黃芪多糖的分離、結構表征及益生活性研究

劉衛(wèi)寶，余訊，徐靜靜，詹曉北*，張洪濤，朱莉

1(糖化學與生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122) 3(南京醫(yī)科大學附屬無錫第二醫(yī)院影像科，江蘇 無錫，214002)

腸道微生物在人體中扮演著重要的角色。人體腸道中存在著約100萬億個微生物，超過人體自身細胞的10倍以上[1]。腸道菌群、宿主、外界環(huán)境3者保持著動態(tài)平衡，但一些因素，如飲食、藥物代謝、年齡等發(fā)生改變，就會打破平衡，從而導致一些疾病[2]。因此，腸道微生物的調控越來越引起人們的關注。益生元物質的發(fā)酵利用是調控腸道微生物的有效策略，目前被廣泛認可的益生元有果膠低聚糖、菊粉、低聚半乳糖、低聚葡聚糖等[3]。由于植物多糖來源廣泛，毒副作用小，所以越來越多的植物多糖被研究者開發(fā)為益生元物質[4]。

已有研究表明，許多植物多糖對腸道微生物的生長和代謝具有積極的影響。它們經(jīng)過口腔、胃和小腸，但卻不能被降解，最后到達大腸結腸而被腸道微生物發(fā)酵利用，通過改善腸道菌群結構和增加短鏈脂肪酸[5]等代謝產(chǎn)物促進人體健康[6]。例如，四君子湯多糖可以調節(jié)人腸道中微生物的豐度，其降解產(chǎn)物可以增加乙酸和總酸的含量[7]；桑椹多糖與糞便培養(yǎng)物發(fā)酵48 h后，糞便培養(yǎng)物的pH從7.12降至6.14，并且總SCFA、乙酸、丙酸和丁酸含量都顯著增加[8]。此外，鐵皮石斛多糖[9]、大麥葡聚糖[10]和靈芝多糖[11]等都具有相似的功能。

黃芪(AstragaluspropinquusSchischkin)是我國的一種特色食材、藥材，含有多糖、苷類、氨基酸和黃酮等多種化學成分。其中多糖是重要的有效成分之一。已有研究表明，黃芪多糖具有抗氧化[12]、抗心血管疾病[13]、增強免疫力[14]等多種功效。同時黃芪多糖作為植物多糖，也可能具有一定的益生活性。但對于黃芪多糖益生活性的研究多集中于動物實驗，動物實驗成本高，實驗繁瑣，實驗周期也較長，并且鮮有研究涉及黃芪多糖對腸道微生物的益生作用研究。課題組從黃芪中獲得一種水溶性黃芪粗多糖，并基于人體糞便體外發(fā)酵，利用實驗室建立的模擬人體腸道平臺系統(tǒng)，采用人體糞便體外發(fā)酵來研究人體腸道微生物對黃芪多糖的代謝及益生活性物質分析，為開發(fā)黃芪多糖作為益生元物質提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

黃芪飲片，北京同仁堂(產(chǎn)地：蒙古)；填料DEAE Fast Flow，美國GE公司；木瓜蛋白酶，阿拉??；菊粉，比利時Cosucra公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

3K15 型冷凍高速離心機，美國 Sigma 公司; LC-1200 型高效液相色譜，美國 Agilent 公司; ICS5000離子色譜儀，美國戴安公司；NEXUS傅里葉變換紅外光譜儀，美國尼高力儀器公司；AV-500 MHz全數(shù)字化核磁共振波譜儀，德國布魯克公司；7890A氣相色譜儀，美國Agilent公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 黃芪多糖的分離純化

黃芪飲片在60 ℃烘箱中干燥后粉碎成粉末，石油醚超聲30 min以除去脂類。自然揮干石油醚后采用傳統(tǒng)熱水浸提的方法[經(jīng)試驗得出最佳提取條件為：料液比1∶50(g∶mL)，浸提溫度80 ℃，浸提時間2.5 h]得到糖溶液，濃縮至100 mL后加入5倍體積乙醇醇沉。沉淀復溶于去離子水中，按1.5 g/L的比例加入木瓜蛋白酶，60 ℃水浴2 h后于95 ℃下滅酶30 min。然后用Savage法去蛋白，其中V(氯仿)∶V(正丁醇)=4∶1，V(Savage試劑)∶V(樣液)=5∶1，充分振蕩后離心小心取上清液，重復操作直至中間無蛋白層出現(xiàn)。再次加入5倍體積乙醇醇沉，沉淀依次用丙酮和無水乙醇洗滌2次，復溶于去離子水中，使用截留分子質量為3 500 Da的透析袋，于自來水和去離子水中分別透析2 d，凍干得黃芪粗多糖(Astragaluscrude polysaccharide, APS)。

稱取50 mg APS，溶于10 mL去離子水中，過0.45 μm濾膜后經(jīng)DEAE Fast Flow(80 cm×1.5 cm)離子交換柱純化，用水、0.1、0.2和0.3 mol/L的NaCl依次洗脫，每管收集5 mL洗脫液，并利用苯酚硫酸法測定每管的吸光度(A490),繪制洗脫曲線。收集主要洗脫組分，透析除鹽后凍干得到純化后黃芪多糖(APS-1和APS-2)。

1.3.2 黃芪多糖的總糖和蛋白含量測定

分別利用苯酚硫酸法[15]和考馬斯亮藍G-250法[16]分別測定總糖和蛋白含量。得率按公式(1)計算，總糖和蛋白含量按公式(2)計算：

(1)

式中：m1，提取液中總糖質量或APS-1、APS-2的質量，g；m2，黃芪粉的質量，g。

(2)

式中：m1，測定的APS、APS-1、APS-2中的總糖或蛋白的質量，g；m2，APS、APS-1、APS-2的質量，g。

1.3.3 黃芪多糖的分子質量和單糖組成分析

利用高效凝膠過濾色譜(high perfomance size exclusion chromatography, HPGFC)法測定APS-1和APS-2的分子質量，由葡聚糖標準品(Mw：3.65、21、55.5、123.5和326.6 kDa)得到標準曲線方程。色譜條件如下：LC-1200 型高效液相色譜儀; RID檢測器; Superose12(1.0×30 cm)色譜柱; 流動相0.01 mol/L NaOH; 流速0.5 mL/min; 柱溫30 ℃；進樣量20 μL。

配制單糖混合標準溶液1 mg/mL(鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸)。稱取5 mg APS-1和APS-2，分別加入300 μL 2 mol/L的三氟乙酸，100 ℃下降解12 h，氮氣吹干，加入300 μL甲醇，吹干，重復操作3次以除去三氟乙酸，然后定容至25 mL。使用離子色譜儀(脈沖安培檢測器)進行色譜分析。采用CarboPac PA20色譜柱，進行梯度洗脫，程序如表1所示。

表1 離子色譜的洗脫程序

1.3.4 黃芪多糖的FT-IR分析

取干燥的APS-1和APS-2 1～2 mg，利用KBr壓片的方法[17]，在400～4 000 cm-1內(nèi)進行檢測。

1.3.5 黃芪多糖的1H-NMR分析

取干燥的APS-1和APS-2樣品50 mg溶于0.5 mL D2O中，在AV-500 MHZ核磁共振波譜儀上進行NMR實驗獲得1H譜。

1.3.6 培養(yǎng)基

采用PHAM等[18]的方法，稍作修改，具體配方如下：胰蛋白胨2 g，酵母浸粉2 g，NaCl 0.1 g，K2HPO40.04 g，KH2PO40.04 g，MgSO4·7H2O 0.01 g，CaCl2·6H2O 0.01 g，NaHCO32 g，吐溫-80 2 mL，氯化血紅素0.025 g，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g，膽汁鹽0.5 g，刃天青0.25 g，VK10.002 g(過濾除菌)溶于1 L去離子水中，115℃滅菌20 min。

1.3.7 糞便接種物

新鮮的糞便來自3個健康的志愿者(1男2女)，志愿者均遵循正常飲食(中國飲食)，沒有消化系統(tǒng)疾病，并且至少3個月沒有接受抗生素治療。將糞便樣品收集到無菌小瓶中，糞便樣品按一定比例(根據(jù)DNA含量計算[19])混合后，以1∶10(g∶mL)加入pH 7.3磷酸鹽緩沖液，均質化，并通過4層無菌紗布過濾最終獲得人體糞便接種物[8]。

1.3.8 體外發(fā)酵

實驗組：APS 5 g/L作為唯一碳源(由于APS-1和APS-2的量很少，不足以用于發(fā)酵，并且兩者由黃芪粗多糖得到，所以采用APS來進行體外發(fā)酵實驗也可以代表黃芪多糖)；陰性對照組：不加任何碳源；陽性對照組：5 g/L菊粉作為唯一碳源。并以10%的接種量加入糞便接種物。在37 ℃的厭氧環(huán)境下培養(yǎng)48 h，分別在發(fā)酵0、12、24和48 h時取樣，12 000 r/min離心5 min后，移取發(fā)酵上清液測定pH值，所有樣品在-40 ℃保存用于后續(xù)檢測。

1.3.9 SCFA含量的測定

取發(fā)酵液1 mL，加入10 μL 2-甲基丁酸(1 mol/L)作為內(nèi)標，緩緩加入250 μL濃HCl，混勻，加入1 mL乙醚，渦旋1 min，靜置，待有機相和水相分層。取有機相，加入無水Na2SO4，渦旋，過0.22 μm有機濾膜，取5 μL做氣相。色譜條件如下：儀器，Agilent-7890A；色譜柱，HP-INNOWAX；檢測器溫度250 ℃；進樣口溫度220 ℃；流速1.5 mL/min；分流比1∶20；加熱程序60～190 ℃，4 min；進樣量5 μL。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實驗均重復3次,結果表示為平均值±標準偏差(SD)。采用SPSS軟件進行單因素方差分析(ANOVA)，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 黃芪多糖的分離純化

APS經(jīng)DEAE Fast Flow色譜用水和不同濃度的NaCl洗脫，洗脫曲線見圖1，洗脫后得到2個吸光度值較高的洗脫峰，分別命名為APS-1和APS-2，凍干備用。

圖1 DEAE Fast Flow色譜柱的洗脫曲線

2.2 黃芪多糖的總糖和蛋白含量測定

根據(jù)苯酚硫酸法和考馬斯亮藍G250法分別測得APS、APS-1和APS-2的總糖和蛋白含量。結果如表2所示，APS和APS-2均含有30%左右的蛋白，APS-1則不含有蛋白。

表2 黃芪多糖的得率、總糖和蛋白含量 單位：%

2.3 黃芪多糖的分子質量和單糖組成分析

分子質量和單糖組成的結果顯示，APS主要由鼠李糖、半乳糖和葡萄糖組成，摩爾比為1∶2.62∶21.32。APS-1的分子質量為38.4 kDa，主要由半乳糖和葡萄糖組成，摩爾百分比為1∶49.76。APS-2的分子質量為5.2 kDa，主要由鼠李糖、半乳糖和葡萄糖組成，摩爾百分比為1∶2.99∶16.26。

LI等[20]采用水提醇沉法從甘肅蘭州的黃芪中獲得一種分子質量為36 kDa的水溶性黃芪多糖，其僅由葡萄糖組成。李宏全等[21]應用微波萃取技術從蒙古黃芪中提取了一種新雜聚黃芪多糖，分子質量為10 kDa，單糖組成及分子摩爾比為鼠李糖∶葡萄糖∶半乳糖∶阿拉伯糖=1.19∶72.01∶5.85∶20.95。LIAO等[22]運用熱水浸提的方法從一種蜂蜜加工的黃芪中獲得黃芪多糖(HAPS)，并應用HPGFC和PMP柱前衍生后的超高效液相色譜四極桿飛行時間質譜(UPLC/ESI-Q-TOF-MS)分析了HAPS的相對分子質量為1 695.7 kDa，單糖組成及摩爾比為甘露糖∶葡萄糖∶木糖∶阿拉伯糖∶葡萄糖醛酸∶鼠李糖=0.06∶28.34∶0.58∶0.24∶0.33∶0.21。本研究獲得的APS-1和APS-2分子質量和單糖組成與以往研究存在差異，這可能是提取方法和黃芪產(chǎn)地的不同所導致的。

2.4 黃芪多糖的FT-IR分析

由圖2可知，APS-1在3 420.1 cm-1處的吸收峰屬于—OH的伸縮振動，在2 918.9 cm-1處的吸收峰是由于γ—CH2和C—H的伸縮振動，1 647.4 cm-1的吸收峰歸因于羧基的C—O鍵的振動，1 412.6和1 384.1 cm-1的吸收峰屬于δ—CH2的彎曲振動，1 154.6和1 080.4 cm-1的吸收峰歸因于C—O—C和C—O的伸縮振動，1 019.6 cm-1的吸收峰表明存在吡喃糖環(huán)，931.4和849.5 cm-1的吸收峰屬于α-型糖苷鍵[23]，即APS-1以α-型吡喃糖苷鍵為主。APS-2在3 412.4 cm-1處的寬吸收峰是—OH的特征伸縮振動[24]，在2 925.5 cm-1處的吸收峰是由于γ—CH2和C—H的伸縮振動[25]，1 647.9和1 570.7 cm-1的吸收峰歸因于羧基的C—O鍵的存在[26]，1 418.8和1 384.6 cm-1的吸收峰屬于δ—CH2的彎曲振動[27],1 151.3和1 078.9 cm-1的吸收峰歸因于C—O—C和C—O的伸縮振動，1 026.9 cm-1的吸收峰表明存在吡喃糖環(huán)。另外，896.6和864.3 cm-1處的峰表明APS-2中存在相應的α-D-吡喃糖苷和β-D-吡喃糖苷變形模式[23]。綜上，APS-1以α-型糖苷鍵為主，APS-2同時包含α-型糖苷鍵和β-型糖苷鍵。

圖2 APS-1和APS-2的紅外光譜圖

2.5 黃芪多糖的1H-NMR分析

采用1H-NMR進一步鑒定APS-1和APS-2的糖苷鍵構型,通常δ4.5～5.5 ppm之間為異頭質子(H-1)共振區(qū)，其中α-型吡喃糖1H的化學位移大于5.0 ppm，而小于5.0 ppm則表明為β-型吡喃糖。

圖3-a為APS-1的1H-NMR譜圖，異頭質子H-1區(qū)域共有4個共振峰信號，分別在δ5.40、δ5.22、δ4.96和δ4.65 ppm處出現(xiàn)，表明APS-1中同時存在α-型吡喃糖和β-型吡喃糖，但α-型吡喃糖的比例遠高于β-型吡喃糖。結合APS-1的紅外光譜中未出現(xiàn)β-型吡喃糖的特征吸收峰的結果，表明APS-1主要以α-型糖苷鍵為主。如圖3-b所示，異頭質子H-1的化學位移有大于5.0 ppm，也有小于5.0 ppm，說明APS-2同時包含α-型吡喃糖和β-型吡喃糖，且兩者所占比例相差不大。

a-APS-1的1H譜圖;b-APS-2的1H譜圖

FU等[28]采用沸水浸提法從來自甘肅定西的黃芪中獲得一種分子質量為301 kDa的水溶性黃芪多糖，其單糖組成及摩爾比為鼠李糖∶木糖∶葡萄糖∶半乳糖=1∶4∶5∶1.5，并同時含有α-型糖苷鍵和β-型糖苷鍵。李宏全等[21]分析了一種從蒙古黃芪中獲得的新雜聚黃芪多糖的1H-NMR圖譜，結果表明其主要構型為α-吡喃構型。LIAO等[22]運用1H-NMR分析了一種來自蜂蜜加工的黃芪制劑的黃芪多糖(HAPS)，結果顯示其同時含有α-型糖苷鍵和β-型糖苷鍵，且存在糖醛酸和乙酰基。不同黃芪多糖包含不同的糖苷鍵構型，這也可能是黃芪的產(chǎn)地不同或者提取方法不同所引起的。

2.6 pH和總糖含量的變化

發(fā)酵培養(yǎng)基的pH變化可以反映發(fā)酵過程的產(chǎn)酸量,如圖4所示。

圖4 不同處理組在人體糞便體外發(fā)酵過程中的pH變化

發(fā)酵48 h，陰性對照組的pH從7.52變化到7.07；APS組的pH從7.49降低至5.88(P<0.05)；菊粉(陽性對照)組的pH從7.37降為5.21(P<0.05)。另外，在發(fā)酵的各個時間點APS和菊粉組的pH都較陰性對照組低很多。結果與之前的研究一致，例如添加鐵皮石斛多糖發(fā)酵時觀察到pH明顯降低，發(fā)酵48 h后pH由6.59降為4.70[9]。pH與蘆薈多糖[6]類似，但低于桑椹多糖[8]。

不同處理組在不同發(fā)酵時間點培養(yǎng)基中總糖含量的變化見表4。由表可知，發(fā)酵12h后，APS組中90%以上的總糖已被消耗，由此說明APS可以被人類腸道微生物利用。

表4 不同處理組在人體糞便發(fā)酵過程中的總糖含量變化

注：值為平均值±標準偏差(n=3)。不同時間點數(shù)據(jù)后的不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.7 短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids, SCFA)的產(chǎn)生

腸道微生物可以利用不宜被消化的碳水化合物，并產(chǎn)生有益于人體健康的短鏈脂肪酸(SCFA)。在人體糞便發(fā)酵APS和菊粉(陽性對照)的過程中SCFA濃度的變化見圖5。發(fā)酵48 h后，在APS組中，總SCFA的濃度從(3.85±0.06)mmol/L增加到(73.98±0.08)mmol/L，其中乙酸濃度由(2.96±0.04)mmol/L增加至(43.94±0.02)mmol/L，丙酸由(0.72±0.01)mmol/L增加到(23.74±0.02)mmol/L，丁酸從(0.18±0.01)mmol/L增加到(6.30±0.04)mmol/L。在菊粉組(陽性對照)中，總SCFA的濃度從(3.35±0.04)mmol/L增加至(67.27±0.22)mmol/L，乙酸濃度由(2.43±0.01)mmol/L增至(37.27±0.01)mmol/L，丙酸濃度從(0.71±0.02)mmol/L增至(28.20±0.12)mmol/L，丁酸的濃度從(0.21±0.01)mmol/L增加到(1.80±0.09)mmol/L。在陰性對照組中，總SCFA的濃度從(2.57±0.03)mmol/L增加到(26.32±0.09)mmol/L，乙酸的濃度從(1.87±0.01)mmol/L增至(17.13±0.02)mmol/L,丙酸濃度由(0.49±0.01)mmol/L增加到(5.39±0.03)mmol/L，丁酸濃度從(0.20±0.01)mmol/L增加到(3.79±0.04)mmol/L。由此可知，APS組和菊粉組(陽性對照)中SCFA的產(chǎn)生相比于陰性對照組都顯著增加(P<0.05)。其中，菊粉組(陽性對照)中丙酸的產(chǎn)生高于APS組，但APS組中乙酸和丁酸的產(chǎn)生都高于菊粉組(陽性對照)。結果表明，APS可以在體外被腸道微生物降解利用產(chǎn)生豐富的SCFA，具有較好的益生活性。

乙酸是腸道中重要的脂肪酸，也是評價益生效應的重要指標[29]。如圖5-A所示，APS組中乙酸的產(chǎn)量顯著高于菊粉組(陽性對照)和陰性對照組(P<0.05)，并且是該發(fā)酵過程生成最多的SCFA，發(fā)酵液pH的降低可能主要是由于乙酸的產(chǎn)生。如圖5-D所示,在發(fā)酵48 h后，APS組的總SCFA的產(chǎn)量高于菊粉組，而APS組的pH卻低于菊粉組，這可能是由于發(fā)酵還產(chǎn)生了其他未檢測的酸性物質，如乳酸等。丙酸是一種葡萄糖異生物，能夠抑制肝臟中膽固醇和脂肪酸的合成，進而引起血脂水平下降[30]。并且通過降低乙酸和丙酸的比例能夠降低血脂和一些心血管疾病的產(chǎn)生[6]。由圖5-B可知，APS組中丙酸的產(chǎn)量顯著低于菊粉組(陽性對照)，乙酸和丙酸的比例高于菊粉組(陽性對照)，由此可以推斷，APS的降血脂功能可能低于菊粉。丁酸是結腸上皮細胞的重要底物，并且在細胞增殖和分化的調節(jié)中也起主要作用，還有研究表明丁酸可以促進癌細胞凋亡和強化結腸黏膜各種功能[31-32]。本研究中，如圖5-C所示，APS組丁酸的產(chǎn)量顯著高于菊粉組(陽性對照)(P<0.05)，這在一定程度上表明APS在促進癌細胞凋亡和強化結腸黏膜功能方面可能具有相應的潛力。

圖5 不同處理組在人體糞便發(fā)酵過程中的SCFA濃度變化

3 結論

本研究通過對黃芪粗多糖的分離純化而獲得APS-1和APS-2，并應用HPLC、IC、FT-IR和1H-NMR等結果的分析了解到APS-1主要以α-型糖苷鍵為主，APS-2含有α-型糖苷鍵和β-型糖苷2種構型。然后在體外利用人體糞便發(fā)酵黃芪粗多糖(APS)，結果顯示，APS發(fā)酵降低了培養(yǎng)基的pH，總糖含量隨發(fā)酵時間增加而降低，乙酸、丙酸和丁酸等短鏈脂肪酸的產(chǎn)生顯著增加。推斷APS在體外人體糞便發(fā)酵過程中可以被腸道微生物分解利用，產(chǎn)生豐富的SCFA等代謝產(chǎn)物，有益于人體腸道健康，研究結果表明APS具有較好的益生活性。