小龍蝦蝦殼副產(chǎn)物制備甲殼素的研究進(jìn)展

母運(yùn)龍，張 崟*，張龍翼，柯 歡，郭添榮,2，李 慧

(1成都大學(xué)肉類加工四川省重點實驗室，四川 成都 610106；2.成都市食品藥品檢驗研究院，四川 成都 610000)

小龍蝦，學(xué)名克氏原螯蝦，是一種高蛋白、低脂肪、低膽固醇的營養(yǎng)食品[1]。2018年全國的小龍蝦養(yǎng)殖量達(dá)163.8萬t[2]。小龍蝦可食用部分約占體重的30%，其余的70%主要是副產(chǎn)物蝦頭和蝦殼。消費(fèi)這些小龍蝦會產(chǎn)生小龍蝦副產(chǎn)物114.6萬t，如此多的副產(chǎn)物，如果不能得到有效利用，不僅會帶來環(huán)境污染問題，而且是對生物資源的極大浪費(fèi)。小龍蝦的蝦頭和蝦殼中含有大量的甲殼素，具有良好的回收再利用價值。

甲殼素在食品、化妝品和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有很好的潛在應(yīng)用價值[3]。在食品中，甲殼素可作增稠劑、抗氧化劑和抗菌劑等；在化妝品中，甲殼素和抗氧化成分結(jié)合，可用于防止太陽輻射；在工業(yè)上，甲殼素可用于高強(qiáng)度生物材料。低分子甲殼素對某些特定的腫瘤細(xì)胞或細(xì)菌菌株具有很強(qiáng)的抗菌活性，可作為潛在藥物成分和藥物載體[4]，也可將其制成手術(shù)縫合線或止血材料。為了進(jìn)一步促進(jìn)小龍蝦副產(chǎn)物的綜合利用，本文總結(jié)了近年來國內(nèi)外利用小龍蝦蝦殼制備甲殼素的研究進(jìn)展，以期為小龍蝦消費(fèi)產(chǎn)生的副產(chǎn)物的綜合利用提供參考。

1 小龍蝦產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀

近年來，隨著國民經(jīng)濟(jì)的不斷提高，越來越多的家庭在追求高質(zhì)量的生活方式，同時也更加熱衷于特色小吃食品。在此背景下，小龍蝦以其良好的色澤和獨特的口味，深受全國各地消費(fèi)者的喜愛。由此也引發(fā)了全國范圍內(nèi)小龍蝦養(yǎng)殖量的不斷增加。

我國的小龍蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量自2013年以來逐漸增加，尤其在2016年以后，小龍蝦的養(yǎng)殖量出現(xiàn)快速增長。據(jù)統(tǒng)計測算，2016年經(jīng)濟(jì)總產(chǎn)值1466.10億，其中，養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)值占38.48%、加工業(yè)產(chǎn)值占6.96%、服務(wù)業(yè)產(chǎn)值占54.57%。2018年，我國小龍蝦的產(chǎn)量約為2016年的2倍多，小龍蝦帶來的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)值達(dá)3690億元。由此可見，小龍蝦產(chǎn)業(yè)在地方經(jīng)濟(jì)發(fā)展中起到重要的引擎作用，可以帶動整個一二三產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

2 小龍蝦副產(chǎn)物的利用現(xiàn)狀

鑒于小龍蝦在帶動地方經(jīng)濟(jì)發(fā)展中的重要作用，各地都很重視小龍蝦產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，使小龍蝦的養(yǎng)殖規(guī)模不斷增加。因此，小龍蝦消費(fèi)帶來的副產(chǎn)物綜合利用問題必須得到高度重視。目前，在小龍蝦副產(chǎn)物利用方面，國內(nèi)僅有少部分小龍蝦蝦殼被回收。通常是對蝦殼進(jìn)行漂洗、烘干、粉碎、消毒等處理后，制成蝦殼粉，然后制作成飼料添加物等形式出售[5]。從資源高附加值利用角度來看，利用蝦殼提取甲殼素是更好的選擇。因為甲殼素及其衍生物，可以廣泛應(yīng)用于化學(xué)、醫(yī)療、食品等多個領(lǐng)域。這對大規(guī)模蝦殼副產(chǎn)物的高附加值利用非常有利[6]。目前，國內(nèi)用于提取小龍蝦蝦殼中甲殼素的方法主要有微生物發(fā)酵法、離子液體提取法、酸堿提取法、化學(xué)法和EDTA法等[7]。近年來，國內(nèi)外研究人員對采用這幾種方法制備甲殼素的工藝進(jìn)行的深入研究。

2.1 微生物發(fā)酵法

微生物發(fā)酵法就是利用一些細(xì)菌和真菌發(fā)酵體產(chǎn)生的有機(jī)酸或蛋白酶，來去除蛋白質(zhì)和鈣鹽，從而實現(xiàn)制取甲殼素的目的。李永強(qiáng)[8]在利用凝結(jié)芽孢桿菌和蛋白酶K協(xié)同發(fā)酵蝦殼，得到約93%的蛋白質(zhì)去除率和91%的灰分去除率的甲殼素。張成菲[9]利用研磨粉碎的蝦蟹下腳料，在其中接種5%～10%的混合菌群，培養(yǎng)發(fā)酵后分離得到甲殼素。該方法操作簡單，極大的降低了生產(chǎn)成本，減少了環(huán)境污染，實現(xiàn)了蝦蟹加工下腳料的高值化利用。Rut Aranday-García等[10]利用蝦渣經(jīng)短乳桿菌接種或與寡孢根霉聯(lián)合培通過固態(tài)培養(yǎng)(SSC)獲得甲殼素。Islem Younes等[11]采用Mojavensis a21粗蛋白酶脫除蝦殼中的蛋白，脫蛋白率為88%±5%。Rawia F. Gamal等[12]從土壤中分離出70株細(xì)菌，對其進(jìn)行了蛋白水解酶生產(chǎn)試驗。其中最有效的一種是枯草芽孢桿菌，它被用于從蝦殼廢物中提取甲殼素。在蔗糖濃度(5%)、懸浮物濃度(12.5%)、接種量(10%，含35×108CFU/mL)和發(fā)酵時間(7d)下，脫蛋白率96.0%和脫礦率82.1%。Thirumalai Maruthiah等[13]從海洋沉積物中分離得到嗜鹽耐有機(jī)溶劑蛋白酶(HOSP)的嗜鹽副球菌APCMST-CS5，該菌產(chǎn)生的嗜鹽耐有機(jī)溶劑蛋白酶能有效地去蛋白質(zhì)化(85.64%)，得到蝦殼甲殼素。

Marwa Hamdi等[14]從梭子蟹和對蝦的內(nèi)臟中分離得到酪蛋白粗酶，該酶對青蟹和蝦殼脫有較好的脫蛋白效果，生產(chǎn)甲殼素有較好的效果。在50℃孵育3h后，酶和底物比為5U/mg的蛋白質(zhì)達(dá)到最佳的脫蛋白效率(分別為84.69±0.65%和91.06±1.40%)。Chien Thang Doan等[15]在甲殼素生產(chǎn)過程中，發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶是一種很有潛力的替代品。分離并分析了一種不含甲殼素酶的細(xì)胞外蛋白酶即黑芽孢桿菌TKU046，用于液態(tài)發(fā)酵蝦渣脫蛋白試驗。用該菌對蝦類廢棄物進(jìn)行脫蛋白試驗，發(fā)酵4d后蛋白質(zhì)去除率達(dá)95%。Hongcai Zhang等[16]為了在大規(guī)模深層發(fā)酵條件下制備甲殼素和殼聚糖，采用粘質(zhì)沙雷氏菌B742、植物乳桿菌ATCC 8014和日本根霉M193連續(xù)三步發(fā)酵制備蝦殼粉。同時，對發(fā)酵過程中的關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行了研究，以監(jiān)測發(fā)酵過程中產(chǎn)物的變化。結(jié)果表明，制備的甲殼素和殼聚糖的收率分別為21.35%和13.11%，回收率分別為74.67%和63.42%。所得殼聚糖的脫乙酰度為81.23%，分子質(zhì)量為512.06kDa。用FT-IR和XRD對所得甲殼素進(jìn)行了表征。所建立的微生物發(fā)酵法可用于甲殼素和殼聚糖的工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，同時大大減少了化學(xué)試劑的使用。

幾種微生物發(fā)酵法脫蛋白率的比較見下表1。通過表中的比較，可以看出短乳桿菌和寡孢根霉菌聯(lián)用脫蛋白率最高，可以進(jìn)一步優(yōu)化制得高純度的甲殼素。微生物發(fā)酵法是一種很有發(fā)展?jié)摿Φ奶崛》椒?，?yīng)該繼續(xù)探究發(fā)現(xiàn)更多、更高效的發(fā)酵微生物。

表1 微生物發(fā)酵法使用酶或菌的種類及脫蛋白率

2.2 離子液體提取法

離子液體具有高溶解性，Qin Y等[17-18]首次提出了運(yùn)用離子液體(IL)1-乙基-3-甲基咪唑乙酸鹽提取甲殼素的方法。連海蘭等[19]將處理后的蝦蟹殼粉按一定質(zhì)量比加入到利用氯化膽堿、硫脲制備的低共熔離子液體中，加熱攪拌反應(yīng)一段時間后，以水作為反相溶劑，通過離心、分離、干燥得到甲殼素。該方法具有處理條件溫和，提取工藝簡單，反應(yīng)易于控制的特點，同時低共熔離子液成本低，可回收再利用，減少環(huán)境污染，降低能源消耗。呂興梅等[20]利用蝦蟹殼粉末與季銨鹽離子液體混合、加熱攪拌，通過季銨鹽離子液體將蝦蟹殼中的碳酸鈣和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)溶解去除，而后將蝦蟹殼中不溶于季銨鹽離子液體的甲殼素水洗、冷凍干燥得到純度90±2%的甲殼素成品。呂興梅等[21]又利用低共熔離子液體或其水溶液除去蝦殼粉中碳酸鈣，得到除鈣蝦殼粉。再利用咪唑類離子液體去除蝦殼中的蛋白質(zhì)和色素，得到了高純度白色甲殼素。本發(fā)明所用除鈣和除蛋白離子液體溫和，無腐蝕性，無污染，對甲殼素破壞少，所得產(chǎn)品純度高達(dá)97%±2%。國外的Leta Deressa Tolesa等[22]以[DIPEA][Ac]、[DIPEA][P]和[DMBA][Ac]為溶劑，在較溫和的操作條件下，從蝦殼中提取甲殼素。在110℃下提取24 h，蝦殼飼料的收率可達(dá)14%，在脫乙酰度較高的堿性條件下，提取的甲殼素也成功轉(zhuǎn)化為殼聚糖。呂興梅等[23]再次利用低共熔離子液體或其水溶液除去蝦殼粉中碳酸鈣，得到除鈣蝦殼粉；然后用磷酸酯類離子液體脫去除鈣蝦殼粉中的蛋白質(zhì)，得不溶物，即得純度為72%±8%甲殼素產(chǎn)品。呂興梅等[24]通過利用檸檬酸兩步除鈣法，結(jié)合利用可降解離子液體溶解除鈣蝦蟹殼中的蛋白質(zhì)，使得蝦蟹殼中的甲殼素得以分離，與此同時得到的檸檬酸鈣是食品鈣強(qiáng)化劑，可產(chǎn)生除甲殼素之外的高附加值產(chǎn)品，并且還分離得到了蛋白質(zhì)，實現(xiàn)了廢棄蝦蟹殼的全組分、高值化利用，不產(chǎn)生環(huán)境污染，解決了現(xiàn)有蝦蟹殼制備甲殼素技術(shù)中使用鹽酸除鈣和堿除蛋白造成的環(huán)境問題，具有廣泛的工業(yè)應(yīng)用前景。

幾種離子液體提取法純度或提取率的比較見下表2。通過表中的數(shù)據(jù)比較，可以看出低共熔離子液體和咪唑類離子液體聯(lián)用的提取法得到的純度最高，可以作為高純度甲殼素的一種提取方法；氨基離子液體有著較高的提取率，值得繼續(xù)研究優(yōu)化，以期能夠?qū)崿F(xiàn)工業(yè)生產(chǎn)。

表2 離子液體提取法使用的離子液體種類及純度或提取率

2.3 酸堿提取法

酸堿法主要包括脫礦、脫蛋白和脫色3個步驟，簡單高效，但要消耗大量的酸堿。韓曉梅等[25]以蝦殼為原料，在20伏電壓，先用1%NaCl制備的酸性電解水脫礦物質(zhì)6h后再用堿性電解水脫蛋白質(zhì)6h，得到甲殼素的提取率為19.46%，礦物質(zhì)脫除率為99.64%，蛋白質(zhì)脫除率為97.99%，且節(jié)省鹽酸使用量96.48%。國外的Varun等[26]采用化學(xué)萃取法，從蟹殼廢料中提取甲殼素，產(chǎn)率達(dá)到12.2%。藍(lán)尉冰等[27]采用微波消解輔助法制備甲殼素。制得的甲殼素脫蛋白率70.85%，脫鈣率為91.26%,甲殼素得率為26.34%±0.24%,較大程度上減少了酸堿液的使用量，減少了對環(huán)境的影響程度，但是在一定程度上提高了生產(chǎn)成本，對于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)還需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究。Jie Zhang等[28]提出了一種新的一步無堿法，用鹽酸從蟹殼中制備甲殼素。蟹殼脫鹽在幾分鐘內(nèi)完成，而脫蛋白至少需要180min才能獲得高純度產(chǎn)品。所得的低分子量甲殼素分子量為53～80kDa，純度高達(dá)92%。它具有與商品化甲殼素相同的原始α-同構(gòu)晶體結(jié)構(gòu)。制備條件優(yōu)化為：酸濃度3～5wt%，溫度110℃，時間180～600min，這是一個簡單的無堿制備蟹殼殼低分子量甲殼素的方法。該方法可推廣應(yīng)用于其它甲殼動物的外骨骼，如蝦殼、蛹和昆蟲等。

2.4 EDTA法

根據(jù)pH13時EDTA-Ca的lgk′=lgk的特征，且EDTA的溶解度接近最大[29]的特點可用EDTA來制取甲殼素，在此工藝中EDTA可循環(huán)利用，有效地降低了成本，減少了污染。竇勇等[30]采用EDTA法提取了淡水小龍蝦頭中的甲殼素，試驗表明以13%的EDTA溶液作提取劑，在pH12、反應(yīng)25min、投料比1∶15(g/mL)、30℃的最適條件下，提取率達(dá)24.05%，反應(yīng)前后的脫鈣和脫蛋白率分別達(dá)到了100.0%和98.6%；隨后，在EDTA方法的基礎(chǔ)上，竇勇等[31]又采用了超聲輔助的方法，在功率180W、超聲頻率60kHz、超聲反應(yīng)45min、pH13、EDTA濃度18%、處理溫度30℃、料液比1∶24(g/mL)的最佳條件下，提取灰分含量為0.13%，含氮量為3.51%。孟凡欣等[32]采用了期望函數(shù)和響應(yīng)面法優(yōu)化了EDTA法提取蝦殼中甲殼素的工藝：脫鈣條件pH11，EDTA濃度11%，反應(yīng)時間2h，料液比1∶14(g/mL)，10g蝦殼粉中平均可提出2.57g(干重)甲殼素，相對于未優(yōu)化的工藝提高了20.3%。

2.5 甘油提取法

熱甘油預(yù)處理法能夠快速、高效地從蝦殼中分離甲殼素。廢蝦殼在熱甘油中的預(yù)處理能夠通過脫水和溫度誘導(dǎo)的碎片去除蛋白質(zhì)，形成低分子量水溶性碎片，隨后通過溶于水從殼基質(zhì)中去除。Ramamoorthy等[33]開發(fā)了一種更綠色的方案：用熱甘油預(yù)處理蝦殼，隨后用檸檬酸研磨，能夠在一個步驟中除去蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)。光譜和熱分析表明，此方法制取的甲殼素的質(zhì)量優(yōu)于常規(guī)化學(xué)法。連海蘭等[34]利用過100目以下蝦蟹殼粉，將甘油和鹽酸溶液混合置于反應(yīng)容器中，室溫攪拌均勻后備用；將得到的蝦蟹殼粉與混合溶劑按質(zhì)量比混合，反應(yīng)得到產(chǎn)物；將得到的反應(yīng)產(chǎn)物加入蒸餾水并冷卻，在高速離心機(jī)上按設(shè)定速度、設(shè)定時間離心，反復(fù)水洗到接近中性，將沉淀物烘干后即得到甲殼素。這種方法產(chǎn)品質(zhì)量高；用水量少；能源消耗少；減少廢氣排放量；產(chǎn)品質(zhì)量由優(yōu)于化學(xué)法；熱甘油可回收利用；方法簡單、可擴(kuò)展、可持續(xù)。具有很好的研究前景。

2.6 強(qiáng)化常壓等離子體法

強(qiáng)化常壓等離子體法采用常壓介質(zhì)阻擋放電等離子體對甲殼類廢棄物進(jìn)行預(yù)處理，強(qiáng)化了蛋白質(zhì)的去除。M. Boric等[35]利用DBD等離子體處理過程顯示出高效、快速的蛋白質(zhì)去除能力，對甲殼素生物聚合物沒有顯著影響。此外，基于等離子體的工藝不需要任何溶劑，因此不會形成(固體和液體)廢物。使用相對便宜的氣態(tài)O2/N2混合物，在大氣壓下工作，而不使用任何昂貴的真空組件，可以直接擴(kuò)大這項技術(shù)的規(guī)模。

幾種提取方法的優(yōu)缺點比較見下表3。通過表中的比較，可以看出離子液體提取法、EDTA法和甘油提取法得到質(zhì)量較高的甲殼素，但是短期內(nèi)不適合工業(yè)化生產(chǎn)。微生物發(fā)酵法和強(qiáng)化常壓等離子體法能耗小，成本低，有較好的發(fā)展前景，應(yīng)加快研究進(jìn)程，以期能夠盡快投入工業(yè)化生產(chǎn)。

表 3 甲殼素提取方法優(yōu)缺點比較

3 小龍蝦殼制備甲殼素存在的問題

目前我國部分廢棄小龍蝦蝦殼被應(yīng)用于甲殼素的制備，不僅使廢棄的小龍蝦殼得到了充分的利用，同時還大大地減輕了環(huán)境的污染壓力。但是我國利用小龍蝦殼制備甲殼素的方法還存在一些問題。

(1)絕大多數(shù)都是采用化學(xué)酸堿法 由于傳統(tǒng)的酸堿法會產(chǎn)生大量對環(huán)境造成一定危害的酸堿廢液，而且在使用酸堿液時會破壞溶出的蛋白質(zhì)，會導(dǎo)致一部分副產(chǎn)品被浪費(fèi)。雖然已經(jīng)有部分研究者提出用微波、超聲波等技術(shù)輔助改進(jìn)提取工藝或者嘗試新的酸堿液來減少帶來的損失。但就微波輔助而言，已有的研究未注重在相同的水浴和微波升溫曲線條件下提取甲殼素的質(zhì)量問題，所以得到的結(jié)果與傳統(tǒng)方法提取甲殼素的可比性不大。就提出的無堿制備甲殼素的方法，雖然能夠減少一定量的環(huán)境污染，但是同樣存在提取時間過長和破壞蛋白質(zhì)的問題。

(2)微生物發(fā)酵法有著較好的發(fā)展前景 近年來較多研究者不斷的探索尋找能夠快速高效地把蝦殼制備成甲殼素的菌類，特別是國外對微生物發(fā)酵法十分的重視，已經(jīng)找出了幾種菌類來制備甲殼素。而且目前研究出的粘質(zhì)沙雷氏菌B742、植物乳桿菌ATCC 8014、日本根霉M193和黑芽孢桿菌TKU046都有建立的微生物發(fā)酵法可用于甲殼素和殼聚糖的工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。但還是存在酸和蛋白質(zhì)產(chǎn)量不足的問題。

(3)離子液體提取法最近幾年也被受重視 尤其是國內(nèi)一些學(xué)者開發(fā)出了一系列的離子液體用于甲殼素的提取。最新研發(fā)出的低共熔離子液體和咪唑類離子液體結(jié)合檸檬酸兩步除鈣法使得蝦蟹殼中的甲殼素得以分離，與此同時得到的檸檬酸鈣是食品鈣強(qiáng)化劑，可產(chǎn)生除甲殼素之外的高附加值產(chǎn)品，并且還能分離得到優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，實現(xiàn)對廢棄蝦蟹殼的全組分、高值化利用，變廢為寶，不產(chǎn)生環(huán)境污染，解決了現(xiàn)有蝦蟹殼制備甲殼素技術(shù)中使用鹽酸除鈣和堿除蛋白造成的環(huán)境污染問題，具有廣泛的工業(yè)應(yīng)用前景。但是對于離子液體提取法仍然僅停留在實驗室研發(fā)階段，其工藝參數(shù)與實際生產(chǎn)還有較大的差距。

(4)EDTA法和熱甘油預(yù)處理法 適合長期的大批量生產(chǎn)，尤其熱甘油預(yù)處理法有望成為代替酸堿法成為工業(yè)生產(chǎn)的支柱。

4 結(jié)語

我國是小龍蝦消費(fèi)大國，充分挖掘小龍蝦蝦殼的潛在價值，對于實現(xiàn)小龍蝦副產(chǎn)物充分利用和減緩環(huán)境污染問題有著雙重意義。利用蝦殼制備甲殼素，我們應(yīng)該注重于更加經(jīng)濟(jì)環(huán)保提取工藝的探究，比如微生物發(fā)酵法和離子液體法，但是實驗室研究是微量且精細(xì)化的，與實際的工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)之間存在諸多不同，如果要將已有的實驗研究成果轉(zhuǎn)化為工業(yè)生產(chǎn)，還需要進(jìn)行大量的放大實驗，并在放大實驗的過程中制定產(chǎn)品品控標(biāo)準(zhǔn)，并隨之調(diào)整相應(yīng)的工藝條件。雖然小龍蝦制備甲殼素的研究在近幾年有了一定的進(jìn)步，但還應(yīng)繼續(xù)加大研究力度，使之產(chǎn)業(yè)化，為我國的小龍蝦產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展作出貢獻(xiàn)。