析純)，上海吉至生化科技有限公司；超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

pHS-3C型酸度計(jì)，上海虹益儀器儀表有限公司；EL104型電子天平，上海精密儀器儀表有限公司；U-3010型紫外-可見分光光度計(jì)，日本日立公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 溶液配制

甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取0.020 12 g 甜蜜素對照品于小燒杯中，加50 mL 超純水溶解，攪拌，待溶解完全后，轉(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶中，用超純水定容，配成201.2 mg/L儲備液；取儲備液10.00 mL，用水稀釋至100 mL，配成20.12 mg/L 操作液。

甲基綠溶液：準(zhǔn)確稱取0.458 5 g甲基綠，用水溶解后定容至1 000 mL,配成1.00×10-3mol/L。

Tris-HCl溶液：將0.10 mol/L HCl溶液和0.20 mol/L Tris溶液混合，用酸度計(jì)測定調(diào)配成pH 3.2～9.7的系列溶液。

1.3.2 樣品前處理

取適量1#～4# 面包和餅干，分別粉碎、混勻后，準(zhǔn)確稱取2 g左右(精確至±0.000 1 g)，加50 mL水，于45 ℃ 熱水浴中攪拌、浸提10 min，再45 ℃ 超聲浸提20 min，過濾，濾液用超純水定容至100 mL。

1.3.3 反應(yīng)條件優(yōu)化

1.3.3.1 最適pH值的確定

室溫下，于10 mL 具塞比色管中，加入甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)操作液1.00 mL、甲基綠溶液2.00 mL及不同pH的Tris-HCl溶液1.00 mL，用水定容。以試劑空白作參比，掃描吸收光譜，測定616 nm 和652 nm 處的吸光度(A)，作A-pH 曲線，即可判斷反應(yīng)的最佳pH。同理，在其他條件不變的情況下，考察0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL Tris-HCl溶液在所選定的最佳pH下對吸光度(A)的影響，作A-V最佳pH曲線，即可判斷最佳pH下的最佳用量。

1.3.3.2 甲基綠溶液濃度的測定

室溫下，于10 mL 比色管中加入甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)操作液1.00 mL、所選定的最佳pH及用量的Tris-HCl溶液，再加入不同用量(0.50～4.00 mL)的甲基綠溶液，用水定容。按1.3.3.1中的測定方法測定各溶液的吸光度(A)，作A-c(甲基綠)曲線，即可判斷甲基綠的最佳濃度。

1.3.3.3 試劑加入順序

在上述選定條件不變的情況下，改變甜蜜素、Tris-HCl 及甲基綠的加入順序，按1.3.3.1的方法測定溶液的吸光度(A)，依據(jù)譜圖上測定波長下吸光度值判斷試劑加入順序?qū)Ψ磻?yīng)靈敏度的影響。

1.3.3.4 反應(yīng)時間及締合物的穩(wěn)定性

在上述選定的各項(xiàng)最佳條件下，按1.3.3.1的測定方法測定在5～100 min 內(nèi)各不同時間下的吸光度，作A-t曲線，即可判斷最佳反應(yīng)時間及締合物的穩(wěn)定時間。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確移取甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40 mL 于10 mL 比色管中，加入1.00 mL Tris-HCl(pH 8.84)溶液及2.00 mL 甲基綠溶液，用水定容。20 min后，掃描吸收光譜，根據(jù)吸光度(A)及甜蜜素的質(zhì)量濃度(ρ)即可作A616-ρ、A652-ρ及A616+652-ρ標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 實(shí)際樣品檢測及回收試驗(yàn)

精密移取1.3.2制得的1#～4# 待測液各2.00 mL，代替1.3.4的甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液，并按1.3.4的方法配制溶液，掃描吸收光譜，用靈敏度最高的DWO-VIS(616 nm + 652 nm)法測定吸光度，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線或回歸方程即可求得各待測液及原始樣品中甜蜜素的含量(n=5)。同時做3 種加標(biāo)水平的回收試驗(yàn)(n=5)，根據(jù)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，即可判斷新方法的準(zhǔn)確度和精密度。

2 結(jié)果與討論

2.1 甜蜜素與甲基綠的吸收光譜

從圖1-A可知,以水作參比，2.01 mg/L甜蜜素溶液在可見光區(qū)的吸收信號十分微弱，而2.00×10-5mol/L的甲基綠溶液(pH 8.84)則有很強(qiáng)的吸收信號，最大吸收峰位于628 nm處。從圖1-B可知,以試劑空白為參比，當(dāng)在2.00×10-4mol/L甲基綠溶液(pH 8.84)中加入甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液后，光譜曲線在570～700 nm 范圍內(nèi)出現(xiàn)2個較強(qiáng)的正吸收峰，分別位于616 nm(藍(lán)移12 nm)和652 nm(紅移24 nm)，由此說明，甜蜜素與甲基綠之間發(fā)生反應(yīng)生成了新物質(zhì)，并產(chǎn)生具有2個較強(qiáng)吸收峰的新吸收曲線。在616 nm 和652 nm波長處，隨著甜蜜素濃度的增大，新物質(zhì)的吸光度隨之增大，甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)操作液的用量在0.00～1.40 mL 范圍內(nèi)，服從朗伯-比爾定律。故616 nm 和652 nm 均可選作單波長法的測定波長，對甜蜜素進(jìn)行定量分析。若在616 nm 和652 nm 處用DWO-VIS 法測定甜蜜素，它仍服從朗伯-比爾定律(因吸光度具有加和性)，且可提高方法的靈敏度,DWO-VIS 法的靈敏度約為單波長法的2倍。故實(shí)驗(yàn)選用DWO-VIS法定量分析甜蜜素的含量。

A-甜蜜素溶液與甲基綠溶液;B-不同濃度甜蜜素溶液與甲基綠混合溶液

2.2 反應(yīng)條件的選擇

2.2.1 最適pH值的確定

圖2表明，在616 nm 和652 nm 下，pH<7時，體系的吸光度很低，說明此條件下，甜蜜素與甲基綠基本不反應(yīng)或很少反應(yīng)；在pH>7的條件下，體系的吸光度隨pH值的增大而增大，當(dāng)增大至pH 8.84時，吸光度達(dá)最大，此時反應(yīng)的靈敏度相對最高，該條件適于甜蜜素與甲基綠進(jìn)行反應(yīng)；當(dāng)pH>8.84時，體系的吸光度隨pH值的增大而降低，說明此條件下不適于甜蜜素與甲基綠的完全反應(yīng)?？梢?，無論在616 nm 和652 nm處采用單波長法測定還是采用DWO-VIS法測定，反應(yīng)的最適pH為8.84。繼而考察了選定條件及其他條件不變時，pH 8.84 Tris-HCl溶液用量對吸光度的影響，結(jié)果表明，最適用量為1.00 mL。后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用選定的最佳pH 值及用量。從圖2可知，DWO-VIS法的靈敏度比單波長法高。

圖2 溶液pH對體系吸光度的影響

2.2.2 甲基綠溶液濃度的確定

圖3表明，在616 nm 和652 nm 下，甲基綠溶液用量在0.50～4.00 mL 范圍內(nèi)，開始時，隨著甲基綠濃度的增大，體系的吸光度隨之增大，表明此時甲基綠用量不足，甜蜜素與甲基綠反應(yīng)不完全；當(dāng)甲基綠用量增大到2.00 mL 時，體系吸光度達(dá)最大，此時反應(yīng)的靈敏度最高；之后隨著甲基綠濃度的再增加，體系吸光度隨之下降，說明此時的甲基綠已過量，其自聚作用增強(qiáng)，導(dǎo)致體系的吸光度降低。可見，甲基綠的最適用量為2.00 mL，即最適甲基綠溶液濃度為2.00×10-4mol/L。從圖3可知，DWO-VIS 法的靈敏度比單波長法高。

圖3 甲基綠溶液濃度對體系吸光度的影響

2.2.3 試劑加入順序的選擇

表1表明，在選定的最佳條件下，改變試劑的加入順序，對體系的吸光度基本不影響，即這幾種試劑可以按任何一種順序加入，生成的締合物的吸光度基本一致。后續(xù)實(shí)驗(yàn)按任意順序加入各試劑溶液。

表1 試劑加入順序?qū)w系吸光度的影響

2.2.4 反應(yīng)時間及締合物的穩(wěn)定性

以616 nm 為例，考察室溫下甜蜜素與甲基綠在5～100 min的反應(yīng)時間內(nèi)對締合物吸光度的影響。圖4表明，從反應(yīng)開始到20 min，隨著反應(yīng)時間的增加，體系的吸光度隨之增大，表明在這段時間內(nèi)，甜蜜素與甲基綠的反應(yīng)不完全；20～80 min 時，體系的吸光度達(dá)最大且基本穩(wěn)定，表明甜蜜素與甲基綠的反應(yīng)至少需20 min 才能進(jìn)行完全，生成的締合物的穩(wěn)定時間可達(dá)1 h；80 min 后，隨著反應(yīng)時間的增加，體系的吸光度逐漸降低，表明80 min 后，締合物不再處于穩(wěn)定狀態(tài)。故實(shí)驗(yàn)應(yīng)選在締合物的穩(wěn)定時間段進(jìn)行測定。

圖4 反應(yīng)時間對體系吸光度的影響

2.3 甜蜜素的標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)參數(shù)

按1.3.4的方法配制甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，掃描吸收光譜，作A616-ρ、A652-ρ及A616+652-ρ標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)參數(shù)見表2。由表2可見，DWO-VIS法的靈敏度比單波長法高。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)用DWO-VIS法進(jìn)行測定。

2.4 干擾試驗(yàn)

2.5 樣品分析

精密移取1.3.2制得的1#～4# 待測液各2.00 mL，按1.3.5的方法配制溶液并掃描吸收光譜，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線或回歸方程求出各待測液及原始樣品中甜蜜素的含量(n=5)。各樣品做3種加標(biāo)水平的回收試驗(yàn)(n=5)。從表3可知，本法測定結(jié)果與GB 1886.37—2015法接近，用F 檢驗(yàn)法和t檢驗(yàn)法檢驗(yàn)新方法的測定結(jié)果與國標(biāo)法間有無顯著性差異(置信度P=95%)，結(jié)果表明，新方法的精密度和準(zhǔn)確度均無顯著性差異，由此判斷新方法準(zhǔn)確可靠。

表3 餅干和面包的分析結(jié)果及回收試驗(yàn)(n=5)

3 結(jié)論

本文采用甲基綠作探針測定甜蜜素的DWO-VIS法，此方法簡便、快速、靈敏，并有較高的準(zhǔn)確度(回收率為97.5%～103%)和精密度(相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.4%～2.3%)，當(dāng)置信度為95%時，F(xiàn)檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)(見表3)表明，新方法的精密度及準(zhǔn)確度均無顯著性差異，說明新方法準(zhǔn)確可靠。與國標(biāo)法GB 1886.37—2015《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑 環(huán)己基氨基磺酸鈉(又名甜蜜素)》相比，新方法更環(huán)保、低毒、安全。新方法與已報(bào)道的分光光度法[22-23]相比，程序更簡便、線性范圍更寬、線性關(guān)系更好，靈敏度更高，并有較好的選擇性。該法適于市售餅干及面包中食品添加劑—甜蜜素的批量定量分析。